葡萄VvGAI1與VvJAZ9蛋白互作及低溫下的表達模式分析

劉德帥，馮美，孫雨桐，王燁，遲敬楠，姚文孔

葡萄VvGAI1與VvJAZ9蛋白互作及低溫下的表達模式分析

劉德帥，馮美，孫雨桐，王燁，遲敬楠，姚文孔

寧夏大學葡萄酒與園藝學院/寧夏現代設施園藝工程技術研究中心/寧夏優勢特色作物現代分子育種重點實驗室，銀川 750021

【目的】DELLA蛋白屬于植物特有的GRAS蛋白家族，是赤霉素信號轉導途徑中的重要調控因子，在植物生長發育和抵御逆境脅迫中發揮著重要作用。克隆歐洲葡萄，并對其進行亞細胞定位、蛋白互作和表達分析，為進一步研究DELLA蛋白在葡萄抗寒反應中的調控功能奠定基礎。【方法】以釀酒葡萄品種‘霞多麗’葉片為試材，采用同源克隆的方法獲得序列。利用生物信息學方法分析該基因的序列特征，使用DNAMAN及MEGA7.0對VvGAI1蛋白序列及擬南芥序列進行多序列比對并構建系統進化樹。通過亞細胞定位確定VvGAI1蛋白在細胞中的表達位置；利用酵母試驗驗證VvGAI1蛋白的轉錄激活活性；利用酵母雙雜交和雙分子熒光互補試驗驗證VvGAI1蛋白與VvJAZ9蛋白的互作關系；利用VvGAI1原核表達蛋白制備anti-VvGAI1兔源多克隆抗體；利用Western Blot技術檢測VvGAI1蛋白在低溫下的表達情況；通過相對電導率分析外源噴施茉莉酸和赤霉素對葡萄抗寒性的影響。【結果】從‘霞多麗’葉片中克隆得到，其ORF為1 773 bp，編碼590個氨基酸，位于第1條染色體，含有1個外顯子，無內含子。VvGAI1蛋白相對分子質量為64.87 kDa，理論等電點pI為5.31，屬于酸性不穩定親水蛋白。VvGAI1具有高度保守的DELLA和GRAS結構域，屬于植物GRAS家族的DELLA蛋白。蛋白聚類分析顯示VvGAI1與擬南芥AtGAI和煙草NtGAI1親緣關系較近。亞細胞定位與轉錄自激活結果顯示VvGAI1是一個定位于細胞核中且具有轉錄激活活性的轉錄因子。酵母雙雜交和雙分子熒光互補試驗也證實VvGAI1與VvJAZ9具有互作關系。將克隆至原核表達載體構建pET28b-VvGAI1重組表達載體，轉化至大腸桿菌BL21中經16 ℃、1.0 mmol?L-1異丙基--d-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導表達獲得VvGAI1-His融合蛋白，再經抗原免疫，血清純化后制備得到anti-VvGAI1兔源多克隆抗體。制備的anti-VvGAI1抗體可以特異性檢測‘霞多麗’葡萄中的VvGAI1蛋白。Western Blot結果表明，低溫處理下葡萄原生質體中VvGAI1蛋白呈先上升后下降的表達趨勢，VvGAI1蛋白響應低溫誘導表達。與對照相比，50 μmol·L-1茉莉酸甲酯（MeJA）處理可以提高葡萄的抗寒性，50 μmol·L-1赤霉素（GA3）處理使葡萄對寒冷變得敏感。【結論】葡萄VvGAI1是一個與VvJAZ9相互作用的轉錄因子，VvGAI1對低溫脅迫有響應，外源茉莉酸能夠正調控冷脅迫反應，而赤霉素負調控冷脅迫反應。

葡萄；DELLA蛋白；；蛋白互作；低溫；表達模式

0 引言

【研究意義】葡萄（spp.）為葡萄科葡萄屬多年生落葉藤本植物，是世界上廣泛栽培的經濟果樹之一。目前，我國用于栽培生產的葡萄品種多數為歐亞種葡萄（L.），其具有產量高、品質優，但抗逆性差的特點。葡萄作為一種低溫敏感作物，在栽培生產過程中常遭受不同程度的低溫或冷凍傷害，從而限制了其在我國冷涼地區的發展，也嚴重影響了葡萄產量，經濟效益和產業發展[1-2]。在我國北方葡萄栽培地區，由于冬季寒冷干燥、春季霜凍和倒春寒頻發，只能采用葡萄樹體埋土防寒的措施來減少寒冷或低溫對葡萄造成的傷害。埋土防寒不但增加生產成本，且對樹體產生損傷，影響產量，還不利于環境保護[3-4]。因此，培育能在我國北方地區免埋土栽培的抗寒新品種十分迫切，挖掘葡萄中與抗寒相關的基因并研究其功能和作用機理，對解決葡萄冷害和凍害問題有重要的理論意義和實際應用價值。【前人研究進展】赤霉素（gibberellins，GA）作為一種廣泛存在于植物中的內源生長調節物質和信號分子，在種子萌發、胚軸伸長、莖的伸長、根的生長、花芽分化以及形態建成等植物發育過程中發揮著重要調節作用[5-6]。DELLA蛋白是GA信號轉導途徑中的核心作用元件，參與GA信號傳導并發揮負調控作用，抑制植物的生長發育[7]。當植物體內GA含量較低時，GA不會與其可溶性受體GID1（gibberllin insensitive dwarf 1）結合，從而使具有阻遏作用的DELLA蛋白與下游靶基因結合并抑制其轉錄，進而影響植物生長[8]；當植物體內GA含量較高時，GA與受體GID1結合形成具有疏水性表面的二元復合體GA-GID1，再與DELLA蛋白形成三元復合體GA-GID1-DELLA，促使DELLA蛋白與SCFSLY1/GID2（Skp1-Cul1-F-boxSLY1/GID2）的結合導致DELLA蛋白泛素化后被26S蛋白酶降解，解除抑制并引起下游基因的響應，從而使GA發揮正常效應[9]。DELLA蛋白作為GA信號轉導的一種負調節因子，主要存在于植物細胞核中，屬于植物特有的GRAS蛋白家族，由DELLA和GRAS兩個結構域組成，也是GRAS家族中研究較為廣泛的亞族之一[10-11]。DELLA蛋白的N端含有DELLA和TVHYNP兩個高度保守的酸性結構域，兩者共同參與DELLA蛋白與GID1受體的結合，是GA信號感知結構域[8]；中部含有一個NLS（nuclear localization sequence）核定位信號結構域[12]；而在C端含有GRAS家族特有的GRAS結構域，其主要包含SAW、SH2和VHIID三個保守的阻遏結構域，是DELLA蛋白的功能結構域[8]。不同物種中DELLA蛋白成員數量及作用方式均有差異，模式植物擬南芥（）最早被鑒定出含有5個DELLA蛋白家族成員（GAI、RGA、RGL1、RGL2和RGL3），其中GAI和RGA對植物莖的生長、花的發育以及葉片舒展有明顯影響；RGL1與RGL2在種子萌發和休眠過程中有調控作用；RGL3具有抑制種子萌發的作用；此外，RGA、RGL1和RGL2共同參與了花和果實的發育[13-16]。葡萄中也存在DELLA蛋白，目前鑒定出的DELLA蛋白成員有VvGAI1、VvRGA和VvSLR1[17-19]。VvGAI1對葡萄花器官的發育、節間伸長和結果量有調控作用[17-18]；VvRGA可能參與果實發育過程[18]；VvSLR1可能通過應答GA信號調控葡萄胚乳的發育[19]。是赤霉素信號通路中的關鍵節點基因，在抑制植物生長發育的同時也可增強植物對逆境脅迫的抗性[20]。鹽脅迫處理后的突變體小麥（）通過提高超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的活性，減少丙二醛（malondialdehyde，MDA）的積累，增加內源DELLA蛋白的含量來增強植株的耐鹽性[21]。低溫響應基因（C-repeat binding factors）通過促進（gibberellin 2-oxidase）和的表達來降低內源GA的含量，增強DELLA蛋白積累，從而提高植物的抗寒能力[22]。此外，DELLA蛋白缺少DNA結合結構域，不能與DNA直接結合，只能與不同信號途徑中的調控蛋白如PIFs（phytochrome interacting factors）、BZR1（brassinazole resistant 1）、JIN1（jasmonate insensitive 1）和JAZ（jasmonate ZIM- domain）相互作用發揮其分子功能，進而調控植物的生長發育與逆境抗性[23]。【本研究切入點】筆者課題組前期在歐洲葡萄VvJAZ9互作蛋白篩選中獲得一個可能存在互作關系的DELLA蛋白GAI1，并通過實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）分析發現受低溫誘導表達較為明顯，且呈現出先上升后下降的表達趨勢，在3 h時表達量達到最高[24]。目前，在葡萄中對GA信號轉導的抑制因子DELLA蛋白研究較少，主要集中在模式植物。然而，對于歐洲葡萄中赤霉素不敏感型基因的抗逆性研究更是少之甚少。葡萄作為一種低溫敏感植物，GAI1蛋白在歐洲葡萄中的生物功能及抗寒分子機制尚不明確。【擬解決的關鍵問題】本研究采用同源克隆的方法獲得，并運用生物信息學、亞細胞定位、轉錄自激活、酵母雙雜交、雙分子熒光互補（bimolecular fluorescent complimentary，BiFC）、抗體制備和蛋白印跡（Western blot）等手段分析及其蛋白特性，初步明確在葡萄抗寒過程中的生物功能。同時使用外源激素噴施葡萄幼苗并進行低溫處理，以了解外源激素對葡萄抗寒性的影響，為深入分析DELLA蛋白在葡萄抗寒反應中的調控功能奠定理論基礎，也為參與葡萄抗寒調控機理的研究和抗寒葡萄品種的選育提供參考。

1 材料與方法

試驗于2021—2022年在寧夏大學葡萄酒與園藝學院寧夏優勢特色作物現代分子育種重點實驗室進行。

1.1 試驗材料

試驗材料為2年生歐洲釀酒葡萄‘霞多麗’（cv.Chardonnay）盆栽扦插苗，于植物培養間（25℃，16 h光照/8 h 黑暗）進行培養。選取生長健壯、長勢一致、無病蟲害的盆栽葡萄苗，平均分為3組，一組外源噴施50 μmol·L-1茉莉酸甲酯（methyljasmonate，MeJA）處理[25-26]。一組外源噴施50 μmol·L-1GA3處理[27]，一組外源噴施無菌水為對照（CK），處理12 h后放置于低溫培養箱內（立德泰勀，上海）分別進行-3 ℃冷脅迫處理，光照條件一致，每個處理設置3次生物學重復。在0、3和6 h分別采集3組供試盆栽葡萄苗葉片樣品，部分用于相對電導率的測定，部分用錫箔紙包好后立即放入液氮中冷凍，然后置于-80 ℃冰箱保存，用于RNA的提取。

試驗中所用的RNA提取試劑盒、膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒、大腸桿菌（）DH5和BL21（DE3）購于北京天根生化科技有限公司；無縫克隆試劑盒購于南京諾唯贊生物科技有限公司；反轉錄試劑盒、高保真酶、DNA Marker、限制性內切酶均購于大連寶生物工程有限公司；pMD19-T載體、pBI221載體（攜帶GFP標簽蛋白）、pET28b（攜帶His標簽蛋白）、pGBKT7和pGADT7載體均由本實驗室原有保存；引物合成和測序均由北京奧科鼎盛生物科技有限公司完成；其余試劑均為國產或進口分析純。

1.2 基因克隆

按照植物總RNA提取試劑盒（天根生化，北京）和反轉錄試劑盒（TaKaRa，大連）的說明書進行葡萄葉片總RNA的提取以及合成第一鏈cDNA，用于基因的克隆。以NCBI數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中的基因序列（GenBank No.: XM_002284612.4）為參考序列，使用Primer Premier 6.0軟件設計同源克隆引物（表1）。參考俞沁含等[28]的PCR反應體系與程序進行PCR擴增獲得目的片段。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測、膠回收后連接至pMD19-T克隆載體，然后轉化大腸桿菌（）DH5感受態細胞，經藍白斑篩選后選取陽性單克隆至北京奧科鼎盛生物科技有限公司測序確認，以獲得含有目的基因的重組載體。

1.3 生物信息學分析

利用NCBI在線分析工具CDD（https://www.ncbi. nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）預測蛋白保守結構域；采用在線軟件ExPASy ProtParam（https://web. expasy.org/protparam/）分析VvGAI1蛋白的基本理化性質；運用在線網站Grape Genome Browser（https:// www. genoscope.cns.fr/externe/GenomeBrowser/Vitis/）分析的染色體定位、內含子及外顯子區域；采用DNAMAN軟件對VvGAI1蛋白序列進行多重比對；利用Pfam數據庫（http://pfam.xfam.org/）下載DELLA（PF12041）和GRAS（PF03514）結構域的隱馬爾可夫模型文件，然后使用HMMER 3.0（http:// hmmer.org/）軟件篩選出葡萄全基因組蛋白序列中含有這兩個結構域的DELLA蛋白，同樣按照此方法篩選出其他物種中的DELLA蛋白。使用MEGA7.0軟件中的鄰接法（neighbor-joining，NJ）構建蛋白系統進化樹（bootstrap設為1 000）。

1.4 VvGAI1亞細胞定位觀察

根據的開放閱讀框（open reading frame，ORF）序列設計植物表達載體的特異性引物（表1）。以pMD19-T-VvJAZ9質粒為模板，通過PCR擴增獲得目的片段。經無縫克隆構建至經I和I雙酶切的植物表達載體pBI221-GFP后，轉化DH5感受態細胞，經菌液PCR與酶切鑒定正確的重組質粒送公司測序分析，經公司測序驗證后得到pBI221-VvGAI1- GFP融合表達載體。參考Sasamoto等[29]的方法制備擬南芥原生質體，采用PEG（polyethylene glycol）介導法分別將pBI221-VvGAI1-GFP和pBI221-GFP質粒轉化至擬南芥原生質體中，轉化后的原生質體在22 ℃弱光照條件下培養20 h，然后使用激光共聚焦顯微鏡（Leica TCS SP8 X，德國）觀察VvGAI1蛋白的亞細胞定位情況并拍照記錄。

1.5 轉錄自激活活性分析

利用Primer Premier 6.0軟件設計的全長特異引物以及缺失DELLA和GRAS結構域的特異引物（表1），以歐洲葡萄‘霞多麗’葉片的cDNA為模板，按照PrimeSTAR?Max DNA Polymerase說明書（TaKaRa，大連）擴增全長及兩個關鍵結構域缺失片段，通過R Ⅰ和H Ⅰ雙酶切及同源重組反應克隆至pGBKT7誘餌表達載體上，轉化DH5感受態細胞，經測序確認后獲得重組載體pGBKT7-VvGAI1、pGBKT7-VvGAI1?DELLA和pGBKT7-VvGAI1?GRAS。以pGADT7-T+pGBKT7-p53質粒為陽性對照，pGADT7-T + pGBKT7-Lam質粒為陰性對照，pGBKT7質粒為空載體對照，重組質粒pGBKT7-VvGAI1、pGBKT7-VvGAI1?DELLA、pGBKT7- VvGAI1?GRAS為自激活檢測組，采用PEG/LiAc法將重組質粒和空載質粒分別轉入酵母Y2H Gold感受態細胞中，陰性和陽性對照共轉化至Y2H Gold感受態細胞中，然后均勻涂布于單缺培養基（SD/-Trp）進行培養。經菌落PCR篩選陽性克隆后挑取單克隆接種至0.9% NaCl溶液中，混勻后調整菌液濃度OD600=0.3。各取1 μL點樣于SD/-Trp和SD/-Trp/AbA/X--Gal培養基上，30 ℃倒置培養3—4 d后，觀察菌落的生長和顏色變化，以確定VvGAI1蛋白是否具有轉錄自激活活性。

1.6 酵母雙雜交驗證GAI1與JAZ9蛋白互作

根據1的ORF序列設計特異性引物（表1），將其構建至pGADT7載體上形成pGADT7-VvGAI1重組載體。然后將重組載體pGADT7-VvGAI1與筆者課題組前期構建的誘餌載體pGBKT7-VvJAZ9共轉化酵母Y2H Gold感受態細胞，同時將pGBKT7-VvJAZ9+ pGADT7、pGBKT7+pGADT7-VvGAI1分別轉化至Y2H Gold感受態細胞中，點涂于SD/-Trp/AbA/ X--Gal培養基上，置于恒溫培養箱中培養3—4 d，觀察酵母菌落的生長與顏色變化情況，以確定GAI1蛋白與JAZ9蛋白是否存在相互作用。

1.7 雙分子熒光互補試驗（BiFC）驗證GAI1與JAZ9蛋白互作

利用Primer Premier 6.0軟件設計和的ORF中不含終止密碼子的同源重組引物（表1），通過同源重組法將和與BiFC驗證載體pB221-cEYFP（cYFP）、pB221-nEYFP（nYFP）連接，分別構成VvJAZ9-cYFP和VvGAI1- nYFP重組載體。然后將構建好的VvJAZ9-cYFP和VvGAI1-nYFP及對照載體分別大提質粒，將所獲得的質粒通過乙醇沉淀法濃縮至1 500—2 000 ng·μL-1。采用酶解法分離擬南芥葉肉組織原生質體[29]，通過PEG介導法分別將質粒兩兩組合共轉至擬南芥原生質體中，共轉化的原生質體于22 ℃弱光培養18 h進行瞬時表達，使用激光共聚焦顯微鏡（Leica TCS SP8 X，德國）觀察熒光并拍照記錄。

1.8 外源噴施茉莉酸甲酯（MeJA）與赤霉素（GA3）對葡萄抗寒性的影響

參考WANG等[4]的方法通過相對電導率（relative electrical conductivity，REC）評估植物抗寒性。按照相對電導率（%）=（初始電導率值/最終電導率值）×100公式計算相對電導率。使用Excel 2019整理試驗數據，并采用IBM SPSS 25.0對試驗數據進行統計分析，利用單因素ANOVA分析和Duncan’s test進行顯著性分析（＜0.05），然后使用Origin Pro 2021作圖。

1.9 重組蛋白的表達與純化

根據的ORF序列全長并使用Primer Premier軟件設計出相應的引物（表1）。以pMD19- T-VvGAI1質粒為模板，通過PCR擴增獲得目的片段。采用無縫克隆法將其克隆至經I/I雙酶切原核表達載體pET28b-His上形成重組載體pET28b- VvJAZ9，轉化DH5感受態細胞，進行菌液PCR與酶切鑒定。對鑒定正確的重組質粒進行測序，經測序公司測序后獲得正確重組載體pET28b-VvGAI1。將測序正確的pET28b-VvGAI重組質粒轉化至BL21感受態細胞，加入1.0 mmol?L-1異丙基--d-硫代半乳糖苷（isopropyl--d-thiogalactoside，IPTG），16 ℃誘導表達16 h后收集200 mL菌體，經過超聲破碎后，4 ℃、10 000×離心20 min，收集菌體蛋白的上清液與沉淀。然后通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離，隨后進行考馬斯亮藍染色、脫色和拍照。參照TMNi-NTA Resin試劑盒（全式金生物，北京）說明書對獲得的重組蛋白進行純化，純化產物經SDS-PAGE檢測純度。

表1 引物列表

下劃線部分為限制性內切酶位點 The underlined sequences are the site of restriction endonuclease

1.10 抗體的制備與親和性檢測

參考吳楠等[30]的方法進行多克隆抗體的制備與親和性檢測。將符合免疫要求濃度的重組蛋白乳化后，按照1 mg?kg-1的劑量，對2只新西蘭大白兔進行多點皮下注射，間隔7 d 注射一次。每只兔子免疫4—5次后取少量血樣，采用酶聯免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測血清抗體效價，經檢測合格后，于第1次免疫52 d后一次性采血獲得抗血清。將誘導表達的蛋白進行SDS-PAGE電泳分析并凝膠濕轉至硝酸纖維素膜上，以純化的兔血清為一抗（1﹕1 000），再以熒光標記的山羊抗兔抗體為二抗進行Western Blot鑒定多克隆抗體的特異性。

1.11 VvGAI1蛋白在低溫條件下表達分析

為確定制備出的anti-VvGAI1抗體能否檢測到葡萄中的VvGAI1蛋白，參考BERTINI等[31]的方法制備葡萄愈傷組織原生質體，以歐洲葡萄‘霞多麗’的愈傷組織為材料，采用2%纖維素酶（cellulase onozuka R-10）、1%離析酶（macerozyme R-10）和0.05%果膠酶（pectolyase Y-23）的酶組合，在0.5 mol·L-1甘露醇溶液中，28 ℃黑暗條件下，酶解14 h后分離葡萄愈傷組織原生質體，經血球計數板測定原生質體產量為1.97×106個/g，經0.5 mg·mL-1二乙酸熒光素溶液（fluorescein diacetate，FDA）染色并在紫外光下檢測原生質體的活力為80%。將制備的葡萄愈傷原生質體在細胞培養板上按照1 mL/組進行分組試驗，然后置于低溫培養箱內進行4 ℃低溫處理，分別在0、0.5、1和2 h時收集原生質體并提取蛋白。參考YAO等[32]的方法進行Western blot分析，使用anti-VvGAI1抗體對葡萄中的VvGAI1蛋白進行檢測。

2 結果

2.1 VvGAI1克隆

以提取的釀酒葡萄‘霞多麗’葉片總RNA反轉錄合成的cDNA為模板，通過同源克隆的方式從‘霞多麗’葡萄cDNA中克隆得到的ORF序列（圖1）。將目的片段擴增產物膠回收并與pMD19-T載體連接，挑選陽性克隆進行測序。測序結果表明的ORF 長1 773 bp，編碼590個氨基酸（圖2-A）；定位于第1條染色體，含有1個外顯子，不含內含子；VvGAI1蛋白由590個氨基酸組成，其中亮氨酸占比最高，分子量約為64.87 kDa，等電點pI為5.31，不穩定性指數為45.78，GRAVY（grand average of hydropathicity）值為-0.276，屬于酸性不穩定親水蛋白。VvGAI1蛋白保守結構域預測結果表明，該蛋白在35—102和214—574氨基酸處分別含有DELLA和GRAS兩個保守結構域，屬于植物特有的GRAS家族的DELLA蛋白（圖2-B）。

M: DL5000 bp DNA Marker; 1: VvGAI1 gene

A：VvGAI1核苷酸及氨基酸序列；B：VvGAI1蛋白的保守結構域，陰影部分的氨基酸為DELLA和GRAS兩個保守結構域，*代表終止密碼子

2.2 VvGAI1蛋白序列比對及系統進化分析

利用DNAMAN將VvGAI1與擬南芥中5個DELLA蛋白（GAI、RGA、RGL1、RGL2和RGL3）的氨基酸序列進行多重比對分析，發現葡萄VvGAI1蛋白與擬南芥5個DELLA蛋白的氨基酸序列中都含有GRAS家族典型的DELLA和GRAS結構域。VvGAI1與擬南芥5個DELLA蛋白氨基酸序列間的相似度達57.82%，其中與AtGAI（GenBank登錄號：NP_172945）、AtRGA（NP_178266）的相似度較高，分別為63.41%和62.46%（圖3）。

為進一步分析VvGAI1與其他物種DELLA蛋白間的系統進化關系，以擬南芥AtGAI蛋白的DELLA和GRAS保守結構域為基礎，利用HMMER 3.0軟件分別從葡萄、蘋果、桃、梨、橙子、甜瓜、野草莓、番茄、大豆和煙草基因組中鑒定出DELLA蛋白基因家族成員，并使用MEGA 7.0軟件對鑒定出的DELLA蛋白構建系統進化樹。聚類結果顯示（圖4），所有48個DELLA成員根據其蛋白序列特征可劃分為5個亞族，即Group Ⅰ—Ⅴ。葡萄中的3個DELLA蛋白分布于Group Ⅰ、Group Ⅱ和Group Ⅳ，在亞組Ⅰ中的VvRGA（XP_002266267）與CsGAI（XP_ 006482132）和AtRGL3（NP_197251）親緣關系較近；在亞組Ⅱ中的VvGAI1（XP_002284648）與AtGAI和NtGAI1（XP_016441385）具有較近的親緣關系；在亞組Ⅳ中的VvSLR1（XP_002284952）與橙子CsSLR1（XP_006475770）親緣關系最近，與甜瓜CmSLR1（XP_008463334）的進化距離較近。

圖中點表示序列比對空位，藍色線區域表示DELLA保守結構域，橙色線區域表示GRAS保守結構域

2.3 VvGAI1亞細胞定位分析

為探究VvGAI1蛋白的亞細胞定位情況，將空載質粒pBI221-GFP和重組質粒pBI221- VvGAI1-GFP通過PEG介導法轉化至擬南芥原生質體進行瞬時表達。22 ℃弱光培養20 h后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光分布情況。結果顯示（圖5），pBI221-GFP和pBI221-VvGAI1-GFP在原生質體表達蛋白后均能檢測到綠色熒光，其中作為空載體對照pBI221-GFP的綠色熒光在原生質體的細胞膜、細胞質和細胞核中均有分布；而pBI221-VvGAI1-GFP融合蛋白只在細胞核中顯示綠色熒光，說明VvGAI1在細胞核中表達并發揮功能。

圖4 葡萄DELLA蛋白系統進化分析

圖 5 VvGAI1亞細胞定位

2.4 外源JA與GA對葡萄抗寒性影響的分析

為進一步分析JA與GA對葡萄抗寒性影響，選取生長一致的扦插自根苗葡萄植株為試材，分別外源噴施MeJA與GA3，12 h后進行-3 ℃冷脅迫處理，結果表明（圖6），噴施MeJA的葡萄植株葉片在0 h處理的相對電導率稍有下降但無顯著差異，而冷脅迫處理3 h和6 h后噴施MeJA的葉片電導率相較于噴施無菌水（CK）顯著下降，說明外源JA可以降低葡萄葉片在冷脅迫下的相對電導率，能夠提高葡萄的抗寒性。噴施GA3的葡萄植株葉片在0 h冷處理的相對電導率較對照無顯著差異，同樣在冷脅迫處理3 h后噴施GA3的葉片電導率相較于對照無顯著差異，而冷脅迫處理6 h后噴施GA3的葉片電導率相較于對照顯著上升，說明外源GA處理增加了葡萄葉片在冷脅迫下的相對電導率，使葡萄對冷脅迫敏感。這些結果表明JA有利于正調控冷脅迫反應，而GA則是負調控冷脅迫反應。

*表示差異顯著（P＜0.05），**表示差異極顯著（P＜0.01）

2.5 VvGAI1蛋白的自激活分析

將構建成功的pGBKT7-VvGAI1、pGBKT7- VvGAI1?DELLA、pGBKT7-VvGAI1?GRAS重組質粒分別轉化至酵母Y2H Gold感受態細胞中（圖7），驗證VvGAI1是否具有自激活活性。3種重組載體、陽性對照（pGADT7-T+pGBKT7-p53）、陰性對照（pGADT7-T+pGBKT7-Lam）和空載對照（pGBKT7）的質粒轉入酵母后在SD/-Trp培養基上均能正常生長，但在SD/-Trp/AbA/X--Gal培養基上只有陰性對照和空載體對照的菌株不能正常生長，而含有pGBKT7-VvGAI1、pGBKT7-VvGAI1?DELLA、pGBKT7-VvGAI1?GRAS重組質粒和陽性對照的酵母菌株均能正常生長且顯現藍色，說明3種重組質粒均已轉入酵母細胞，VvGAI1蛋白的DELLA和GRAS結構域在酵母中均有自激活活性，且GRAS結構域轉錄激活活性弱于DELLA結構域，VvGAI1能夠激活下游報告基因的轉錄和翻譯（圖7-B）。

A：VvGAI1蛋白結構示意圖；B：VvGAI1蛋白的轉錄激活活性驗證。BD：pGBKT7空載體作為空載對照；Po：pGADT7-T+pGBKT7-p53作為陽性對照；Ne：pGADT7-T+pGBKT7-Lam作為陰性對照

2.6 酵母雙雜交點對點驗證VvGAI1與VvJAZ9的互作關系

為進一步驗證VvGAI1與VvJAZ9互作關系，將的ORF克隆至pGADT7載體，構建重組載體pGADT7-VvGAI1。然后將pGBKT7-VvJAZ9+pGADT7- VvGAI1，pGBKT7-VvJAZ9+pGADT7，pGBKT7+pGADT7-VvGAI1共轉化至酵母Y2H Gold感受態細胞中，點涂于SD/-Trp/AbA/X--Gal培養基上進行點對點驗證。在SD/-Trp/AbA/X--Gal培養基上只有pGBKT7- VvJAZ9+pGADT7-VvGAI1和陽性對照（pGADT7-T+ pGBKT7-p53）顯現藍色酵母菌落，而pGBKT7- VvJAZ9+pGADT7，pGBKT7+pGADT7-VvGAI1和陰性對照（pGADT7-T+pGBKT7-Lam）的菌株均不能正常生長，說明VvGAI1與VvJAZ9存在相互作用（圖8）。

Po：pGADT7-T+pGBKT7-p53作為陽性對照；Ne：pGADT7-T+pGBKT7-Lam作為陰性對照

2.7 BiFC證明VvGAI1與VvJAZ9蛋白互作

利用BiFC試驗進一步驗證VvGAI1與VvJAZ9在植物體內的互作關系，分別將和中不含終止密碼子的ORF序列通過同源重組法連接至pB221-cYFP、pB221-nYFP載體中，構成VvJAZ9-cYFP和VvGAI1-nYFP重組載體。然后將cYFPJAZ9+nYFPGAI1、cYFPJAZ9+nYFP和cYFP+nYFPGAI1共轉化擬南芥原生質體。結果顯示，共轉化的cYFPJAZ9+nYFPGAI1在擬南芥原生質體中可以觀察到黃色熒光信號，而cYFPJAZ9+ nYFP和cYFP+nYFPGAI1均未觀察到黃色熒光信號，表明VvGAI1和VvJAZ9蛋白在植物體內存在互作關系（圖9）。

2.8 anti-VvGAI1抗體制備

以獲得的片段為模板，通過同源重組的方法將的ORF連接至帶有His標簽蛋白的原核表達載體pET28b上，形成融合表達載體pET28b-VvGAI1-His（圖10）。

將構建成功的pET28b-VvGAI1-His重組質粒轉入原核蛋白表達菌株BL21后，經IPTG誘導以獲得最佳表達條件。結果表明，轉入重組質粒的菌株在16 ℃下經1.0 mmol·L-1IPTG誘導16 h后，能夠達到純化目的蛋白的需求（圖11-A）。然后經Ni-NTA親和層析獲得純化的VvGAI1-His融合蛋白，再經SDS-PAGE凝膠電泳后，通過考馬斯亮藍染色鑒定出提取的蛋白大小為67.06 kDa（圖11-B），確定無誤后經免疫挑選健康的6周大小的新西蘭大白兔兩只（約2 kg），制備多克隆抗體。結果顯示anti-VvGAI1多克隆抗體制備良好可用于后續試驗（圖 11-C）。

圖9 BiFC驗證VvGAI1 與VvJAZ9蛋白互作

M：DL 5000 bp DNA Marker；泳道1—3：pET28b-VvGAI1-His菌液PCR檢測

2.9 VvGAI1蛋白在低溫條件下表達分析

為了解葡萄中VvGAI1蛋白在低溫條件下表達情況，也為確定所制備的anti-VvGAI1抗體能否檢測到葡萄中的VvGAI1蛋白，采用酶解法制備出葡萄愈傷組織原生質體，并進行4 ℃低溫處理，在0、0.5、1和2 h時收集原生質體，提取蛋白后，分別用anti-VvGAI1抗體檢測葡萄原生質體在4 ℃處理后VvGAI1蛋白的表達情況。結果顯示，制備的anti-VvGAI1抗體可用于檢測葡萄內源VvGAI1蛋白的表達情況，4 ℃低溫處理后的原生質體中VvGAI1蛋白呈現先上升后下降的表達趨勢，說明VvGAI1蛋白受低溫誘導表達，且與受低溫誘導表達趨勢相似（圖12）。

A：VvGAI1原核誘導表達；B：VvGAI1蛋白純化；C：anti-VvGAI1制備后的檢測。圖中CK表示非誘導細菌培養（陰性對照），M表示蛋白分子量標準，泳道1—4分別表示E. coli BL21菌株在16 ℃條件下IPTG誘制獲得的天然蛋白提取物，37 ℃條件下IPTG誘導獲得的天然蛋白提取物，16 ℃條件下IPTG誘導獲得的變性蛋白提取物，37 ℃條件下IPTG誘導獲得的變性蛋白提取物

圖12 VvGAI1蛋白在低溫條件下的表達分析

3 討論

3.1 外源植物激素JA與GA影響葡萄抗寒性

GA和JA是廣泛存在于植物中的內源生長調節物質和信號分子，在植物生長發育、次生代謝以及非生物和生物脅迫的防御反應中均發揮著重要調節作用[33-34]。已有研究表明，冷脅迫會使植物體內的茉莉酸類物質含量增加，而外源施用JA可以增強抗氧化酶活性，增加抗氧化劑、防御化合物的合成，減少活性氧和丙二醛的積累，降低細胞膜的通透性以及誘導冷響應基因的表達來提高番茄（）[35]、香蕉（）[36]、枇杷（）[37]、葡萄[38]等植物的抗寒性。本研究發現外源噴施JA后再經冷脅迫處理3 h和6 h的葡萄植株葉片的相對電導率相較于噴施無菌水處理（對照）顯著下降，這與前人在葡萄上的研究結果一致[38]，表明外源JA處理可有效降低葡萄葉片在冷脅迫下的相對電導率，保持細胞膜的完整性，增強抗寒能力；同時也說明JA在誘導植物對冷脅迫的適應過程中起著正調控作用。

GA也參與植物對低溫脅迫的反應，GA3顯著促進4 ℃低溫處理后花生種子萌發和種子活力，抑制花生幼苗在低溫處理后相對膜透性和丙二醛的上升，提高可溶性糖、可溶性蛋白、游離脯氨酸含量，增強花生幼苗的抗寒能力[39]。外源噴施100 mg·L-1GA3處理通過提高可溶性糖、可溶性蛋白質和游離脯氨酸的含量，延緩電解質滲出率，抑制丙二醛上升，來提高‘庫爾勒香梨’樹（Yu）的抗寒性[40]。本研究發現外源噴施GA3的葡萄植株在冷脅迫處理3 h后的葉片電導率與對照無差異，而冷脅迫處理6 h后的葉片電導率顯著高于對照；GA3處理增加了冷脅迫下的葉片相對電導率，使葡萄對冷脅迫敏感，說明GA在誘導植物對冷脅迫的適應過程中起著負調控作用。JAZ蛋白與DELLA蛋白分別是JA和GA信號途徑中的重要調控因子[20,33]，且分別受植物體內JA和GA水平的影響。因此，研究冷脅迫下，JA和GA信號通路之間的相互調節，對植物的抗寒性機理研究具有很好的理論價值。

3.2 VvGAI1及其蛋白的特征

SCFSLY1/GID2泛素蛋白復合體、轉錄抑制因子DELLA蛋白和赤霉素受體GID1是GA信號通路的3個核心組件，其中DELLA蛋白作為E3泛素連接SCFSLY1/GID2的靶蛋白是GA信號轉導途徑的關鍵組分[12]。近年來，隨著DELLA蛋白在GA信號途徑中的研究不斷深入，許多植物中DELLA蛋白基因被成功克隆，且DELLA蛋白在植物種子萌發、花器官形成、幼苗生長、果實發育、植株衰老和逆境抗性等方面均有影響[8]。本研究采用同源克隆的方法從歐洲葡萄中成功克隆出，隸屬植物特有的GRAS家族DELLA蛋白成員。該基因位于第1條染色體，有1個外顯子，無內含子，這與Acheampong等[18]從‘湯普森’無核葡萄中克隆的（）結果一致。的ORF序列長1 773 bp，編碼590個氨基酸，分子量約64.87 kDa，pI為5.31，是核定位蛋白，也具有DELLA和GRAS結構域；與張文穎等[19]在‘白羅莎里奧’葡萄中得到的VvGAI1蛋白性質一致；且與楊光等[41]報道的屬于不同葡萄品種中的同源序列。通過與擬南芥5個DELLA蛋白序列比對分析后發現，葡萄VvGAI1蛋白和擬南芥的DELLA蛋白中都具有GRAS家族的典型結構域和保守區，且與AtGAI和AtRGA的序列一致性較高，與釀酒葡萄‘莫尼耶皮諾’中VvGAI1（VvL1）蛋白結構研究一致[17]。本研究利用HMMER軟件從葡萄基因組中鑒定出3個DELLA蛋白基因家族成員，與前人研究結果一致[18-19]。本研究中葡萄與其他物種中鑒定出的DELLA成員構建的系統進化樹被分為5個亞組，亞組Ⅱ中的VvGAI1與AtGAI和NtGAI1的親緣關系較近，說明在進化過程中具有高度的序列保守性，在蛋白功能上可能具有一定的相似性。

3.3 DELLA蛋白與JAZ蛋白的相互作用

由于缺少DNA結合結構域，DELLA蛋白常與不同信號途徑中的調控蛋白發生互作來發揮其分子功能[23]。WD-repeat/bHLH/MYB復合物作為DELLA和JAZ相互作用的直接靶點，介導GA和JA信號轉導在調節毛狀體發育中的協同作用[42]。DELLA蛋白與MYBL2和JAZ形成JAZ-DELLA-MYBL2螯合物，加快HLH/MYB亞基的釋放和活性MBW復合物的形成，從而促進花青素的積累，提高植物的抗逆性[43]。DELLA和JAZ蛋白相互作用，抑制MYB21和MYB24的轉錄激活，進而抑制擬南芥花絲伸長[44]。水稻（）DELLA蛋白SLR1、SLR1-LIKE可與OsJAZ8和OsJAZ9相互作用，以介導GA和JA對水稻高株等性狀的拮抗調控[45]。本研究通過酵母雙雜交試驗發現DELLA蛋白VvGAI與VvJAZ9存在互作關系，進一步利用雙分子熒光互補試驗也證實VvGAI1和VvJAZ9蛋白在植物體內相互作用，與張晶星等[46]發現油松（）中5個JAZ蛋白與DELLA-like蛋白存在相互作用的結果類似。

3.4 多克隆抗體制備

目前，運用原核表達的重組蛋白免疫鼠、兔等動物制備多克隆抗體已成為一種行之有效且常用的方法[47]。此外，通過原核表達獲得大量的抗原蛋白，既可用于蛋白質性質與功能研究，也可用于蛋白質的相互作用等生化功能研究[48]。在葡萄抗寒研究方面所制備出的多克隆抗體有anti-VvHOS1[28]、anti-VaCIPK18[30]和anti-VaERD15[49]，而、和在植物響應低溫脅迫過程中發揮著重要作用。本研究純化抗血清后得到了效價高且特異性好的anti- VvGAI1多克隆抗體。該抗體能夠特異識別‘霞多麗’葡萄中的VvGAI1蛋白。

3.5 GAI基因響應逆境脅迫

DELLA蛋白作為GA信號轉導中的關鍵負調節因子，主要通過參與調節植物生長來響應逆境脅迫[20]。將甜菜（）在擬南芥異源表達可通過增強滲調節和抗氧化酶系統進而提高植株的耐鹽性[50]。有研究表明，干旱條件下紫花苜蓿（）的表達量逐漸上升并一直處于較高水平，可能通過與脫落酸相互協同參與干旱脅迫的響應[51]。筆者前期通過4 ℃低溫處理2年生‘霞多麗’葡萄盆栽扦插苗，發現低溫處理后的葡萄葉片中呈先上升后下降的表達趨勢，在3 h時表達量達到最高，并推測該基因可能參與葡萄冷脅迫響應[24]。本研究通過制備的anti-VvGAI1抗體檢測出4 ℃低溫處理的葡萄愈傷原生質體中VvGAI1蛋白呈先上升后下降的表達趨勢，表明VvGAI1蛋白響應低溫誘導表達，且與在轉錄水平上受低溫誘導表達趨勢相似。這也說明與其蛋白的表達水平在時間段上存在差異，植物不同組織和細胞對溫度的敏感性存在一定差異。植物原生質體是指植物細胞去除細胞壁后形成的只由質膜包裹的“裸露細胞”，是沒有細胞壁的特殊狀態，更容易感知外界刺激[52]。同樣在低溫處理下，葡萄原生質體對冷刺激的感知速度以及響應效率要高于葡萄植株。

4 結論

從歐洲葡萄‘霞多麗’中克隆獲得，ORF長1 773 bp，編碼590個氨基酸，無內含子，含有1個外顯子以及DELLA和GRAS兩個高度保守結構域，屬于植物GRAS家族的DELLA蛋白。蛋白聚類分析發現VvGAI1與擬南芥AtGAI和煙草NtGAI1親緣關系較近。VvGAI1是一個定位于細胞核中且具有轉錄激活活性的轉錄因子。酵母雙雜交與雙分子熒光互補試驗結果都表明VvGAI1與VvJAZ9蛋白具有互作關系。制備的anti-VvGAI1抗體能夠特異性檢測出‘霞多麗’葡萄中的VvGAI1蛋白，Western blot結果表明VvGAI1響應低溫誘導表達。外源JA處理可以提高葡萄的抗寒性，而GA處理使葡萄對寒冷變得敏感。

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Analysis of the Interaction Between VvGAI1 and VvJAZ9 Proteins in Grape and Its Expression Pattern Under Low Temperature

LIU DeShuai, FENG Mei, SUN YuTong, WANG Ye, CHI JingNan, YAO WenKong

College of Enology and Horticulture, Ningxia University/Ningxia Modern Facility Horticulture Engineering Technology Research Center/Ningxia Key Laboratory of Modern Molecular Breeding of Dominant and Characteristic Crops, Yinchuan 750021

【Objective】DELLA protein belongs to plant-specific GRAS protein family, which is a significant regulatory factor in GA signal transduction pathway and plays important roles in plant growth, development and resistance to different stresses. In this study, the European grapevinegene was cloned and the analysis of subcellular localization, protein interaction and expression were performed, so as to lay the foundation for the further study of the function of DELLA protein in response to cold stress in grapevine.【Method】Thegene sequence was obtained by homologous cloning from the leaves ofcv. Chardonnay. Thesequence was analyzed by bioinformatics method, and the multiple sequence alignment and phylogenetic trees were performed by DNAMAN and MEGA7.0, respectively. The location of VvGAI1 protein in cells was determined by subcellular localization, and the transcriptional activation activity of the VvGAI1 protein was confirmed by a yeast assay. The interaction between VvGAI1 protein and VvJAZ9 protein was verified by yeast two-hybrid and BiFC assays. The VvGAI1 protein polyclonal antibodies from rabbit was prepared by VvGAI1 protein purified from prokaryotic expression. The VvGAI1 protein expression at low temperature was detected by Western blot method. The effect of exogenous MeJA and GA3on the cold resistance in grape was analyzed by relative electrical conductivity.【Result】Thegene was cloned from Chardonnay leaves, with carrying an ORF of 1773 bp, encoding 590 amino acids, locating on chromosome 1, and containing only one exon. The VvGAI1 protein had a molecular weight of 64.87 kDa and pI of 5.31, which was an acidic unstable hydrophilic protein. The VvGAI1 belonged to GRAS family and had the conserved DELLA and GRAS domains. Protein clustering analysis showed that VvGAI1 was closely related toGAI and tobacco GAI1. The results of subcellular location and transcriptional activation showed that VvGAI1 was a transcription factor localized in the nucleus and had transcriptional self-activation activity. The interaction between VvGAI1 and VvJAZ9 was confirmed by yeast two-hybrid andBiFC assays. Thegene sequence was cloned into the prokaryotic expression vector to form a pET28b-VvGAI1 recombinant vector, and theBL21 carrying pET28b-VvGAI1 recombinant vector was incubated in culture medium with 1.0 mmol?L-1isopropyl--d-thiogalactoside (IPTG) at 16 ℃ to obtain VvGAI1-His fusion protein. The anti-VvGAI1 polyclonal antibody (rabbit-derived) was prepared by antigen immunization and serum purification and used to specifically detect VvGAI1 protein in Chardonnay grapes. Western blot results showed that the VvGAI1 protein in grape protoplasts under low temperature treatment showed an increasing first and then decreasing trend, which indicated the expression of VvGAI1 protein was induced at a low temperature. For 50 μmol·L-1MeJA and 50 μmol·L-1GA3treatments, compared with the control group exogenous MeJA treatment could improve the cold resistance of grape, whereas GA3treatment made grapes more sensitive to cold.【Conclusion】Grape VvGAI1 protein was a transcription factor and interacts with VvJAZ9. The VvGAI1 responded to low temperature stress, and exogenous MeJA was able topositively regulate the cold stress, while GA3negatively regulated the cold response.

; DELLA protein;; protein interaction; low temperature; expression pattern

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.15.012

2023-01-12；

2023-03-31

國家自然科學基金地區科學基金（31960586）、寧夏回族自治區重點研發項目（2018BEB04004）、寧夏回族自治區青年科技人才托舉工程項目

劉德帥，E-mail：lds201220@163.com。通信作者姚文孔，E-mail：yaowenkong@163.com

（責任編輯 趙伶俐）