基于細胞焦亡探討中醫藥防治糖尿病及其并發癥的研究進展

王瑞楠,孫藝,韓宇博 劉莉

細胞焦亡的相關研究最早始于20世紀80年代,Friedlan-der[1]發現利用炭疽致死毒素處理小鼠腹腔巨噬細胞,不僅促進了細胞裂解死亡,還誘發了炎性反應。幾年后,研究人員通過對感染福氏志賀菌的巨噬細胞進行研究,發現了這種由半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)介導的促炎性細胞死亡途徑[2]。2001年Cookson等[3]將這種細胞死亡方式命名為Pyroptosis即細胞焦亡。隨著細胞焦亡在醫學領域受到的關注逐漸增多,越來越多的證據證實細胞焦亡與代謝性疾病、腫瘤、心血管疾病等各類疾病密切相關[4-6]。

糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一種以代謝失調和慢性炎性反應為主要特征的免疫性疾病,由于其常伴隨一些嚴重的并發癥,始終是醫療界的一個核心問題。研究發現高血糖會導致糖基化終產物(advanced glycation end products, AGEs)和活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平升高,誘導炎性小體激活進而發生細胞焦亡,細胞焦亡或許將成為防治DM及其并發癥的新切入點[7-8]。中醫藥調控細胞焦亡具有多靶點、多通路等獨特優勢,故筆者從細胞焦亡的角度出發,對細胞焦亡的機制、通路以及中醫藥通過調控細胞焦亡防治DM及其并發癥的研究進展情況做系統綜述,以期為今后中醫藥防治DM及其并發癥提供理論依據并擴寬思路。

1 細胞焦亡概述

細胞死亡是最基本的生物學過程,細胞死亡方式主要分兩種,一種是細胞壞死,另一種是包括凋亡、自噬、焦亡在內的程序性死亡[9]。細胞焦亡過程中,細胞膜表面會出現大量的孔隙,導致細胞腫脹和破裂的發生,與此同時細胞內容物流出,進而造成持續的炎性反應。細胞焦亡在心肌細胞、內皮細胞、平滑肌細胞等各類細胞中均會發生,其過程主要依賴于Caspase家族的活性[10]。根據細胞焦亡被激活的途徑不同可以分為依賴Caspase-1激活的經典途徑和依賴Caspase-4/5/11激活的非經典途徑。

2 細胞焦亡途徑

2.1 經典細胞焦亡途徑 經典的細胞焦亡途徑主要依賴Caspase-1的激活。當細胞受到如高血糖、炎性反應等因素的刺激時,會激活炎性小體的傳感器,其包括核苷酸結合寡聚化結構域樣受體(NOD-like receptors,NLRs)、黑色素瘤缺乏因子2樣受體(absent in melanoma 2 like receptors, ALRs)以及Toll樣受體(Toll-like receptors,TLR),NLRP3是其中最常見的一種[11]。通過識別病原體相關分子模式(pathogen associated molecular patterns, PAMPs) 或危險相關分子模式(danger-associated molecular pattern, DAMPs)激活相應的炎性小體,被激活后的炎性小體通過凋亡相關斑點蛋白(ASC)將自身與pro-Caspase-1結合并激活Caspase-1,激活的Caspase-1可以活化pro-IL-1β以及pro-IL-18,使其成為成熟的炎性細胞因子,誘發炎性反應[12]。與此同時活化后的Caspase-1通過特異性切割Gasdermin D(GSDMD),產生具有活性的帶有N端片段的GSDMD-N,GSDMD-N能夠與質膜結合,并形成許多直徑10～20nm的孔洞,孔洞的形成會促進炎性因子的釋放進而放大炎性反應,細胞內外滲透壓改變,最終細胞腫脹破裂,發生細胞焦亡[13]。

2.2 非經典細胞焦亡途徑 非經典的焦亡途徑主要依賴脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導。革蘭陰性細菌中的LPS能夠直接激活人類的Caspase-4、Caspase-5以及小鼠的Caspase-11[14],激活的 Caspase-4/5/11可以特異性切割 GSDMD,釋放GSDMD-N誘導細胞焦亡;同時GSDMD-N會激活NLRP3炎性小體,并誘導Caspase-1活化進而激活經典途徑的細胞焦亡[15]。在這個過程中,活化的Caspase11可直接裂解縫隙連接蛋白-1(Pannexin-1),促進鉀離子外排并將ATP釋放到細胞外,導致細胞膜破裂,最終發生細胞死亡。

3 細胞焦亡與糖尿病及其并發癥

3.1 細胞焦亡與糖尿病 文獻報道,2022年全世界有約5.37億成年DM患者,且患病率仍在不斷上升,已成為世界范圍的嚴重公共衛生為題[16]。炎性反應與DM有著密不可分的關系。1型糖尿病(T1DM)是一種慢性自身免疫性疾病,其特征是胰島素缺乏和由此導致的高血糖。Ma等[17]發現細胞焦亡促進了β細胞的破壞,進一步損傷了胰島功能。Carlos等[18]在鏈脲佐菌素誘導的T1DM小鼠模型中,觀察到小鼠胰腺組織的NLRP3和IL-1β水平明顯升高;相反,NLRP3基因敲除的小鼠不僅NLRP3和IL-1β水平明顯降低,其胰島素水平也顯著提高,可見NLRP3介導的細胞焦亡參與了T1DM的發展進程。此外,還有研究指出過高的AGEs水平會損傷β細胞功能,減少細胞數量[19]。在此基礎上,通過干預AGEs積累水平能夠降低小鼠T1DM的發病率,AGEs或許是防治T1DM的潛在靶點。

2型糖尿病(T2DM)的病理基礎是胰腺β細胞功能障礙和胰島素抵抗,大量證據表明細胞焦亡與肥胖和胰島素抵抗密切相關。DM初期的代謝產物如磷脂酶C、二酰巰基乙醇會活化蛋白激酶C,最終激活NLRP3炎性小體,引起細胞焦亡發生;而隨著病情的進展,細胞焦亡會進一步導致β細胞數量減少,并且加重胰島素抵抗[20]。在動物模型中發現,高脂飲食(HFD)誘導的小鼠脂肪組織中,NLRP3、IL-1β及IL-18表達水平明顯提高,胰島素敏感性降低;之后研究者將收集的T2DM患者腹部活檢數據進行分析,最終得出結論,即T2DM患者通過減重及減少攝入后,其脂肪組織 NLRP3和炎性因子表達降低,且胰島素敏感性得到改善,這恰恰證實NLRP3在肥胖及胰島素抵抗的發展過程中發揮著至關重要的作用[21]。Sehgal等[22]也印證了這一觀點,數據顯示NLRP3炎性小體促進了脂肪組織炎性反應的發生,降低了胰島素的敏感性,并且NLRP3炎性小體、Caspase-1、IL-1β的表達水平與胰島素抵抗的嚴重程度直接相關。肝臟胰島素抵抗是T2DM發展關鍵環節,研究表明肝胰島素信號通路受損、線粒體自噬和NLRP3炎性小體活化與肝臟胰島素抵抗密切相關[23]。此外,骨骼肌是胰島素的靶器官之一,Cho等[24]在一項體外研究中發現,脂滴包被蛋白2(PLIN2)的過表達在激活NLRP3炎性小體,提升Caspase-1、IL-1β表達水平的同時,還能夠抑制胰島素誘導的葡萄糖攝取,降低胰島素受體底物IRS-1的表達,說明NLRP3炎性小體、IL-1β對骨骼肌細胞IR具有一定調控作用。

總之,細胞焦亡過程中伴隨的大量炎性因子釋放是其參與DM發生發展的核心機制,NLRP3炎性小體和炎性因子發揮了重要的作用,由此可見,通過靶向細胞焦亡的相關分子進而防治DM可能是一種有效途徑。

3.2 細胞焦亡與糖尿病并發癥 糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)的患病率和病死率較高,其最主要特征是心臟結構的改變和功能的異常,最終進展為心力衰竭[25]。心肌細胞死亡、心肌細胞肥大及纖維化均會加重心室重構,也是導致DCM進展的罪魁禍首。Cao等[26]發現,NLRP3炎性小體和細胞焦亡加劇了H9C2心肌細胞損傷,NLRP3炎性小體和細胞焦亡與DCM密切相關。在鏈脲佐菌素(STZ)誘導的糖尿病大鼠模型中,其心臟組織AIM2表達顯著增加,并且大鼠表現出嚴重的左心室功能障礙,包括代謝紊亂、心臟纖維化和心肌細胞死亡。之后的體外實驗中,通過AIM2的基因沉默改變了上述結果,最終得出結論,AIM2通過GSDMD介導的細胞焦亡途徑在糖尿病性心肌病的細胞死亡和纖維化中發揮重要作用[27]。另有研究報道,在高糖誘導的DCM心肌細胞中,活化的Caspase-1和焦亡細胞因子可通過AMPK-TXNIP通路誘導心肌細胞焦亡[28]。

糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病嚴重的并發癥之一,是一種無菌性的炎性疾病。近年來,大量的研究結果表明,細胞焦亡在DN的發展過程的作用尤為重要。在STZ誘導的DN小鼠模型中,Caspase-1、NLRP3和IL-1β的表達水平顯著增高[29],為細胞焦亡促進DN進展的理論提供了有力的證據。Shahzad等[30]發現線粒體活性氧(reactive oxygen species,ROS)及NLRP3炎性小體的激活會加重DN的腎臟損害。在高糖培養的足細胞中,Caspase-11、Caspase-4、GSDMD-N、IL- 1β和IL-18水平提升,而Nephrin和Podocin蛋白的表達被抑制,因此研究者認為Caspase-11/4和GSDMD介導的細胞焦亡參與了足細胞損傷和DN的發展。在其他的研究報道中, TXNIP和炎性小體相關通路激活在DN進展中的作用也逐漸被認可[31]。

糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy,DR)是全球成人視力受損及失明的最主要原因之一[32]。研究發現DR患者玻璃體樣本中NLRP3、Caspase-1、ASC和IL-18的表達水平升高,這一現象在增殖性糖尿病視網膜病變 (PDR)患者的玻璃體樣本中更為直觀,提示NLRP3可能與PDR的發病機制密切相關[33]。Hao等[34]指出,NLRP3炎性小體激活增加了血液—視網膜屏障的通透性,其誘發和加重的炎性反應是參與DR各個病理階段的主要機制。

糖尿病周圍神經病變(diabetic pripheral neuropathy,DPN)是最常見的糖尿病并發癥,高血糖誘發的氧化應激和炎性反應發生,導致了周圍神經病變的出現。研究發現褪黑激素通過靶向miR-214-3p/Caspase-1軸抑制神經元細胞焦亡,從而起到保護神經的作用[35]。上述研究表明,細胞焦亡介入了糖尿病并發癥的發生和發展,針對NLRP3炎性小體及相關激活通路的治療研發具有無限潛能。

4 中醫藥對細胞焦亡的影響及其在糖尿病防治中的應用

中醫學理論強調整體觀念,《素問·生氣通天論篇》記載:“陰平陽秘,精神乃治,陰陽離決,精氣乃絕”,陰陽維持平衡才能保證人體正常的生命活動。細胞焦亡在本質上與人體陰陽相似,細胞焦亡“過盛”或“過衰”都會打破平衡引發疾病,而DM則是細胞焦亡過盛所致的結果。

4.1 中藥單體 人參皂苷Rb1(ginsenoside Rb1,GRb1)主要提取自人參、西洋參等的根、莖,由于其具有調控血糖,改善胰島素抵抗的作用,臨床常用于防治糖尿病及其并發癥[36]。張翕宇等[37]研究發現,GRb1能夠通過NLRP3/ GSDMD通路來抑制胰島細胞焦亡的發生。在高糖誘導的胰島素瘤細胞中,GSDMD 表達水平顯著增加,IL-1β釋放增多,并可明顯觀察到細胞腫脹等焦亡現象的出現。GRb1能夠抑制大鼠胰島素瘤細胞焦亡,下調NLRP3水平,抑制GSDMD表達,減少IL-1β釋放,從而保護胰島細胞功能,減輕炎性反應,發揮防治糖尿病的作用。大黃素是一種游離蒽醌類化合物,具有抗炎、抗氧化等主要作用。研究表明,大黃素可以抑制炎性因子IL-1β釋放及炎性小體NLRP3的激活,并抑制隨后出現的GSDMD裂解,防止INS-1細胞焦亡的發生[38]。不僅如此,過表達的NLRP3能夠逆轉大黃素的保護作用,因此得出結論:大黃素通過靶向NLRP3/GSDMD軸來調控高糖狀態下誘導的細胞焦亡,發揮治療DM的作用。雷公藤具有抗炎、抗氧化應激等生物活性[39],研究發現雷公藤多苷可顯著降低糖尿病腎病模型大鼠的血清IL-1β、IL-18水平,延緩腎臟組織病理改變,并抑制NLRP3、Caspase-1、GSDMD表達水平[40]。其改善炎性狀態、減輕腎臟病理損傷的機制與抑制NLRP3炎性小體激活進而調控細胞焦亡通路相關蛋白表達及炎性因子釋放密切相關。此外,研究證實大蒜素能夠通過抑制ROS/ NLRP3/ Caspase-1通路活化,進而改善腎組織細胞焦亡[41]。董雯等[42]通過構建肥胖小鼠認知障礙模型,發現白藜蘆醇可降低海馬組織中NLRP3的激活水平,同時抑制神經炎性反應的級聯效應,從而改善肥胖導致的細胞焦亡,并起到保護認知功能的作用。

4.2 中藥復方 黃連溫膽湯出自清代《六因條辨》,是臨床治療代謝綜合征的經典方劑,具有顯著的抗炎、降糖等作用。馬伯艷等[43]發現黃連溫膽湯含藥血清能夠通過抑制NLRP3激活的細胞焦亡,改善胰島素抵抗。通過構建了NLRP3過表達的IR-HepG2 細胞模型,并利用不同濃度的黃連溫膽湯含藥血清處理,檢測IL-1β和IL-18、NLRP3、Caspase-1及GSDMD的表達水平,證實黃連溫膽湯含藥血清在細胞焦亡中具有抑制炎性因子釋放及相關基因表達的作用,為臨床中胰島素抵抗及T2DM的防治提供了新的靶點。黃奡等[44]通過對補脾益腎、活血化瘀法對大鼠腎臟NLRP3/Casepase-1/ GSDMD/ IL-1β信號通路的研究發現,益腎康可有效緩解糖尿病大鼠的腎臟炎性損傷,主要方式是下調NLRP3、Casepase-1、IL-1β及GSDMD的表達水平,從而抑制腎臟細胞焦亡,起到保護腎臟細胞的功效。宋瑞婧等[45]發現加味升降散對DKD大鼠進行4周灌胃,可顯著降低大鼠腎組織TXNIP、NLRP3、Caspase-1 表達及炎性因子水平,表現出顯著的腎臟保護作用,其機制可能是通過抑制TXNIP/NLRP3軸蛋白表達,進而調控細胞焦亡有關。王美子等[46]通過葛根芩連湯加味方對糖尿病腎病大鼠焦亡及IR影響的研究發現,葛根芩連湯加味方能夠有效干預糖尿病腎病損傷大鼠的腎臟細胞焦亡,改善胰島素抵抗,但具體通路及作用方式,仍待于進一步探究。吳長江等[47]通過建立糖尿病周圍神經病變小鼠模型,證實糖絡寧能夠有效調控糖尿病周圍神經病變小鼠的坐骨神經細胞焦亡,實驗中糖絡寧高劑量組中的焦亡相關因子表達均較模型組明顯降低,同時沉默信息調節因子1(SIRT1)表達水平也明顯高于模型組,由此可見,糖絡寧通過促進SITR1表達,進而抑制坐骨神經細胞焦亡的發生,起到延緩糖尿病周圍神經病變的目的。烏梅丸是臨床治療糖尿病的經典處方之一,Yang等[48]經研究發現,烏梅丸治療自發性糖尿病模型小鼠,連續給藥4周,可顯著減低小鼠胰島素抵抗,一定程度逆轉了糖尿病小鼠的IL-1β和 IL-18的表達水平,有效抑制NLRP3、Caspase-1等其他焦亡相關分子的表達,從而保護胰島β細胞,對T2DM發生發展起到預防效果。

5 結語與展望

DM是一種慢性代謝性疾病,其疾病本身及各類并發癥始終是全世界學者關注的焦點,細胞焦亡介導的炎性反應在其中發揮著至關重要的作用。通過調控細胞焦亡通路相關蛋白,改善炎性反應的糖尿病防治手段獲得了一定成果,大量中藥單體以及中藥復方均能夠通過抑制NLRP3、Caspase-1表達,調控相關焦細胞焦亡通路,發揮防治DM及其并發癥的作用,這對于進一步探究細胞焦亡的分子機制,防治及研發特效藥物具有深遠的意義。

中醫藥防治DM具有多靶點、多途徑的優勢,基于細胞焦亡理論,中醫藥在治療腫瘤、心血管疾病、類風濕關節炎等疾病均展現出巨大潛力[49-51]。筆者認為,目前中醫藥防治DM及并發癥的研究仍存在幾點需要思考的問題。首先,現階段有關中醫藥防治DM及并發癥的文獻有限,大多集中在DM和DN。此外,有關中藥復方和中藥單體的文獻數據來源大多局限于基礎實驗,針對細胞焦亡通路的研究,也停留在NLRP3、Caspase-1、GSDMD等焦亡相關分子上,深度不足。可結合基因組學、生物信息學等多學科手段,深入挖掘其具體作用機制,利用非編碼RNA的調控作用,找到細胞焦亡的上游調控機制是一個可行的思路,這也是本團隊的下一步研究方向。

總而言之,中醫藥在防治DM及并發癥中的作用無法替代,未來隨著中醫藥靶向細胞焦亡防治DM及并發癥的機制被揭示,相關中藥新藥的研發必將具有無限光明的前景。