大豆根瘤菌菌株5873 PCR快速檢測方法的建立及應用效果評價

馬鳴超，姜昕，王鵬輝，關大偉，李俊

大豆根瘤菌菌株5873 PCR快速檢測方法的建立及應用效果評價

馬鳴超，姜昕，王鵬輝，關大偉，李俊

中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所，北京 100081

【目的】大豆根瘤菌（）是微生物肥料重要的功能菌種之一，可通過生物固氮為大豆生長提供氮素，實現節本增效，菌株5873作為其典型代表，已廣泛應用于農業生產。篩選并鑒定其特異引物，建立大豆根瘤菌5873菌株水平的快速檢測方法，對微生物肥料生產菌種鑒定、產品質量檢測和功能評價至關重要。【方法】以商業化菌株大豆根瘤菌5873為供試材料，基于其全基因組序列和NCBI數據庫中大豆根瘤菌種內參比菌株相關序列，以及與其高度同源（基因組ANI值大于99.95%）的大豆根瘤菌USDA 6T差異片段，通過多重序列比對，進行特異引物設計和篩選，獲得特異性引物對，并通過對PCR反應條件/體系優化、特異性及靈敏度檢測，建立大豆根瘤菌5873的快速檢測方法。然后，采用盆栽試驗，將大豆根瘤菌5873與其他根瘤菌菌株混合接種于大豆根際，應用上述方法對大豆根瘤菌5873競爭結瘤能力進行評價和方法驗證。【結果】篩選獲得了一組特異引物4-4和Q1（4-4-F 5′-GATAAGGCCACGGGTGAACA-3′/4-4-R 5′-CACTCGATAAGCTCCGCTGT-3′和Q1-F 5′-CCGGTCGTGACTGGAATGAT-3′/Q1-R 5′-TCGAGGCCTACAAGAACGTC-3′），優化并建立了PCR快速檢測方法，即反應體系：Premix TaqTM12.5 μL，引物各1.0 μL，基因組DNA 15 ng左右，加ddH2O補足至25 μL；反應條件：95℃ 預熱5 min，94℃ 變性45 s，61℃ 退火45 s，72℃ 延伸60 s，30個循環，再72℃ 延伸10 min。通過凝膠電泳檢測目的條帶的有無（355和218 bp），即可實現大豆根瘤菌5873的快速檢測，該方法檢出靈敏度為1 850 CFU/μL。此外，借助該方法可以成功地評價大豆根瘤菌5873競爭結瘤能力，與傳統BOX-PCR評價結果一致。【結論】大豆根瘤菌5873快速鑒定方法的建立實現了以菌體發酵液或根瘤破碎提取液為模板，直接進行PCR擴增的鑒定操作，省去了根瘤的分離、根瘤菌分離純化、培養、DNA提取及測序鑒定等繁瑣的環節，大大減少了工作量，只需短短幾個小時便可準確檢測大豆根瘤菌5873，為微生物肥料中根瘤菌菌劑的產品質量檢測和競爭結瘤能力評價提供了參考。

大豆根瘤菌；特異引物；PCR擴增；競爭結瘤

0 引言

【研究意義】隨著國家在農業戰略上的調整，發展資源節約型、環境友好型的“兩型農業”成為現代農業可持續發展的必由之路[1]。其中，包括根瘤菌在內的微生物肥料作為綠色新型投入品和優先發展的生物制品，在減肥減藥、節本增效、提高作物品質等方面表現突出[2]。大豆根瘤菌（）可與大豆形成高效的共生固氮體系，有效減少化學氮肥的施用[3-4]，是微生物肥料中重要的功能菌種之一，大豆根瘤菌5873作為其典型代表，目前已在農業農村部登記并廣泛應用于農業生產。篩選并鑒定其特異性引物，建立菌株水平的快速檢測方法，對微生物肥料產品質量檢測、功能評價及菌株知識產權保護具有重要的研究意義和實踐價值。【前人研究進展】目前對于大豆根瘤菌的檢測主要依靠傳統的形態學分析和Biolog等生理生化鑒定[5-6]，基于16S rDNA、、、、、、和基因等保守序列的系統發育學分析等傳統多相分類鑒定[7-13]，以及新發展起來的全基因組測序[14]、平均核苷酸一致性（ANI）比較[15]、多位點序列分析（MLSA）法[16]、BOX-PCR指紋圖譜分析[17]等技術，其結果通常可實現種水平、菌株水平上的鑒別[14-19]，但由于操作步驟多、時間長，難以廣泛地實施推廣。以慢生大豆根瘤菌為例，包括在國內外廣泛商業化應用的菌株大豆根瘤菌USDA 110T[20]（后改為有效慢生根瘤菌[21]）和國內外研究較為常見模式菌株大豆根瘤菌USDA 6T[15,22-23]在內，均未建立菌株水平的快速檢測技術。此外，在全基因組水平上，大豆根瘤菌5873和USDA 6T的基因組ANI值等于99.95%，前者與后者相比缺失了一段51 bp的序列，另外，兩個菌株間還有3個SNP位點差異，常規技術手段很難區分。在應用層面上，土壤中存在大量競爭結瘤能力強而固氮能力弱的土著根瘤菌群，這直接影響到接種根瘤菌劑的占瘤率，導致其接種效果不理想[24-25]。目前，BOX-PCR被廣泛地應用于根瘤菌占瘤率的測定[26-27]，但在操作中需要根瘤菌分離純化培養、DNA提取及需要結合基因測序鑒定等繁瑣環節，費時費力，且試驗結果重復性差，實驗室間結果很難重現。【本研究切入點】鑒于以上問題，亟需建立菌株快速檢測和評價技術。因此，本研究選用自主研發且已商業化的大豆根瘤菌5873為供試材料，設計特異性引物，建立PCR快速檢測方法。【擬解決的關鍵問題】在特異性引物設計上，除考慮大豆根瘤菌5873全基因組序列和NCBI數據庫大豆根瘤菌參比菌株相關序列外，重點分析與其高度同源的大豆根瘤菌USDA 6T差異片段，設計引物，優化PCR反應條件/體系，并進行特異性及靈敏度檢測，實現大豆根瘤菌菌株水平上的快速檢測，為微生物肥料中根瘤菌的檢測和競爭結瘤能力評價提供技術支撐。

1 材料與方法

試驗于2020—2021年在中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所完成。

1.1 供試菌株

選用商業化菌株大豆根瘤菌5873為供試菌株，以實驗室保藏的42株慢生根瘤菌屬、2株中華根瘤菌屬和1株根瘤菌屬的菌株為參比菌株（含模式菌株），結合NCBI數據庫中大豆根瘤菌相關序列，進行引物設計和特異性驗證。供試菌株及編號見表1。

表1 供試菌株

1.2 主要試劑和儀器

TIANamp Bacteria DNA Kit（天根生化科技北京有限公司）；Fast-T1化學感受態細胞、5 minTMTA/ Blunt-Zero Cloning Kit、Fast Pure Gel DNA Extraction Mini Kit、Fast Pure Plasmid Mini Kit等均購自南京諾唯贊生物科技公司；裂解液配制[28]（20 mmol·L-1Tris（pH 8.0）、25 mmol·L-1NaCl、2.5 mmoL·L-1EDTA、0.05% SDS、5% chelex-100）；Premix Taq（TaKaRa公司）；YMA液體培養基（甘露醇10 g、七水合硫酸鎂0.2 g、氯化鈉0.1 g、磷酸二氫鉀0.5 g、酵母膏0.5 g，定容至1 L，pH 6.8—7.2）；C1000 PCR儀、凝膠成像系統（Bio-Rad公司）；DYY-8C電泳儀（北京市六一儀器廠）；NanoDropND-2000C微量紫外分光光度計（Thermo）。

1.3 菌株DNA提取與純度檢測

挑取培養好的單菌落，采用TIANamp Bacteria DNA Kit提取菌株DNA，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，并用NanoDropND-2000C微量紫外分光光度計檢測其濃度。

1.4 特異引物設計和篩選

大豆根瘤菌5873基因組總長度為9 160 134 bp（登錄號：WWEZ00000000），選取其中scf-1序列（總長度為1 442 588 bp），初步分割成721個2 kb的片段，在GenBank數據庫進行序列比對，找出同源性較低的特異序列。在NCBI數據庫中，將特異序列進行primer-BLAST，綜合考慮引物長度、GC含量、是否產生二聚體及發夾結構等原則，引物設計選擇默認值設定為20 bp，GC含量選擇為40%—60%，兩引物之間不存在互補結構，進行特異性引物設計，然后從16個同源性較低的2 kb的片段中，選擇較好的20對引物進行PCR驗證。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

分別提取大豆根瘤菌5873和上述參比菌株DNA，進行PCR擴增，產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，以篩選具有特異性的引物，同時以無菌水為陰性對照。

1.5 PCR擴增優化及方法建立

1.5.1 PCR體系/反應條件的建立與優化 以大豆根瘤菌5873基因組DNA為模板，進行PCR擴增。通過優化退火溫度（54—61℃）、模板DNA量（3—51 ng）、引物添加量（濃度為10 μmol·L-1，0.5—2.0 μL）等建立最適PCR反應條件/體系。

1.5.2 菌落PCR擴增 菌株用YMA液體培養基于30℃，180 r/min培養5 d。取2 μL作為模板，以最優化的PCR條件進行菌落PCR驗證。

1.5.3 靈敏度檢測 將大豆根瘤菌5873接種于YMA培養基，180 r/min，30℃，培養5 d，用無菌水對上述培養液進行系列梯度稀釋。分別取2 μL為模板，進行最優條件的菌落PCR反應。并將稀釋倍數為105、106和107的菌液涂布于添加瓊脂的YMA培養基平板上進行菌落計數。每個稀釋梯度做3個平行。

1.5.4 目的條帶驗證 以大豆根瘤菌5873 DNA為模板，以最優PCR反應條件進行PCR擴增，PCR產物經試劑盒純化后，與pCE2載體連接，轉化，培養后，隨機挑取陽性克隆，送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.6 方法驗證及評價應用

1.6.1 菌劑制備及盆栽試驗 將供試菌株大豆根瘤菌5873、實驗室保存的菌株大豆根瘤菌5841、5821、5136、5119、5665和商業化菌株有效慢生根瘤菌USDA 110T，分別進行液體發酵培養。然后，將大豆根瘤菌5873分別與其他6株菌兩兩等體積混合后作為復合菌劑待用。

選擇大小相近的大豆種子，在95%的酒精中浸泡1 min，用5%次氯酸鈉滅菌5 min，然后用無菌水清洗5—6次。分別將每株菌的發酵液與保護劑共同包衣在滅菌的大豆種子表面，播種在盛有滅菌蛭石的塑料盆（9.5 cm×10 cm）中，作為陽性對照；把兩兩混合后的復合菌劑與保護劑共同包衣后播種，作為處理組。將植株置于光照培養箱中，光照10 h、28℃，黑暗14 h、25℃。出苗后每盆留苗3棵，并以不接種為陰性對照。每個處理設3個重復，培養40 d后測定大豆根瘤數量及大豆根瘤菌5873占瘤率。

1.6.2 占瘤率測定 分別用本研究建立的PCR快速檢測技術及傳統BOX-PCR兩種方法測定大豆根瘤菌5873占瘤率。測定時，將大豆根部置于自來水中沖洗干凈，把根瘤浸泡于蒸餾水中重復3—4次，然后，將清洗的根瘤蘸取95%的酒精，用火焰進行灼燒。挑取充分滅菌的根瘤，放置于1.5 mL的EP管中，加入200 μL的裂解液，用滅菌的竹簽將根瘤破碎。破碎的液體置于振蕩儀上充分混合，置于沸水浴中5 min，在-20℃進行冰凍。取2.0 μL凍融的樣品作模板，進行上述特異PCR擴增和BOX-PCR擴增[22]，將產物電泳后統計條帶，計算大豆根瘤菌5873占瘤率。

2 結果

2.1 特異引物設計及篩選

2.1.1 基因組序列比對及特異引物設計 通過對大豆根瘤菌5873和USDA 6T的基因組比較發現（圖1），大豆根瘤菌5873基因組缺失了51 bp序列，經測序和比對，該缺失序列參與編碼YcjX家族蛋白基因。因此，特異引物設計采用如下策略，即在NCBI數據庫中進行大豆根瘤菌參比菌株序列比對，找到大豆根瘤菌5873的特異序列進行引物設計，保證其與除大豆根瘤菌USDA 6T之外的菌株有較好的特異性。其次，通過缺失段序列，設計特異性引物，以區分5873與USDA 6T。引物設計示意圖見圖2，引物部分結果如表2所示。

圖1 菌株的序列差異比較

表2 大豆根瘤菌5873的特異序列引物設計結果

圖2 引物設計示意圖

2.1.2 特異引物篩選 以大豆根瘤菌5873和上述參比菌株DNA為模板，分別將設計的20對特異性引物進行PCR擴增，供試引物中只有4-4與5873、USDA 6T產生355 bp擴增條帶（圖3-A、3-B），表明4-4引物擴增的序列與菌株USDA 6T具有高度的同源性，與其他菌株不同源或同源性很低，使用該引物可以將5873和USDA 6T從其他菌株中區分出來。

為進一步區分，利用引物4-4、Q1及上述兩對混合引物，同時擴增高度同源的5873和USDA 6T，以有效慢生根瘤菌USDA 110T為對照，結果如圖4所示，使用引物4-4時，僅5873和USDA 6T可擴增出355 bp左右的條帶；使用引物Q1時，5873可擴增出長度為218 bp左右的條帶，而USDA 6T和有效慢生根瘤菌USDA 110T均擴增出269 bp左右的條帶。因此，引物4-4和Q1復合使用，可通過檢測目的條帶的有無（355和218 bp），實現大豆根瘤菌5873的快速檢測。

A: M: 2-Log ladder marker. 1: B. japonicum 5873; 2: B. japonicum 5841; 3: B. elkanii 5136; 4: B. diazoefficiens 5119; 5-17: B. japonicum 5821, 5129, 4892, 5452, 5599, 5016, 5437, 4129, 4470, 4530, 4438, 5547, 5248; 18: S. fredii 4475; 19: R. alamii 4370; 20-24: B. japonicum 5876, 4784, 5528, 5412, 5260. B: M: 2-Log ladder marker. 1: B. japonicum 5873; 25: B. diazoefficiens USDA 110T; 26: B. japonicum 5665; 27: S. fredii USDA 205T; 28-33: B. japonicum 5588, 4503, 5039, 4248, 5240, 5190; 34-35: B. elkanii 5109, 5161; 36-45: B. japonicum 5742, 4855, 4794, 4291, 4698, 5128, 4770, 4296, 4207, 4543; 46: B. japonicum USDA 6T

1—3：引物為4-4 The primer is 4-4；4—6：引物為Q1 The primer is Q1；7—9：4-4與Q1混合引物The mixed primers of 4-4 and Q1；M：DL1000 ladder marker；1、4、7：B. japonicum 5873；2、5、8：B. japonicum USDA 6T；3、6、9：B. diazoefficiens USDA 110T

2.2 PCR條件/體系優化和驗證

2.2.1 PCR條件的優化 以大豆根瘤菌5873的基因組DNA為模板，建立PCR反應體系并進行優化。結果表明，DNA模板含量為3—51 ng時均有條帶產生，但添加量為15 ng時條帶開始變亮，所以體系模板DNA需15 ng以上（圖5-A）；在引物濃度為10 μmol·L-1時，添加均有產物形成，在添加1.0 μL時條帶較亮，從成本及引物二聚體問題考慮，選擇添加最適引物量為1.0 μL（圖5-B）；退火溫度在54—61℃均有產物形成，但考慮到較高的退火溫度有利于PCR反應的特異性，所以選擇61℃作為最適的退火溫度（圖5-C）。因此，通過優化條件，確定4-4引物PCR反應的最優體系為Premix TaqTM12.5 μL，引物各1.0 μL，基因組DNA 15 ng左右，加ddH2O補足至25 μL。擴增程序如圖5-D。

M：2-Log ladder Marker。A：不同DNA濃度Different concentrations of DNA templates。1—3：3 ng；4—6：15 ng；7—9：27 ng；10—12：51 ng。B：不同引物濃度Different dosages of primers。1—3：0.5 μL；4—6：1.0 μL；7—9：1.5 μL；10—12：2.0 μL，10 μmol·L-1 of each primer。C：不同退火溫度Different annealing temperatures。1—8：54、55、56、57、58、59、60、61℃。D：最適的擴增程序optimized amplification procedure

2.2.2 菌落PCR擴增驗證 以大豆根瘤菌5873菌液為模板，用引物4-4進行菌落PCR擴增，可擴增到355 bp長的特異性片段。由此可以說明，以基因組DNA為模板和以菌懸液為模板均可擴增出目的條帶。因此，所建立的PCR快速檢測方法是可行的。

2.2.3 靈敏度檢測 將大豆根瘤菌5873的菌懸液連續稀釋10倍，以不同稀釋梯度的菌液為模板，以最優PCR體系擴增。結果表明，PCR反應體系含有超過1 850 CFU/μL時能擴增355 bp的特異性條帶。因此，所建立的PCR快速檢測方法的靈敏限度是每微升反應體系達到1 850 CFU以上。

2.2.4 目的條帶驗證 以大豆根瘤菌5873的總DNA為模板，進行特異PCR擴增。將PCR產物純化、連接、轉化、篩選后，進行測序。其結果與大豆根瘤菌5873的特異片段相似性為100%。

2.3 特異PCR快速檢測評價菌株5873競爭結瘤能力

對生長40 d后的對照組大豆根瘤數進行統計，接種菌株5873的根瘤數與其他菌株無顯著差異（＞0.05）。應用上述建立的特異PCR快速鑒定方法和BOX-PCR，對處理組的大豆根瘤進行5873占瘤率的測定，根據電泳條帶計算占瘤率，結果見表3，本研究建立的PCR快速檢測方法和基于BOX-PCR方法測定的大豆根瘤菌5873占瘤率一致，該方法可以成功地評價菌株5873競爭結瘤能力，方法可行。

表3 大豆根瘤菌5873占瘤率

3 討論

3.1 慢生大豆根瘤菌檢測和鑒定技術

慢生根瘤菌屬是大豆種植中應用最為廣泛的菌種，起源于熱帶酸性土壤，被認為是所有根瘤菌的祖先，由于該屬的菌種組成非常復雜，涉及各種類型的生態系統，屬內種的確定與分類系統進展較為緩慢，分類仍然很復雜。此外，由于慢生根瘤菌屬16S rRNA基因的高度保守性，只有極少的物種進行了明確的鑒定[16]。目前對于慢生大豆根瘤菌的檢測和鑒定，主要依靠傳統的形態學分析、Biolog生理生化鑒定、保守基因系統發育學分析、全基因組測序、平均核苷酸一致性比較、BOX-PCR指紋圖譜分析等多相分類技術[7-17]。但根據形態學、生理生化表型等實驗和生物功能特征設計檢測方法很難將近源種準確區分；而基于16SrDNA、、基因等保守序列的系統發育學分析方法只能鑒定到種屬水平[18-19]。本研究建立的特異PCR快速檢測技術是在目標菌株全基因組序列的基礎上，根據菌株特異的堿基序列設計引物，并進行特異PCR擴增。通過目的產物的有無及大小，對目標微生物進行準確檢測或鑒定。該技術具有特異性強、敏感度高、快速靈敏的優點，為微生物肥料根瘤菌等生產菌株的快速檢測提供了重要參考。

3.2 特異引物設計

特異引物的設計是特異PCR技術的關鍵環節，常見的特異引物設計方法包括：針對研究的特定菌株，從GenBank數據庫中獲取較常用的種屬特異基因或功能基因，通過多重序列比對，進而確定引物序列[29-30]。例如，Wu等[31]基于基因序列設計引物，成功地利用特異引物擴增出膠質類芽孢桿菌519 bp的保守序列。而本試驗并沒有局限于特異基因或功能基因，而是通過對大豆根瘤菌5873的全基因組序列與NCBI中已報道的大豆根瘤菌菌株序列進行全面的篩選與比對，從而實現在最大范圍內檢索菌株5873的特異序列，這樣可有效促進特異的非編碼序列被深度挖掘和發現。在設計的20對特異引物中，包含具有功能的編碼基因以及基因間的非編碼序列，本研究篩選的特異引物4-4為非編碼序列。同樣，本課題組王璇等[32]在建立膠質類芽孢桿菌PCR快速檢測方法時，也是基于基因間的一段非編碼序列進行了特異引物設計。由于在物種進化的過程中，大多數的編碼基因具有進化保守性，尤其在與近源種進行比對分析時，其同源性相對較高。因此，在設計種內特異引物時，非編碼序列可作為篩選的重要部分。引物設計時，其引物的長度一般為18—30 bp，考慮到引物太短會提高錯配率，導致引物缺乏特異性，而引物過長會導致其延伸溫度過高，進而影響聚合酶的工作效率等原因，引物設計選擇默認值20 bp。引物序列的GC含量選擇為40%—60%，過高或過低都會影響PCR反應的發生。此外，為避免產生二聚體及發夾結構，兩引物之間不能存在互補結構，否則會降低引物的有效濃度。根據以上過程及原則，從16個同源性較低的2 kb的片段中，選擇較好的20對引物進行PCR驗證，建立快速檢測方法。

3.3 特異PCR方法的建立

雖然特異PCR技術鑒別大豆根瘤菌菌株的效果明顯，但在建立PCR技術時，只是盡可能多的對與其相關的菌株進行特異性驗證。為提高特異PCR的準確性，特異性驗證時，應盡量多地選取近緣菌種作為參比菌株。本研究中，采用軟件OrthoANIu（https://www. ezbiocloud.net/tools/ani）進行ANI計算發現，大豆根瘤菌5873的全基因組序列與模式菌株大豆根瘤菌USDA 6T的ANI值為99.95%，上述兩株菌親緣關系很近[33]。引物4-4基本可以區分大部分的菌株，但遇到與其全基因組極其相近的菌株，還需通過全基因組序列比對等手段，找到其差異并將其區分。如通過上述兩株菌的全基因組比較發現了51 bp特異性缺失序列，通過這段序列，設計了一段引物，以區分5873與USDA 6T。后續的驗證中，使用引物Q1擴增分別得到長度為218和269 bp的擴增條帶，正是缺失片段所致。此外，通過靈敏度試驗，確定所建立特異PCR反應的靈敏度為1 850 CFU/μL，與其他學者[31-32]特異PCR的檢測靈敏度相近。本試驗建立的PCR快速檢測體系具有較高的敏感性，在較低濃度DNA或者一定濃度的菌體發酵液或根瘤破碎提取液為模板的體系中，可以方便、快捷檢測大豆根瘤菌5873。

3.4 基于特異PCR技術評價菌株競爭結瘤能力

在應用層面，接種的根瘤菌劑能否在田間得到推廣受諸多因素的影響。其中，與根瘤菌-宿主匹配性及根瘤菌在不同理化性質的土壤適應性相比，根瘤菌的競爭結瘤能力是限制其應用的關鍵因素[34-35]。通常采用占瘤率來評價根瘤菌和宿主的匹配性以及菌株競爭結瘤能力。然而，在測定根瘤菌的占瘤率時，重要的前提是一株根瘤菌侵染形成一個根瘤。在正常情況下，一個根瘤由一個細胞侵染形成所致，由兩個菌株侵染形成的根瘤（即所謂的“雙侵染根瘤”）概率不到千分之一。此外，很多文獻報道在計算根瘤菌占瘤率時，也以一株根瘤菌侵染一個根瘤為前提。傳統方法常借助BOX-PCR指紋圖譜研究接種根瘤菌的占瘤率[24,36]，但需要從根瘤中分離、純化根瘤菌，進而進行DNA提取、PCR擴增等繁瑣的環節，其過程費時費力。本研究建立的特異PCR鑒定技術，大大減少了傳統技術中的繁瑣環節，實現了對大豆根瘤菌5873的競爭結瘤能力快速評價，且與傳統BOX-PCR檢測結果一致。

4 結論

建立了大豆根瘤菌5873菌株的快速檢測方法，利用建立的特異PCR檢測方法可快速、準確評價大豆根瘤菌5873競爭結瘤能力，與傳統BOX-PCR評價結果一致。該方法省去了根瘤的分離、根瘤菌分離純化、DNA提取及測序鑒定等繁瑣的環節，大大提高了工作效率，可為微生物肥料中根瘤菌劑的產品質量檢測、菌種鑒定和功能評價提供參考。

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Rapid identification for5873 by PCR and its evaluation in application

MA MingChao, JIANG Xin, WANG PengHui, GUAN DaWei, LI Jun

Institute of Agricultural Resources and Agricultural Regional Planning, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081

【Objective】is one of the important functional bacteria in microbial fertilizer products. As a commercialized strain,5873 was wildly used in agricultural production and played important roles in symbiotic nitrogen fixation. Therefore, it isnecessary to establish a rapid identification method at the strain level by screening and identifying specific primers for rhizobia, and is of great importance in the aspects of microbial fertilizer product quality inspection, strain identification and function evaluation.【Method】According to the whole genome sequencing of5873 and other strain related sequences from NCBI, as well as the differential fragments ofUSDA 6Twhich is highly homologous to5873 (the ANI value of the genome is greater than 99.95%), specific PCR primers were designed and obtained. After optimization of PCR reaction conditions and the detection of sensitivity and specificity, a rapid detection method for5873 was established. Then, using pot experiment,5873 was mixed with other rhizobium strains and inoculated in the soybean rhizosphere, and the above method was used to evaluate the competitive nodulation ability of5873.【Result】A set of species-specific primers 4-4 and Q1 (4-4-F 5′-GATAAGGCCACGGGTGAACA-3′/4-4-R 5′-CACTCGATAAGCTCCGCTGT-3′ and Q1-F 5′-CCGGTCGTGACTGGAATGAT-3′/Q1-R 5′-TCGAGGCCTACAAGAACGTC -3′), were successfully designed to selectively amplify 355 and 218 bp amplicon from5873. Well specificity was demonstrated by reference strains, from which only the targeted bands of5873 were observed. Amplifications were performed in a 25 μl reaction mixture, which contained Premix TaqTM12.5 μL, template DNA (15 ng of genomic DNA), primers 4-4 and Q1 (1.0 μL, respectively). The PCR cycling consisted of one cycle of 5 min at 95 ℃and 30 cycles of 45 s at 94 ℃, 45 s at 61 ℃, and 60 s at 72 ℃. A final extension step was run for 10 min at 72 ℃. The sensitivity was 1 850 CFU/μL. In addition, the method mentioned above was successfully used to evaluate the competitive nodulation ability of5873, which was consistent with the results of traditional BOX-PCR identification.【Conclusion】The established rapid detection method can directly use the bacterial solution or squeezed nodules as templates, which will eliminate laborious tasks, such as processes of nodule isolation, purification, culture, DNA extraction, sequencing and sequence comparison. It only takes a few hours to accurately detect5873, which provides a reference for product quality detection and competitive nodulation ability evaluation of microbial fertilizers.

; strain-specific primer pair; PCR amplification; competitive nodulation

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.14.010

2022-11-13；

2022-12-21

國家重點研發計劃（2021YFD1700200）、云南省重大科技專項計劃（202202AE090025）、國家現代農業產業技術體系建設專項（CARS-04）

馬鳴超，E-mail：mamingchao@caas.cn。通信作者姜昕，E-mail：jiangxin@caas.cn

（責任編輯 岳梅）