通過遺傳轉化Rfo獲得青花菜Ogura CMS恢復系

邢苗苗，許園園，盧昱宇，嚴繼勇，曾愛松

通過遺傳轉化獲得青花菜Ogura CMS恢復系

邢苗苗，許園園，盧昱宇，嚴繼勇，曾愛松

江蘇省農業科學院蔬菜研究所/江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點實驗室，南京 210014

【目的】將來自蘿卜的胞質不育恢復基因導入到青花菜Ogura細胞質雄性不育（cytoplasmic male sterility，CMS）主栽商業品種‘耐寒優秀’（命名為SFB45）中，獲得Ogura CMS恢復系，打破Ogura CMS材料在生產上無法再利用的現狀，為優異種質的創制和改良提供新途徑。【方法】利用基因合成的方法克隆蘿卜的CDS及其啟動子序列，構建表達載體::。通過農桿菌介導的遺傳轉化方法侵染SFB45的具柄子葉和下胚軸，進行再生、抗性苗篩選和PCR鑒定獲得陽性植株，開花期觀察轉基因植株的育性恢復情況；用亞歷山大染液分析對照組及陽性株的花粉活力；分別提取對照組及陽性株＜3 mm和＞3 mm花蕾的RNA并反轉錄成單鏈cDNA，設計特異引物，利用RT-PCR分析及絨氈層和花粉壁發育相關基因在SFB45及對應的育性恢復材料花蕾中的表達差異。【結果】通過遺傳轉化共獲得10個陽性株系，其中8個株系育性得到不同程度的恢復，花粉活力為84.2%—90.4%。RT-PCR分析結果表明，育性恢復植株花蕾中表達，絨氈層發育關鍵調節因子和及花粉壁主要成分孢粉素合成所必需的基因在育性恢復植株＜3 mm花蕾中上調表達。絨氈層降解相關基因、四分體胼胝質壁及花粉外壁發育所必需的基因和在育性恢復植株＞3 mm花蕾中上調表達。分析陽性株系和自交及雜交后代發現轉入的能穩定遺傳，符合孟德爾遺傳。【結論】通過遺傳轉化獲得了優良青花菜Ogura CMS商品種SFB45的育性恢復系，且的轉入使絨氈層及花粉壁發育相關基因恢復正常表達。

青花菜；遺傳轉化；Ogura CMS；；絨氈層和花粉壁發育相關基因

0 引言

【研究意義】青花菜（L. var.）又名西蘭花，屬于十字花科蕓薹屬甘藍種中的一個變種，其營養成分含量高，富含蛋白質、礦物質、維生素C等，還含有3-甲基吲哚基硫苷和4-甲基硫氧丁基硫苷等抗癌、防癌活性物質，被譽為“蔬菜皇冠”[1-5]。近年來我國青花菜產業發展迅速，種植面積已超過8.7萬公頃[6]。但是，我國青花菜種質資源匱乏，與國外進口品種相比，我國自主育成的品種在花球商品性、耐貯性和適應性等方面存在較大差距。目前，我國青花菜栽培面積中，國外進口品種約占85%，且均表現為Ogura類型的細胞質雄性不育（cytoplasmic male sterility，CMS）。由于CMS為母系遺傳的不育類型，其優異性狀無法被分離出來，阻礙了優異育種材料的創新。因此，恢復Ogura CMS材料的育性，打破其優良性狀無法利用的壁壘，對于青花菜種質創新具有重要的意義和價值。【前人研究進展】青花菜起源于歐洲，在我國的栽培始于20世紀80年代，栽培時間短、育種起步晚、優異種質資源匱乏[7]。目前，市場上優良的青花菜多為進口品種，在抗逆性、廣適性、花球商品性、耐貯性等方面具有明顯的優勢，但均為Ogura CMS不育類型，無法進行種質資源再利用[8]，亟需創制Ogura CMS的育性恢復系。Ogura CMS不育源是Ogura在蘿卜群體中發現的自然突變體[9]，由于其線粒體重排產生的嵌合基因導致花藥不能產生正常花粉而敗育[10]。青花菜Ogura CMS不育系是研究者通過蘿卜與甘藍屬間進行遠緣雜交結合胚挽救以及原生質體非對稱融合并結合多代回交轉育等方法創制[11]。由于Ogura CMS系敗育徹底、不育性穩定，成為目前青花菜雜交制種中應用最廣泛的不育親本。Ogura CMS類型的恢復系只存在于蘿卜中，其育性恢復基因包含18個pentatricopeptide repeat基序[12-13]。直接或者間接與的mRNA結合，影響其轉錄后的穩定性，降低其蛋白含量，使育性恢復[14-15]。研究者已通過遠緣雜交等手段將成功轉入到了甘藍型油菜中[16-17]。為了將導入甘藍類蔬菜，于海龍[11]利用Ogura CMS芥藍為母本與甘藍型油菜（含）遠緣雜交獲得恢復單株，并通過連續回交得到形態與親本芥藍相近的恢復材料。黃靜靜等[18]利用Yu等[19]獲得的遠緣雜交材料，與Ogura CMS青花菜進行雜交、回交，獲得了株型接近青花菜的恢復系。LI等[20]通過農桿菌介導的甘藍轉基因體系將Rfo轉入了甘藍Ogura CMS系CMS2016，獲得了育性恢復轉基因株系。【本研究切入點】通過遠緣雜交手段創制Ogura CMS恢復系的策略存在耗時長、供體基因背景難以消除、傳遞率低等問題[21]。而通過轉基因手段將轉入甘藍能快速、穩定地獲得Ogura CMS育性恢復系[20]。但目前并未有報道通過轉基因手段直接將轉入青花菜Ogura CMS材料，以快速獲得青花菜Ogura CMS的恢復系。【擬解決的關鍵問題】本研究通過農桿菌介導的青花菜遺傳轉化方法將整合至主栽優良青花菜CMS品種SFB45基因組中，并以此為父本創制優異種質資源。

1 材料與方法

1.1 植物材料及栽培條件

青花菜商品種‘耐寒優秀’（命名為SFB45）、‘米修斯’（命名為MXS）購自青島官明天成種業有限公司（青島，中國）。

表達載體由中國農業科學院蔬菜花卉研究所甘藍青花菜課題組惠贈。

農桿菌介導的青花菜遺傳轉化試驗于2020— 2021年在江蘇省農業科學院蔬菜研究所進行，將野生型和鑒定為陽性的植株移栽至營養缽（10 cm×10 cm），在光照培養室里生長（25℃，日照16 h/黑暗8 h），待根成團后于2021年10月底移栽至江蘇省農業科學院六合試驗基地大棚，越冬春化后，2022年4月開花。

1.2 pRfo::Rfo表達載體構建

在NCBI（National Center for Biotechnology Information）搜索并下載蘿卜的啟動子2 000 bp及CDS序列2 064 bp（NCBI序列號為AJ550021），利用基因合成的方法合成其序列，并連接到PUC57中間載體上，設計帶酶切位點（I和B I）的引物，以PUC57載體質粒為模板進行擴增，經B I酶切后，啟動子與CDS序列進行連接，通過I酶切位點將載體pBWA (V) BS的目的區域切開，啟動子及CDS序列構建至載體pBWA(V)BS上，獲得表達載體::。利用熱激法將構建好的載體轉入農桿菌GV3101中，挑取10個單菌落進行PCR鑒定和一代測序，利用LB液體培養基（含50 mg?L-1利福平及100 mg?L-1卡那霉素）保存::序列正確的農桿菌。所有方法步驟均參照試劑盒說明書進行。

1.3 農桿菌介導的遺傳轉化

農桿菌介導的遺傳轉化方法及培養基配方（表1）參照崔慧琳[22]的方法并稍作改變。具體步驟如下：

（1）種子消毒：將200—300粒種子放在干凈的50 mL離心管中，75%酒精消毒2 min、7%—10%次氯酸鈉消毒10 min，滅菌的ddH2O清洗3次（3—5 min/次），將種子放在滅菌的濾紙上吸掉表面水分；

（2）播種：用滅菌后的鑷子將種子移到MS培養基里，在培養室中培養4—6 d，培養條件為16 h光照/8 h黑暗，25 ℃；

（3）外植體預培養：滅菌后用手術刀或者手術剪刀將具柄子葉及下胚軸切下（下胚軸長度約為1 cm），并及時將外植體放在預培養基上，正常培養2 d；

（4）農桿菌液制備：取4 ℃保存的帶目的載體的農桿菌菌液加入LB液體培養基（含50 mg?L-1利福平及100 mg?L-1卡那霉素），在28 ℃搖床上培養10—14 h，至OD600為0.4—0.6，6 000 r/min離心8 min，棄上清，用MS液體培養基重懸清洗一次，再次離心（6 000 r/min，8 min），用等量的MS溶液重懸備用；

（5）侵染：提前在培養皿中放入15 mL的MS溶液，隨后將外植體放入培養皿中，再加入15 mL MS重懸的菌液；輕輕晃動10 min；

（6）共培養：倒掉菌液，將外植體在濾紙上晾干，在共培養培養基中黑暗培養36—48 h；

（7）延遲培養：將共培養培養基上的外植體轉入延遲培養基上培養4—7 d；

（8）選擇培養：將外植體轉入選擇培養基上培養，每14 d更換一次培養基，篩選2—3次；

（9）抗性芽培養：將外植體上長出的抗性芽切下來放入長苗培養基中，培養條件同步驟（2）；

（10）生根培養：將PCR鑒定為陽性的植株轉入生根培養基中，培養20 d。

1.4 轉基因株系的鑒定及絨氈層、花粉壁相關基因的表達

利用改良的CTAB法提取抗性植株的DNA，使用標記（-F/R）進行PCR擴增，檢測轉基因陽性株系。利用朱琴等[23]開發的Ogura CMS相關的標記Bo138-FR確認轉基因株系為Ogura CMS不育。20 μL PCR反應體系包含PCR mix 10 μL，10 μmol?L-1上、下游引物各1 μL，Template 2 μL，ddH2O 6 μL。PCR mix為2×TSINGKE Master Mix（blue）（擎科生物，北京，中國）。PCR反應條件為預變性94 ℃，5 min；變性94 ℃，30 s；退火55 ℃，30 s；延伸72 ℃，1 min；35個循環；終延伸72 ℃，5 min。

使用RNeasy?Plant Mini Kit試劑盒（Qiagen，Hilde，Germany）提取對照及陽性植株花蕾的RNA，反轉錄為cDNA，操作步驟參照使用說明。以甘藍（GenBank號：XM_013731369.1）為內參，利用qRT-PCR分析及絨氈層、花粉壁發育相關基因在對照及陽性植株花蕾中的表達情況（每個樣本3次生物學重復）。使用的DNA Marker為DL2000 DNA marker（擎科生物，北京，中國），貨號：TSJ011-100。相關引物（表2）利用Primer 3.0（http://bioinfo.ut.ee/ primer3-0.4.0/）在線設計。

1.5 花粉活力檢測

利用亞歷山大染色液（Leagene，北京佰凱生物科技有限公司）對育性恢復植株的花粉進行活力檢測，方法參考說明書：在開花盛期取新開的5朵花，將花粉彈至載玻片上，用200 μL的槍滴加8滴染色液，蓋上蓋玻片進行染色，30 min后在顯微鏡（OLYMPUS BX41，日本）下觀察。

2 結果

2.1 pRfo::Rfo載體構建

經I酶切后，載體上的毒性基因被切除，然后與經I和B I酶切后的啟動子和CDS片段進行連接，形成::表達載體。空載體和構建好的載體見圖1。

表2 本研究所使用的引物

2.2 Rfo轉基因陽性株系的獲得及鑒定

將構建的表達載體::轉入青花菜SFB45的下胚軸及具柄子葉，通過再生、篩選后獲得了抗性植株（圖2）。提取抗性植株的DNA，擴增抗除草劑標記基因及胞質不育基因片段，鑒定出10個陽性植株，及擴增片段大小分別為300和428 bp，表明恢復基因已整合至Ogura CMS青花菜SFB45的基因組中（圖3）。

A：pBWA (V) BS空載體表達元件TDNA的結構示意圖；B：表達載體pRfo::Rfo的TDNA表達元件結構示意圖

A：MS培養基播種；B：具柄子葉和下胚軸預培養；C：抗性芽篩選培養；D：抗性苗篩選培養；E：陽性植株；F：陽性植株開花期

2.3 陽性植株表型及花粉活力鑒定

盛花期觀察發現10個轉基因株系中有8個育性得到恢復，另外2個仍為完全不育。相比Ogura CMS植株，育性恢復植株的花絲花藥顯著伸長（圖3）。8個恢復系的育性恢復程度不同，其中有2個株系（編號-1、-2）育性得到了完全恢復。其他6個植株僅部分花朵的部分雄蕊產生花粉。根據雄蕊的育性恢復情況，可分為5種類型：（1）6個雄蕊均有花粉；（2）4個雄蕊有花粉；（3）3個雄蕊有花粉；（4）2個雄蕊有花粉；（5）無花粉（圖4）。

利用亞歷山大染液對代表不同育性恢復程度的植株（-1、-3、-6、-8）的花粉進行染色，有活力的花粉粒飽滿，顏色染為紅色；無活力的花粉粒畸形、顏色淺或者為白色（圖5），花粉活力平均值分別為90.4%（-1）、86.7%（-3）、87.5%（-6）、84.2%（-8）。

2.4 陽性植株花蕾中Rfo及絨氈層花粉壁相關基因的表達

分析在轉基因育性恢復材料-1中＜3 mm和＞3 mm花蕾的表達發現，在＞3 mm花蕾中的表達明顯升高，是在＜3 mm花蕾中表達水平的11.26倍（圖6）。由于Ogura CMS胞質不育是由絨氈層異常、花粉壁不能正常形成所導致，本研究選取一些調控絨氈層發育、凋亡及花粉壁形成的關鍵基因[24]，利用熒光定量PCR分析其在不育對照材料SFB45和-1中的表達情況（圖6）。絨氈層發育關鍵調節因子（）和（）在不育對照材料SFB45花蕾（＜3 mm）中表達極低，而在轉基因育性恢復材料花蕾（＜3 mm）中表達水平升高了近10倍。（）同源基因在水稻中突變表現為絨氈層延遲降解，該表型與Ogura CMS胞質不育敗育特征類似[25]。這兩個AMS基因在-1花蕾（＞3 mm）中表達明顯升高，與不育材料SFB45相比，分別升高了近20倍和40倍。花粉外壁的主要成分孢粉素合成所必需的基因（）[26]和（）[27]在-1花蕾（＜3 mm）和（＞3 mm）中的表達水平均明顯升高。四分體胼胝質壁及花粉外壁發育所必需的基因（）[28]在-1花蕾（＞3 mm）中比SFB45的表達水平約升高了53倍。表明的轉入使絨氈層及花粉壁發育相關的基因得以正常表達。

A：Ogura CMS orf138標記檢測。泳道#1為陰性對照，模板為甘藍轉基因植株e-10（含Bar）；泳道#2為陽性對照，模板為SFB45。B：除草劑抗性基因Bar標記檢測。泳道#1為陰性對照，模板為SFB45；泳道#2為陽性對照，模板為e-10。A和B中#3—#12泳道為陽性植株（R-1—R-10）

圖中比例尺為50 μm Scale bar is 50 μm

圖中R-1s和R-1L分別代表恢復系R-1的＜3 mm及＞3 mm花蕾；45s和45L分別代表Ogura CMS SFB45的＜3 mm及＞3 mm花蕾

2.5 陽性植株自交及雜交后代分析

利用標記對陽性植株自交及雜交后代進行鑒定，統計陽性植株及檢測總數。經卡方檢驗，結果表明χ2均小于3.84，說明育性恢復材料-1、-3和-6的自交后代中含標記的植株與不含標記的植株符合3﹕1分離比；以-3為父本與青花菜Ogura CMS商品種MXS的雜交后代中含標記的植株與不含標記的植株符合1﹕1分離比（表3）。結果表明整合進-1、-3和-6基因組的在其T1后代中的分離符合孟德爾遺傳，能夠穩定遺傳。

表3 R-1、R-3和R-6轉基因株系后代陽性植株遺傳分離統計

3 討論

3.1 不同陽性株系育性恢復程度存在差異

轉基因植株中外源基因隨機插入其基因組內，插入的拷貝數和插入位點會影響基因的表達。所有植物轉基因都存在不同株系中基因差異表達或沉默等導致的表型差異現象[29]。崔慧琳[22]將控制白花的基因轉入甘藍植株中，不同陽性株系中該基因表達量及花色變白的程度不同。Qin等[13]研究Ogura CMS甘藍型油菜轉基因株系發現不同轉基因株系產生有活力花粉的量與轉入的拷貝數以及Ogura CMS相關蛋白ORF138水平的降低有關，產生大量有活力花粉的轉基因株系中存在2—3個拷貝而花粉活力低的株系中僅存在1個拷貝。但針對拷貝數不同的研究有不同的結論。轉基因株系中基因表達量及達到預期表型的程度不僅與拷貝數多少有關，也與重復插入或T-DNA重排有關。研究表明表達水平和-葡萄糖醛酸酶活性在轉入1個拷貝的煙草株系中比在同一位點插入2個反向、重復拷貝的株系中要高[30]。De Buck等[31]研究表明大多數單拷貝擬南芥轉基因株系的基因表達量高，并且發現單拷貝轉基因株系中基因表達與插入位置（如基因間區、基因內、內含子、外顯子、正、反向插入等）關系不大。雖然單拷貝轉基因株系表達量高，但也有研究表明會存在轉錄后或表觀沉默現象，另外插入位點也會影響表達及表型[32-34]。由此可見，轉基因株系中基因表達量及表型差異是一個非常復雜的轉化問題。本研究中不同陽性植株育性恢復程度的差異可能與的拷貝數及其插入位點、是否重復插入、重排、轉化過程中其他因素等有關。

3.2 Rfo的轉入使絨氈層及花粉壁發育相關基因恢復正常表達

十字花科的模式植物擬南芥花藥發育分為14個時期[35]。1—5時期是從花藥原基分化出雄蕊原基開始至形成花粉母細胞；6—8時期包括花粉母細胞質膜和細胞壁之間形成胼胝質層，減數分裂完成形成四分體，絨氈層細胞開始降解，包圍四分體的胼胝質壁和花粉母細胞壁降解，小孢子釋放；9—14時期包括小孢子壁形成，小孢子經歷兩次有絲分裂，三核花粉粒形成，花藥開裂，花粉釋放[35]。康俊根[36]通過透射顯微鏡觀察發現蘿卜Ogura CMS的主要敗育特征是從減數分裂后期開始（即花藥發育的第6—8時期），絨氈層細胞進行性加厚而不降解，這一異常增生擠壓被釋放的小孢子致其敗育，花粉粒細胞壁延遲形成。本研究中熒光定量分析結果與這一敗育特征一致，即調控絨氈層發育及凋亡和調控花粉壁合成相關的基因在不育材料中均表達極低甚至不表達，而在育性恢復的轉材料中表達明顯升高。是如何調控這些下游基因的表達尚待進一步研究。前人的研究均關注到恢復材料中ORF138蛋白水平與育性恢復程度成反比，但并未詳細研究的表達情況與育性恢復的關系，僅Brown等[37]分析了在蘿卜恢復系材料的子葉、葉片、花中表達，而在根中不表達，而Qin等[13]的研究說明表達水平需要達到一定的閾值才能使育性恢復。本研究發現在育性恢復材料＞3 mm的花蕾中的表達水平明顯高于在＜3 mm花蕾中的表達，表明相較于花藥發育前期，后期發育可能需要更多的參與。調控Ogrua CMS育性恢復的機制尚待進一步研究。

4 結論

利用農桿菌介導的方法將蘿卜Ogura CMS的育性恢復基因轉入青花菜商業品種SFB45中，獲得了8個育性恢復系，可穩定遺傳，為青花菜種質改良提供了資源；的轉入使絨氈層及花粉壁發育相關基因恢復正常表達，花粉育性得到恢復。

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Development of Ogura CMS Restorers of Broccoli via Genetic Transformation of

XING MiaoMiao, XU YuanYuan, LU YuYu, YAN JiYong, ZENG AiSong

Institute of Vegetable Crops, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/Jiangsu Key Laboratory for Horticultural Crop Genetic Improvement, Nanjing 210014

【Objective】The broccoli restorers were developed by transforming the matching fertility restorer gene offrom radish into the leading cultivar Ogura CMS line of Nai Han You Xiu (named as SFB45), so as to efficaciously use Ogura cytoplasmic male sterility (CMS) hybrids in breeding and to provide resources for genetic improvement of germplasm.【Method】The sequence of CDS with its preceding promoter ofwere synthesized and the::plant expression vector was constructed to infect the cotyledon with petiole, and hypocotyl explants of the SFB45 through-mediated transformation method. After regeneration and screening of herbicide resistant seedlings, transgenic plants were identified by detection of theresistant marker. The fertility of transgenic plants were observed at flowering stage. The pollen viability of SFB45 and the transgenic plants were analyzed using the alexander stain. Total RNA of ＜3 mm and ＞3 mm flower buds from SFB45 and the transgenic plants were isolated and transcribed into cDNA. Thespecific primers were designed, and RT-PCR was performed to analyze the expression levels ofand also the genes related to tapetum and pollen wall development in flower buds of SFB45 and its restorer lines.【Result】A total of 10 transgenic plants were obtained by genetic transformation. Among which, the fertilities of 8 were restored to varying degrees with the average pollen viability ranging from 84.2% to 90.4%. RT-PCR analysis showed thatwas expressed in flower buds of fertility restored plants. The key regulators of tapetum development (and) and the essential gene () for the synthesis of sporopollenin, a major component of the pollen wall were up-regulated in ＜3 mm flower buds of Ogura CMS restore lines. The tapetum degradation related gene AMS and tetrad callose wall and pollen outer wall development relatedgenesandwere up-regulated in ＞3 mm flower buds of the restore lines. The analysis of the self- and hybrid-crossing progenies of the positive transgenic lines-1,-3 and-6 showed that the introducedcould be stably inherited, which was consistent with the Mendelian inheritance.【Conclusion】The fertility restorer lines of Ogura CMS SFB45 were obtained by genetic transformation of, and the integration ofinto the genome of SFB45 recovered the expression of genes associated with tapetum and pollen wall development.

broccoli; genetic transformation; Ogura CMS;; tapetum and pollen wall development-related genes

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.15.011

2022-12-02；

2023-05-22

江蘇省農業科學院探索性顛覆性創新計劃（ZX(21)1204）

邢苗苗，E-mail：20200021@jaas.ac.cn。通信作者曾愛松，E-mail：20000005@jaas.ac.cn

（責任編輯 趙伶俐）