動物源醫療器械可瀝濾物的研究進展

劉 璟，劉子琪，丁 黎，付步芳

(1．中國食品藥品檢定研究院，北京 102629；2．中國藥科大學，江蘇 南京 211198)

動物源醫療器械產品指全部或部分采用動物組織制成的，或取材于動物組織、動物組織衍生物或由動物體自然獲取物質制成的醫療器械產品。與非動物來源的材料相比，具有更好的生物相容性和生物活性等特點[1]，使得應用領域越來越廣泛，原材料的種類也越來越多。根據國家食品藥品監督管理局2017年發布的醫療器械產品分類目錄，動物源醫療器械產品主要有5 類，包括無源植入器械，如人工骨、心臟瓣膜、外科修復補片等；無源手術器械如膠原蛋白縫合線、羊腸縫合線；護理和防護器械，如膠原蛋白海綿、殼聚糖防黏連膜等；眼科器械，如脫細胞角膜植片、眼用透明質酸鈉等；口腔科器械如生物膜、口腔修復膜等。

應用動物源醫療器械受益的同時也面臨著兩大風險：動物源材料特殊的免疫毒性風險和供體本身所攜帶的病毒等危險性因子及其外源因子污染引起的安全風險問題[1]。為有效降低動物組織帶來的免疫原性，動物源產品一般需要進行脫細胞、去除雜蛋白等工序。異種產品相對非生物源產品更重視病原體帶來的傳播風險，需要進行嚴格的病毒滅活、滅菌處理。包括以上工序在內的多種加工過程中產生的加工工藝殘留、滅菌殘留劑等物質存在一定毒副作用，同時在醫療器械的應用中，這些物質均可能直接或通過相關介質進入人體[2-3]。上述醫療器械或材料在臨床使用過程中釋放出的物質統稱為可瀝濾物。動物源產品可瀝濾物的研究為相關產品的生物學評價和毒理學風險評估提供所必需的信息，并為產品開發及優化提供支持。因此，對醫療器械的可瀝濾物研究既是企業在設計開發產品階段的研究熱點，也是當下醫療器械監管和相關產品技術審評關注的重點[4-5]。

1 動物源醫療器械可瀝濾物的監管現狀

經國家藥監局醫療器械標準管理中心網站查詢，動物源醫療器械產品現行有效的相關標準有9 項，見表1(序號1～9)，與可瀝濾物相關的標準有3 項，見表1(序號10～12)，迄今為止尚無關于動物源醫療器械可瀝濾物具體檢測方法的國家標準或行業標準。國家藥監局醫療器械技術審評中心先后發布《醫療器械已知可瀝濾物測定方法驗證及確認注冊技術審查指導原則》及《醫療器械未知可瀝濾物評價方法建立及表征技術審查指導原則》(征求意見稿)后，對醫療器械的可瀝濾物檢測和評價要求正式作為必需的注冊申報資料，大多數包括動物源在內的醫療器械均需要進行可瀝濾物的控制。但目前可瀝濾物的檢測分析和評價方法較少，因此有必要探索建立一套科學規范的醫療器械可瀝濾物的標準化檢測分析方法。

2 動物源醫療器械可瀝濾物的種類

動物源產品來源豐富，取材范圍廣泛、制備過程復雜、使用到有機溶劑等小分子物質種類較多，因此，形成可瀝濾物的安全性風險更高。確定動物源醫療器械可瀝濾物種類是建立可瀝濾物檢測分析方法的基礎，常見的可瀝濾物來源主要有以下幾個方面。

2.1 脫細胞

為降低動物源材料在生產加工過程中可能出現殘留的組織蛋白、抗原等物質帶來的免疫原性風險，一般會采取脫細胞、去除雜蛋白等方法[6]。其中，天然組織材料經過脫細胞處理后，能夠顯著降低移植后排斥反應的發生，同時保留原有的組織結構和特性，材料表面微環境依然有利于細胞的生存。目前常用物理、化學和生物酶法等進行脫細胞處理。在組織工程心臟瓣膜去除細胞的方法主要有：胰蛋白酶法、去垢劑-酶消化法、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)法和去氧膽酸鈉法等[7-10]。常用試劑如SDS可通過溶解細胞質和核膜，破壞蛋白質分子內和分子間相互作用導致細胞死亡，但SDS作為表面活性劑，當其到達一定濃度會產生細胞毒性和溶血作用，因此需對其殘留量進行嚴格限制[11-12]。周建偉等[13]研究了SDS的殘留量與細胞毒性的相關性，并得到對L-929 細胞和MC3T3-E1細胞產生細胞毒性的臨界濃度分別為4×10-3mg/mL 和6×10-3mg/mL。

2.2 交聯改性

為提高動物心臟瓣膜的穩定性，顯著降低免疫原性，提高使用壽命，早在1968年Carpentier 就使用戊二醛(glutaric dialdehyde，GA)交聯處理異種生物組織瓣，1970年開始，GA交聯的牛心包材料制備的生物瓣膜已得到了推廣[14]。目前探索的天然交聯劑有去甲二氫愈創木酸、單寧酸等，化學試劑有碳化二亞胺等。因為GA 具有水溶性、價格便宜等優點，其為最先使用并且最常用的交聯劑[15]。汪希銘等[16]將殼聚糖基納米纖維膜經GA 交聯處理后，穩定性得到明顯改善，并且一定程度上提升了纖維膜強度和韌性。此外目前對脫細胞真皮基質等產品也常用GA 進行交聯改性。然而，GA 具有較強的細胞毒性，GA交聯制備的生物瓣因GA緩慢而微量的釋出仍可引起細胞毒性，此外，生物瓣在體內的鈣化也與GA 交聯有關[17]。因此在實際應用中，醛類交聯產品可以根據所需的性能來選擇最優的交聯劑用量，并需要對醛殘留量進行嚴格控制和檢測。

2.3 病毒滅活及滅菌

動物病原感染人早已引起社會各界的關注，禽流感、狂犬病等給人類帶來不同程度的危害。動物源產品來源于動物的骨、皮膚、肌腱等組織，因此需要格外重視病毒滅活和滅菌工序，除需要滿足《YY/T 0771 動物源醫療器械》等標準要求外，還要重視保護生產操作人員和環境以免造成污染[18]。常見工藝中，如環氧乙烷滅活法在骨材料中的應用，但現在應用較少；過氧乙酸-乙醇滅活法在皮膚、骨等材料中均有較好的應用；此外，過氧化氫滅活法也被廣泛應用于骨、膠原材料中。研究發現[19-20]對牛腱片樣品經3%過氧化氫溶液處理后，水皰性口炎病毒、甲型H1N1病毒的滅活對數值均大于4，馬來源的皮質骨和松質骨顆粒及心包膜材料經3%過氧化氫溶液處理后的所有生物材料均表現出完全消除病毒感染性，單純皰疹病毒、甲型H1N1病毒和柯薩奇病毒滅活對數值均大于4，即表明過氧化氫滅活病毒后的產品質量安全可靠。但病毒滅活的同時會對生物材料性能造成不同程度的損害，白玉龍等[19]研究表明過氧乙酸、過氧化氫、環氧乙烷等殘留也會對人體產生危害，甚至會引起致癌、致畸。

動物源產品及其原材料在貯存、生產及使用等過程中產生的各種化學物質的反應產物等也需要被考慮，如2-氯乙醇為環氧乙烷滅菌過程中衍生的有機物質。經環氧乙烷滅菌的產品可能仍殘留一定量2-氯乙醇[20]。對于絕大多數國內醫療器械產品的注冊檢驗，2-氯乙醇仍是非強制性檢測項目，但已有廣泛的研究表明2-氯乙醇的檢測需要被重視[21]。

3 動物源醫療器械浸提液的制備方法

可瀝濾物的分析方法一般包括浸提液制備和可瀝濾物的檢測方法兩部分。大部分動物源器械特別是長期植入類器械，很難獲得臨床實際使用時的研究數據，所以很多情況下可選擇浸提方式制備浸提液，從而完成對可瀝濾物的研究。由于動物源醫療器械種類繁多，因此用于可瀝濾物檢測的浸提液制備方法也各有不同。浸提液制備的研究主要包括：浸提介質的選擇，樣品浸提部位的選擇，浸提方式的選擇，浸提條件的選擇。

3.1 浸提方式與浸提樣品的選擇

常用的浸提方式包括加速浸提、模擬浸提、極限浸提和加嚴浸提，極限浸提可建立從醫療器械或材料中浸提的最大可浸提物的量，即醫療器械或材料在臨床使用壽命期間可能釋放的可瀝濾物量的最大量。動物源醫療器械屬于持久接觸或長期接觸類器械，很難模擬實際使用條件，所以一般選擇極限浸提。此外，可根據實際情況選擇除浸提外的其他方式，如李麗花等[22]研究中由于正己烷不溶于水，而采用無機酸溶液進行樣品前處理后再用靜態頂空氣相色譜法檢測了其中的有機溶劑殘留量，對于揮發性物質的研究可參考采用此法。

浸提樣品與浸提方式的選擇是相輔相成的[23]。浸提樣品優先選擇最終產品，或根據代表性部分的浸提結果推算出整個樣品的結果。若終產品無法滿足浸提要求，可采用相同原材料在相同工藝條件下加工成的半成品來完成浸提；若含有多種材料，選取的樣品中每一組分占樣品的比例需要與此組分占被測產品的比例相同。

3.2 浸提介質的選擇

對于某些臨床使用中僅接觸單一液體體系的產品，可采用該臨床接觸液體作為浸提介質，對于無法模擬的介質，或者當已知可瀝濾物易與介質發生反應從而造成干擾時，可選擇替代溶劑。其中，在水能溶解的情況下，以水做溶劑可以更好地模擬材料植入人體情況。替代溶劑應根據可瀝濾物特征進行選擇，且不應與待測物發生化學反應，同時應考慮器械在臨床接觸介質的性質等，除此之外，材料本身的性能也應被考慮。如因生物補片與SDS結合的化學鍵比較牢固，使得難以檢出全部的SDS殘留，若用氫氧化鈉或硫酸降解生物補片則會使SDS發生不可逆的化學變化，所以亞甲基藍法不能直接用于檢測SDS殘留。而碳酸鈉可以競爭性地與生物補片中的蛋白質結合，從而能夠使SDS游離出來，同時甲醇產生的界面聚集能夠加速游離[12]，因此可采用甲醇-碳酸鈉混合液作為浸提介質。

3.3 浸提條件的選擇

浸提體積的選擇在保證浸提液能夠完全浸沒樣品的基礎上盡量減少，同時也需防止被浸提物質因濃度過大而飽和。此外可根據樣品面積或質量比例加入浸提液進行浸提，如脫細胞異種皮膚、可吸收醫用膜等規則片狀結構產品，通常在考慮樣品厚薄的基礎上，按樣品表面積等比例加入溶劑，同時需要根據樣品臨床應用部位確定按照單面或雙面表面積計算。

對于浸提溫度和時間，應盡可能模擬臨床實際情況，如提高溫度應避免使材料和目標可瀝濾物發生化學變化；另外浸提比例、是否振蕩、攪拌，循環、超聲等都是需要結合具體產品要考慮的問題。選用的浸提條件均需要嚴于或等于產品在預期使用中帶給患者的最大風險下的條件。如王麗等[24]測定豬心臟瓣膜假體中GA殘留量時，實驗顯示48 h和72 h后仍能檢測出GA殘留，即證明在此產品中GA會持續被浸提，因此需要結合產品臨床實際使用情況選擇合適條件。

4 動物源醫療器械可瀝濾物的檢測方法

根據動物源醫療器械產品中擬研究物質的理化性質、浸提溶劑等因素，合理篩選建立合適的測定方法進行定性定量研究，同時還應考慮方法的檢驗精度是否滿足安全性評價的要求。醫療器械的可瀝濾物根據研究目標不同，可分為根據相關信息識別的已知可瀝濾物和根據未知可瀝濾物研究體系鑒別的未知可瀝濾物。已知可瀝濾物通常為調研工廠產品制備工藝獲得的加工過程中所涉及的物質，而未知可瀝濾物可能是包裝遷移物質、加工助劑中雜質或降解產物等。

4.1 已知可瀝濾物檢測方法

在動物源產品中已知可瀝濾物檢測方法的選擇上，優先選用藥典、標準等公布的已有檢測方法，并根據浸提液特點確定是否需要調整和優化。對新方法進行驗證可參考《醫療器械已知可瀝濾物測定方法驗證及確認注冊技術審查指導原則》。行業標準YY/T 0962整形手術用交聯透明質酸鈉凝膠給出了交聯劑1,4 丁二醇二縮水甘油基醚(1,4-butanediol diglycidyl ether，BDDE)殘留量測定的方法，付海洋等[25]則改進和優化了BDDE含量的標準檢測方法。在氣相色譜法中，首先對樣品的酶解處理以使BDDE 更好地從凝膠內部釋放，并選用乙酸乙酯對BDDE 進行萃取。此外，使用酶標儀檢測法，將透明質酸酶添加到標準溶液中能夠去除透明質酸酶對測定結果的影響。

對于無標準檢測方法的可瀝濾物，需要根據待測物質的理化性質、浸提選用溶劑等選擇合適的檢測分析方法并進行方法學驗證及確認工作。此外，需要考慮分析方法的系統適應性，如適用于色譜法檢測，通常需根據待測物沸點、極性等性質建立色譜方法，優化色譜柱類型、分流比、流速等以優化目標物質理論塔板數、拖尾因子和分離度等系統適應性指標。常用的分析技術包括氣相色譜、液相色譜、色譜-質譜聯用技術、電感耦合等離子體光譜分析技術(inductively coupled plasma spectrometer，ICP-Spectroscopy)等。其中氣相和液相色譜及質譜主要用于分析有機可瀝濾物，電感耦合等離子體原子發射光譜(inductively coupled plasma optical emission spectrometer，ICPOES)和電感耦合等離子體質譜(inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS)等主要用于分析元素可瀝濾物。對于同一待測物質也可采用不同檢測方法進行驗證比較。如葛翠蘭等[26]建立了高效液相色譜測定交聯劑二乙烯基砜(divinyl sulfone，DVS)殘留測定的測定方法，但前期樣品處理較繁瑣，朱彬等[27]則采用氣相色譜法測定DVS殘留量，對比可得該方法樣品制備簡單，取樣量少。

4.2 未知可瀝濾物的檢測方法

隨著現代分析技術及評價理念的優化，以未知可瀝濾物評價體系為基礎的可瀝濾物研究表征體系已成為醫療器械化學表征的重要組成部分。未知可瀝濾物的檢測與已知可瀝濾物測定的最大不同在于首先要對可瀝濾物進行定性，因此需要一套確實可信而且有證據的多種分析技術的聯合體系，例如色譜法與多種檢測儀器結合、核磁共振和其他光譜技術等。采用未知可瀝濾物掃描模式以盡可能地識別所有潛在的可瀝濾物且能夠為浸提物鑒別提供足夠的信息，同時可進行半定量或定量分析。此外，不同分析技術獲得的結果還可以用于相互印證。將未知可瀝濾物轉化為已知可瀝濾物檢測后，即可采用上述已知可瀝濾物檢測方法開展可瀝濾物定量檢測。如盧大偉等[28]根據氣相色譜-質譜聯用技術對透明質酸鈉凝膠中未知殘留物進行檢測分析，并對比毒理學數據和國內外標準討論其危害，首次發現醫用透明質酸鈉凝膠產品中甲醇、二甲苯和乙苯的殘留，并建立了合適的方法對3種殘留物進行定性及定量。

5 可瀝濾物允許限量的確定方法

可瀝濾物允許限量的確定是通過文獻評審或毒理學試驗等確定可瀝濾物在預期用途下的人體可耐受的量，并通過患者體質量、應用因子等數據獲得允許限量數據。目前，國家標準《GB/T16886.17-2005 醫療器械生物學評價第17 部分：可瀝濾物允許限量的建立》規定了醫療器械可瀝濾物允許限量的確定方法，其目的是獲得標準的運用及未建立標準的限量的適當評估。該標準由國際標準ISO 10993-17：2002[29]等同轉化。此外，可結合美國環境保護署(U.S. Environmental Protection Agency，EPA)公開的毒理學數據建立可瀝濾物的允許限量。對于無明確毒理學數據的可瀝濾物，采用毒理學關注閾值(threshold of toxicological concern，TTC)的評價方法確定可瀝濾物的允許限量。可瀝濾物允許限量的確定，動物源產品中毒害物質產生的確定才能夠被量化，從而才能完成動物源產品的安全性評價[30]。此外，也需要不斷更新和改進評估方法，以適應新的科學和技術發展，提高醫療器械和藥品的安全性。

6 總結與展望

隨著新型醫療器械產品不斷涌現和現代科學技術的不斷發展，動物源醫療器械產品應不斷完善，從產品生產全過程進行質量控制，最大程度抑制相關產品在生產等過程中可能產生的風險，提升產品的質量，才能夠更好地保證相關產品的安全性和有效性。

雖然不同種屬及不同用途的動物源產品在質量控制上有差異，但本文對動物源醫療器械可瀝濾物的分類匯總、動物源產品浸提液制備、可瀝濾物檢測方法及可瀝濾物允許限量的確定的梳理是評價其安全有效的關鍵內容。動物源醫療器械可瀝濾物檢測技術研究的難點及關鍵點在于將未知可瀝濾物轉化為已知可瀝濾物檢測的過程。動物源可瀝濾物檢測分析技術需進一步探索，還應在該類產品的質量控制中引入更先進的分析手段，探索相關的新技術、新工具、新方法、形成新標準，研制相關標準物質，搭建醫療器械的可瀝濾物檢測平臺，才能夠改觀我國動物源醫療器械可瀝濾物檢測分析方法匱乏的局面，從而為監管部門提供方法技術科學支撐，為相關生產企業進行產品質量控制提供標準方法。