歐亞類禽H1N1豬流感病毒抗原性變異關鍵氨基酸的鑒定與分析

張乃心，許程志，楊玉瑩，張亞萍，萬云飛，喬傳玲，陳化蘭

歐亞類禽H1N1豬流感病毒抗原性變異關鍵氨基酸的鑒定與分析

張乃心，許程志，楊玉瑩，張亞萍，萬云飛，喬傳玲，陳化蘭

中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所/動物疫病防控全國重點實驗室，哈爾濱 150069

【背景】流感病毒的抗原性主要是由病毒的表面糖蛋白HA決定的，前期利用歐亞類禽型H1N1豬流感病毒（EA H1N1 SIV）HA蛋白單克隆抗體（mAb）篩選抗原逃逸株發現，HA蛋白190、230和269位（H3編碼）氨基酸的改變能夠導致病毒發生抗原逃逸，并發現在新近分離的EA H1N1 SIV HA蛋白廣泛存在這3個氨基酸的變異。【目的】進一步探索哪些氨基酸對病毒的抗原性具有關鍵作用，為流感的防控提供科學依據。【方法】選取一株病毒A/swine/Liaoning/SY72/2018（H1N1） SY72為模式病毒，建立該病毒的反向遺傳系統（RGS），又以SY72為骨架，拯救含有HA基因190、230和269單點突變重組病毒；利用rSY72病毒制備滅活疫苗，分別免疫SPF雞和非免疫豬制備其相應的血清，通過中和試驗和血凝抑制（HI）試驗分析病毒的抗原性，確定影響病毒抗原性的關鍵氨基酸位點；繼而評估HA蛋白不同位點氨基酸的改變對病毒復制特性及受體結合特性等的影響。【結果】分析SY72病毒的HA氨基酸序列發現，該病毒HA蛋白分別含有190D、230M和269R。利用反向遺傳技術，分別拯救了病毒rSY72及單點突變病毒rSY72HA/D190N、rSY72HA/M230I和rSY72HA/R269M；中和試驗結果表明，與rSY72相比較，3株突變病毒均能夠與兩株mAbs發生一定反應；HI試驗結果顯示，與rSY72相比較，突變病毒rSY72HA/D190N與rSY72免疫雞血清和豬血清的反應減弱，HI抗體效價分別出現了4倍和8倍的差異，而病毒rSY72HA/M230I和rSY72HA/R269M與兩種血清的反應差異不明顯，表明HA蛋白190位氨基酸改變對病毒的抗原性影響最為明顯；病毒蝕斑測定及復制動力學研究結果發現D190N 的氨基酸替換導致病毒rSY72HA/D190N在MDCK細胞上形成的蝕斑減小，而R269M的氨基酸替換導致病毒rSY72HA/R269M在MDCK細胞上的復制能力下降；3個位點的氨基酸替換均未影響病毒的受體結合特性。【結論】HA蛋白190位氨基酸對EA H1N1 SIV抗原性具有決定作用，269位氨基酸突變使得病毒在MDCK細胞上的復制能力降低。這提示在后續開展的病原學監測中要密切關注這些氨基酸的變異情況，提高對動物流感的預警預報。

豬流感病毒；HA蛋白；抗原性

0 引言

【研究意義】豬作為A型流感病毒感染的重要宿主，一直以來在流感病毒的進化及新型流感病毒的產生過程中扮演著重要角色[1-2]。近年來開展的豬流感（swine influenza，SI）監測結果表明歐亞類禽型H1N1 （Eurasian avian-like H1N1，EA H1N1）豬流感病毒（swine influenza virus，SIV）在豬群中廣泛流行，而且出現了對人的零星感染[3-9]。尤其是2009 /H1N1流感病毒出現以后，它作為流感病毒內部基因的供體，持續地與豬群中早先流行的H1N1、H3N2及H1N2 流感病毒發生新的重組[8,10]。同時，已有研究發現新型重組EA H1N1 SIV存在抗原漂移的現象。這些不斷出現的新毒株給疫苗研制及疫情防控帶來了新挑戰[11-13]。因此，開展流感病毒抗原變異分析，探索其分子基礎，將為EA H1N1 SIV的風險評估和有效防控提供重要的科學依據。【前人研究進展】流感病毒依賴于其持續的抗原性變異不斷突破宿主界限和逃避宿主的免疫保護，抗原漂移和抗原轉變是流感病毒抗原性變異的兩種主要方式[14-16]。流感病毒的各個基因中發生持續性變異的是血凝素（hemagglutinin，HA）基因，其次為神經氨酸酶（neuraminidase，NA）基因[17]。前期研究結果發現HA 158位氨基酸的改變能夠顯著影響EA H1N1 SIV的抗原性[18]。筆者所在實驗室前期利用EA H1N1 SIV A/swine/Henan/11/2005（簡稱HeN11）HA蛋白單克隆抗體（monoclonal antibody，mAb）篩選了兩株抗原逃逸株，HeN11-2B6-P5逃逸株在190和230位同時發生氨基酸改變，HeN11-4C7-P8逃逸株在269位發生氨基酸改變。通過對SIV HA 基因系統的序列分析也發現新近分離的EA H1N1 SIV毒株大多數攜帶HA 190D、230M和269R[13,19]。【本研究切入點】本研究擬借助反向遺傳系統（reverse genetics system，RGS）構建單點突變病毒，并制備相關病毒的免疫血清，利用HI試驗測定病毒的抗原性，進一步分析決定病毒抗原性變異的關鍵氨基酸位點，同時測定HA蛋白相關突變位點對病毒生物學特性的影響。【擬解決的關鍵問題】明確近年來導致我國H1N1 SIV抗原漂移的重要氨基酸突變，確定影響病毒抗原性的關鍵氨基酸位點。研究結果將有助于加深對流感病毒抗原性變異規律的了解，為流感病毒的監測與防控提供重要依據和參考。

1 材料與方法

試驗于2021年5月至2022年7月在中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所動物疫病防控全國重點實驗室完成。

1.1 病毒、抗體、質粒、細胞和實驗動物

一株H1N1亞型SIV A/swine/Liaoning/ SY72/2018（簡稱SY72）為中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所動物疫病防控全國重點實驗室分離、鑒定并保存；兩株HeN11 HA蛋白的mAbs（2B6和4C7）為該試驗室制備和保存[19]；雙向表達質粒pHW2000由美國St. Jude兒童醫院Richard Webby教授惠贈；MDCK細胞和293T細胞均由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所動物疫病防控全國重點實驗室保存；9—11日齡無特定病原體（specific pathogen-free，SPF）雞胚及8周齡SPF雞均購自哈爾濱獸醫研究所實驗動物中心，6周齡非免疫豬（經HI試驗檢測H1和H3亞型SIV抗體陰性）購自哈爾濱市郊農場。

1.2 試劑和試劑盒

TIANamp病毒RNA提取試劑盒、質粒小提試劑盒購自天根生物公司，反轉錄試劑盒購自Invitrogen 公司；PrimeSTAR? Max DNA 聚合酶購自大連寶生物公司；限制性內切酶BsmBⅠ購自NEB公司；同源重組試劑盒Clon Express? II One Step Cloning Kit購自南京諾唯贊生物公司；Gene color II非EB熒光染料購自北京金博益生物公司；膠回收試劑盒購自OMEGA公司；DNA測序試劑購自Applied Biosystems公司；轉染試劑盒LipofectamineTMLTX and Plus Reagent購自Invitrogen公司；培養基Opti-MEM、DMEM購自 Gibco 公司；受體實驗一抗為SY72病毒的雞血清，二抗兔抗雞IgG-HRP 購自Sigma-Aldrich公司；受體破壞酶（receptor destroying enzyme，RDE）購自日本生物科技株式會社。

1.3 病毒拯救

1.3.1 引物設計 依據毒株 SY72序列及文獻[20]分別設計PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M 和 NS 8個基因片段的上、下游擴增引物（引物序列略）。反轉錄引物為 Uni-12 ：5'-AGCRAAAGCAGG-3'，均由吉林庫美生物科技有限公司合成。

1.3.2 病毒SY72反向遺傳系統的建立 重組質粒的構建按照文獻[21-22]的方法進行，獲得重組質粒后通過測序進行鑒定。依據LipofectamineTMLTX and Plus Reagent說明書進行轉染，將8個重組質粒各取250 ng共轉染于混合培養的293T細胞和MDCK細胞。轉染48 h后，收取細胞培養物經尿囊腔接種于SPF雞胚增殖病毒。對救獲病毒進行全基因組序列測定，與野生型病毒基因序列分別進行比對，確定拯救病毒與親本病毒的核苷酸序列完全一致。

1.3.3 SY72單點突變病毒的拯救 針對190、230和269等3個差異位點設計相應的點突變引物（表1），以質粒pHW-SY72 HA為模版，通過PCR分別構建含有HA基因190、230和269等3個單點突變的質粒。將制備的HA突變質粒與病毒其他7個基因的重組質粒各取250 ng共轉染于混合培養的293T和MDCK細胞。轉染48 h后，收取細胞培養物經尿囊腔接種于SPF雞胚增殖病毒。對救獲病毒進行全基因組序列測定，與野生型病毒基因序列分別進行比對，確保所拯救病毒僅HA基因含有目標位點的突變，其他基因片段無突變。將病毒分裝、保存于-80℃，用于后續試驗。

表1 差異位點的點突變引物

1.4 免疫血清的制備

分別將拯救的重組病毒接種10日齡SPF 雞胚，收獲尿囊液，β-丙內酯滅活，佐劑乳化后制備滅活疫苗，接種8周齡SPF雞，0.3 mL/只，免疫后3周，采血分離血清，用于HI試驗，與此同時，將制備的滅活疫苗接種于非免疫豬，2 mL/頭，免疫后2周采血分離血清，血清經RDE處理后用于HI檢測。

1.5 病毒的復制特性測定

將1.3.3中所述各病毒分別以感染復數（multiplicity of infection，MOI）為0.001的病毒量接種于85%鋪滿的MDCK細胞板，37℃孵育1 h后，更換為含有1 μg·mL-1的TPCK-胰酶的DMEM培養基，并于感染后12、24、36和48 h收集上清，將所獲上清于-80℃保存備用。待所有樣品收集完成后，在MDCK細胞中用終點滴定法測定病毒滴度，以平均log10TCID50/mL±標準差表示。

1.6 蝕斑測定

分別將拯救的重組病毒進行10倍倍比稀釋后接種于85%鋪滿的MDCK細胞板，37 ℃孵育1 h后，棄去病毒液，將2×MEM（0.6% BSA, 1 μg·mL-1TPCK-胰酶）與2%低熔點瓊脂糖等體積混合后加入細胞孔中，室溫放置20 min待瓊脂糖完全凝固后，倒置于細胞培養箱中培養72 h，用福爾馬林固定細胞，0.1%結晶紫染色觀察并計數斑塊。

1.7 病毒受體結合特性的測定

1.7.1 病毒蛋白純化 將1.4中所述增殖滅活后的尿囊液進行蔗糖密度梯度離心。首先8 000 r/min、4 ℃高速離心30 min后取上清。其次將上清30 000 r/min、4 ℃超速離心2 h后棄上清取沉淀并用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）溶解。在超速離心管中分別加入20%、40%、60%蔗糖，將上述病毒液緩慢置于頂層。 28 000 r/min、4 ℃超速離心2 h后取40%—60%濃度梯度之間的白色絮狀物。最后加入適量PBS進行脫糖，30 000 r/min 、4 ℃超速離心2 h后棄上清取沉淀，將病毒用適量PBS重新懸浮后測定病毒濃度及效價。

1.7.2 病毒受體結合特性檢測 將SA α-2，3 Gal和SA α-2，6 Gal兩種糖鏈使用PBS稀釋至100 ng，倍比稀釋至第10孔包被于96孔板中，置于紫外下交聯10 min；棄上清，用300 μL冰上預冷的PBS洗滌4遍。用含0.5% BSA的0.05% PBST（PBS中含0.05% Tween 20）稀釋純化的病毒至HA效價為6 HAU，每孔加入100 μL，4℃包被過夜，棄上清，用冰上預冷的0.5% PBST清洗3遍，再用冰上預冷的PBS清洗1遍。加入4%多聚甲醛滅活NA，之后用PBST 清洗3遍，PBS清洗1遍。按照1﹕600的比例稀釋抗rSY72的雞血清作為一抗，每孔100 μL，37℃孵育1 h；棄上清，PBST清洗3遍，PBS清洗1遍。每孔加入100 μL 1﹕1 000 稀釋兔抗雞 IgG-HRP作為二抗，37℃孵育1 h；PBST清洗3遍，PBS清洗1遍。OPD顯色后用0.5 mol·L-1H2SO4終止顯色，490 nm讀取數值。

1.8 數據統計分析

應用GraphPad Prism 8.0軟件對病毒在細胞上的復制滴度及受體結合特性進行統計學分析（Two-way ANOVA法）并作圖。＜0.05表示統計學差異顯著，＜0.01表示差異極顯著。

2 結果

2.1 病毒SY72 HA蛋白氨基酸序列的分析

將病毒SY72 與HeN11 HA基因的序列進行比對，結果發現兩株病毒HA蛋白氨基酸序列共存在16個氨基酸的差異（H3編碼），SY72病毒HA蛋白分別攜帶190D、230M、269R（表2）。

表2 SY72和HeN11病毒 HA 蛋白氨基酸差異位點

2.2 重組病毒的拯救

以SY72病毒為骨架，分別獲得了SY72重組病毒和含有其HA基因190、230和269位單點突變的3株重組病毒，分別命名為rSY72、rSY72HA/D190N、rSY72HA/M230I和rSY72HA/R269M。通過復制動力學和蝕斑試驗驗證了重組病毒rSY72和野生型病毒SY72的部分生物學特性是否一致。結果顯示兩株病毒在MDCK細胞中保持相同復制特性，形成蝕斑的大小和形態類似，兩者部分生物學特性一致（圖1）。

2.3 病毒與mAbs和多克隆血清的反應性

中和試驗結果發現兩株mAbs對rSY72病毒均不具有中和活性。為進一步確定導致病毒抗原性發生變化的關鍵氨基酸位點，測定了3株單點突變病毒與mAbs的反應性。結果rSY72HA/D190N病毒與2B6的反應性明顯提高，中和效價為320；rSY72HA/ R269M病毒與4C7的反應性也有所提升，中和效價為160；rSY72HA/M230I病毒也獲得了一定的反應性。

以rSY72病毒和3株單點突變重組病毒為抗原，利用rSY72病毒制備的雞血清和RDE處理后的豬血清進行HI試驗。結果顯示親本病毒rSY72與血清的HI效價均較高，分別為512、2 560；rSY72HA/D190N病毒與血清進行反應，HI效價分別為128、320，而rSY72HA/M230I病毒和rSY72HA/ R269M病毒與血清進行反應，雞血清的HI效價分別為256和512，豬血清HI效價均為2 560（表3）。

表3 利用兩株mAbs和rSY72的多克隆血清檢測氨基酸突變對病毒抗原變異的影響

*NT, 未檢測 Not tested

2.4 突變氨基酸對病毒復制特性的影響

測定rSY72病毒和3株單點突變重組病毒（rSY72HA/D190N、rSY72HA/M230I和rSY72HA/ R269M）在MDCK細胞中的復制能力。結果發現，與rSY72病毒相比，rSY72HA/R269M病毒在感染MDCK細胞后的36和48 h復制滴度均有所下降（＜0.01、＜0.05），190和230位點的氨基酸改變并未對病毒在各檢測時間點的復制滴度產生明顯影響（圖2）。

2.5 蝕斑測定

對rSY72病毒和3株單點突變重組病毒（rSY72HA/ D190N、rSY72HA/M230I和rSY72HA/R269M）進行蝕斑試驗，測定病毒在MDCK細胞中形成蝕斑的能力。結果與rSY72病毒相比，rSY72HA/D190N病毒形成的蝕斑明顯減小且蝕斑空洞不明顯，rSY72HA/ M230I和rSY72HA/R269M病毒形成的蝕斑經觀察未見明顯變化（圖3）。

*: P＜0.05; **: P＜0.01

2.6 受體結合特性的分析

通過測定rSY72病毒和3株單點突變重組病毒（rSY72HA/D190N、rSY72HA/M230I和rSY72HA/ R269M）的受體結合特性，確定氨基酸改變是否對結合特性產生影響。結果3株單點突變重組病毒與rSY72保持相同的受體結合特性，同時具有對禽型受體SA α-2,3 Gal和人型受體SA α-2,6 Gal的結合（圖4）。

3 討論

3.1 HA蛋白190位氨基酸是決定病毒抗原性的關鍵位點

在本研究團隊前期的研究中，我們利用mAb篩選抗原逃逸株的方法獲得了兩株逃逸株HeN11-2B6-P5和HeN11-4C7-P8，其HA蛋白190、230和269位氨基酸發生了改變。為了進一步確定導致抗原性變異的關鍵氨基酸位點及抗原逃逸發生的機制，本研究選取病毒SY72作為模式毒株通過反向遺傳技術拯救了rSY72重組病毒和3株單點突變重組病毒，在保證rSY72與親本病毒SY72 具有相同生物學特性的前提下進行了后續試驗。

A：rSY72；B：rSY72HA/D190N；C：rSY72HA/M230I；D：rSY72HA/R269M

利用中和試驗和HI試驗分析病毒的抗原性變化，中和試驗結果表明rSY72病毒與兩株mAbs均不具有中和活性，但rSY72HA/D190N病毒與2B6的中和反應性較rSY72增強；HI試驗結果表明，rSY72HA/D190N病毒與rSY72病毒制備的雞血清和豬血清的反應性減弱，HI抗體效價分別出現4倍和8倍的差異。因此rSY72HA/D190N病毒與rSY72病毒具有較大抗原差異，表明190位氨基酸突變對抗原性變異影響較大。

3.2 HA蛋白上突變位點對病毒生物學特性的影響不同

流感病毒的抗原漂移常產生伴隨效應，導致部分生物學特性發生改變[23]。為驗證3個氨基酸改變是否影響抗原表位的部分生物學特性，測定重組病毒在MDCK細胞上的復制能力、蝕斑形態大小和受體結合特性。結果表明rSY72HA/D190N病毒形成的蝕斑明顯減小，因此該位點的改變會使病毒對細胞的毒力產生變化。rSY72HA/R269M病毒在感染該細胞后的36和48 h的復制能力降低，表明其體外復制能力在MDCK細胞的不同感染階段可能減弱。據報道，受體結合位點區域的各種氨基酸突變會影響HA對唾液酸受體的親和力，受體親和力的改變也可能是HA發生抗原性變異的重要原因[24-26]。其中190位點在1918/H1N1、禽H1N1和2009/H1N1病毒的受體結合特性中發揮重要作用[27-30]。在本研究中，我們通過對rSY72及其3株單點突變病毒的受體結合特性測定，發現HA蛋白190、230和269位點氨基酸的改變均沒有對病毒的受體結合特性產生影響。

圖4 病毒的受體結合特性

3.3 抗原性差異分析具有重要公共衛生學意義

由于EA H1N1 SIV可在豬群體內廣泛存在和持續零星的感染人類，又因流感病毒通過改變其HA頭部結構域的氨基酸殘基，不斷逃逸抗體的中和作用，從而誘導抗原漂移[31-34]。因此對HA蛋白的氨基酸突變進行密切監測是必要的，從而預測具有流行潛力的抗原變異位點，保障公共安全。

4 結論

進一步確定了EA H1N1 SIV HA蛋白所發生的3個氨基酸的變異中190位氨基酸的改變對抗原性影響最大，并影響病毒形成蝕斑的能力。269位氨基酸的改變使得病毒在MDCK細胞上的復制滴度有所下降。3個變異位點均未改變病毒的受體結合特性。這也提示在密切關注這些氨基酸位點的變異情況可以更好地防控監測動物流感甚至人流感的大流行。

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Identification of Key Amino Acids in the Antigenic Variation of Eurasian Avian-Like H1N1 Swine Influenza Viruses

ZHANG NaiXin, XU ChengZhi, YANG YuYing, ZHANG YaPing, WAN Yunfei, QIAO ChuanLing, CHEN HuaLan

Harbin Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences/State Key Laboratory of Animal Disease Control and Prevention, Harbin 150069

【Background】The antigenicity of influenza virus is mainly determined by the hemagglutinin (HA), a surface glycoprotein of the virus. Our previous study indicated that amino acid changes at positions 190, 230 and 269 (H3 numbering) of HA protein resulted in antigenic escape by using the monoclonal antibody (mAb) against the HA protein of Eurasian avian-like H1N1 swine influenza virus (EA H1N1 SIV). These three amino acid substitutions widely existed in the HA protein of the recentlyisolated EA H1N1 SIVs. 【Objective】This study aimed to explore which amino acids played a key role in the antigenicity of the virus, and further provide scientific basis for the control of influenza. 【Method】In this study, A/swine /Liaoning /SY72/2018 (H1N1) (SY72) was selected as the model virus, and its reverse genetic system (RGS) was established. Then, using SY72 virus as backbone, three reassortant viruses were rescued by introducing the respective single amino acid mutation at position 190, 230, and 269 into HA protein. Antisera were raised by inoculating the rSY72-inactivated vaccine into specific-pathogen-free (SPF) chickens and non-immunized pigs. The effects of each of these substitutions on viral antigenicity were determined by measuring the neutralization and hemagglutination inhibition (HI) titers with mAbs and polyclonal sera raised against the rSY72 virus. Then their effects on viral replication capacities and receptor binding properties were further evaluated. 【Result】Sequence analysis showed that the HA of SY72 virus carried 190D, 230M, and 269R, respectively. The viruses, including rSY72, rSY72HA/D190N, rSY72HA/M230I, and rSY72HA/R269M, were rescued by RGS. The results of neutralization test showed that all the three mutant viruses could react with two mAbs, to some extent, compared with the rSY72 virus. The HI results indicated that the HI antibody titers of the rSY72HA/D190N reacted with the rSY72–immunized chicken and pig sera were 4- and 8-fold lower than those of the rSY72 virus with the respective sera. However, the rSY72HA/M230I and rSY72HA/R269M virus reacted well with these two sera. The results indicated that residue 190 in the HA had the important effects on the viral antigenicity. Results of the viral plaque assay and growth curve experiments demonstrated that plaque sizes generated by the rSY72HA/D190N virus were smaller than those by the rSY72 virus in MDCK cells. The replication ability of the rSY72HA/R269M virus was significantly decreased in MDCK cells, compared with that of the rSY72 virus. Furthermore, the three amino acid mutations had no impact on the viral receptor-binding preference. 【Conclusion】 The amino acid at position 190 of HA protein played an important role in determining the antigenicity of EA H1N1 SIV. The mutation of amino acid at position 269 reduced the viral replication ability in MDCK cells. These results suggested that more attentions should be paid for monitoring these residue changes in the influenza surveillance, so as to improve early warning of influenza in animals.

swine influenza virus; HA protein; antigenicity

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.14.016

2022-12-06；

2023-02-13

國家自然科學基金面上項目（31872472）

張乃心，Tel：0451-51051684；E-mail：1246665754@qq.com。通信作者喬傳玲，Tel：0451-51051686；E-mail：qiaochuanling@caas.cn

（責任編輯 林鑒非）