鎳紋蛋白樣β對(duì)脂多糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的抑制作用及其機(jī)制

曹紅，張小萌，許琮

1 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院綜合科，武漢 430030；2 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院腎內(nèi)科

膿毒血癥是ICU常見(jiàn)疾病，其引起的心臟損傷和心功能障礙是導(dǎo)致患者死亡和預(yù)后不良的主要原因之一。目前認(rèn)為，膿毒血癥引起的心臟炎癥可能與鐵死亡有關(guān)，而鐵死亡在心血管疾病尤其是急性心臟損傷中發(fā)揮重要作用［1-2］。鐵代謝異常可引起游離鐵（Fe2+）濃度增高，膜磷脂重構(gòu)使得細(xì)胞對(duì)過(guò)氧化連鎖反應(yīng)的敏感性增加，鐵介導(dǎo)的類Fenton反應(yīng)可促進(jìn)脂質(zhì)自由基和脂質(zhì)過(guò)氧化物的產(chǎn)生，脂質(zhì)過(guò)氧化物清除系統(tǒng)功能障礙導(dǎo)致其清除不足，這一系列過(guò)程最終引起脂質(zhì)過(guò)氧化物蓄積并引發(fā)細(xì)胞死亡［3］。因此，抑制心肌細(xì)胞鐵死亡可能是防治膿毒血癥心臟損傷的有效方法。鎳紋蛋白樣β（Metrnβ）是最近發(fā)現(xiàn)的一種由骨骼肌和脂肪組織產(chǎn)生的激素，在運(yùn)動(dòng)和冷暴露刺激下分泌增加［4］。Metrnβ通過(guò)在脂肪庫(kù)中誘導(dǎo)交替激活的巨噬細(xì)胞，以及促進(jìn)脂肪組織褐變來(lái)促進(jìn)能量消耗，與先天免疫、獲得性免疫和炎癥通路相關(guān)［5-8］。在冠心病患者中，血清Metrnβ水平與心血管事件及患者預(yù)后密切相關(guān)，并且可減輕腫瘤治療中與化療相關(guān)的心臟毒性［8］。2021年3月—2022年5月，本研究觀察了Metrnβ對(duì)脂多糖（LPS）誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的抑制作用，并探討是否與調(diào)控炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)及鐵死亡有關(guān)。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 細(xì)胞：H9c2心肌細(xì)胞購(gòu)自上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞典藏中心。主要試劑：DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司，MTT試劑盒購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，DCFH-DA熒光探針購(gòu)自美國(guó)Med Chem Express公司，抗鐵死亡蛋白谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4（Gpx4）活性試劑盒購(gòu)自美國(guó)Beyotime公司，心肌細(xì)胞損傷標(biāo)志物乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒購(gòu)自上海碧云天科技有限公司，炎癥反應(yīng)相關(guān)因子［腫瘤壞死因子α （TNF-α）、白細(xì)胞介素（IL）-1、IL-6］試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Biolegend公司，氧化反應(yīng)相關(guān)因子［活性氧（ROS）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）］試劑盒購(gòu)自上海碧云天科技有限公司，細(xì)胞炎癥信號(hào)分子Toll樣受體4（TLR4）抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.2 細(xì)胞分組及處理 將H9c2心肌細(xì)胞置于含有10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9c2細(xì)胞，將其分為L(zhǎng)PS組、Metrnβ組、Metrnβ+LPS組及對(duì)照組。LPS組、Metrnβ組、Metrnβ+LPS組分別給予1 mg/L LPS、200 ng/mL Metrnβ、1 mg/L LPS+200 ng/mL Metrnβ，對(duì)照組給予等體積PBS，作用12 h。

1.3 細(xì)胞活性檢測(cè) 采用MTT法。各組細(xì)胞分組處理后去除培養(yǎng)基，PBS清洗，每孔加入MTT溶液10 μL，室溫孵育30 min，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的光密度（OD）值。細(xì)胞增殖率=（OD實(shí)驗(yàn)孔-OD對(duì)照孔）/OD對(duì)照孔×100%。

1.4 細(xì)胞LDH、炎癥反應(yīng)相關(guān)因子檢測(cè) 采用ELISA法。取各組分組處理后的細(xì)胞，每孔加入裂解液50 μL，孵育15 min；收集裂解后的細(xì)胞，離心后吸取上清。使用試劑盒檢測(cè)細(xì)胞LDH、TNF-α、IL-1、IL-6表達(dá)，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.5 細(xì)胞氧化反應(yīng)相關(guān)因子及Gpx4活性檢測(cè) 采用ELISA法。將H9c2細(xì)胞以1×104/孔接種于96孔板，參照“1.2”進(jìn)行分組處理，每孔加入DCFH-DA熒光探針1 μL，室溫下孵育20 min，采用不含血清的DMEM培養(yǎng)基清洗。使用酶標(biāo)儀檢測(cè)各組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，以此表示ROS含量，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。將H9c2細(xì)胞以1×104/孔接種于6孔板，參照“1.2”進(jìn)行分組處理，加入SDS裂解液孵育30 min，收集細(xì)胞裂解液，離心后取上清，在酶標(biāo)儀下檢測(cè)OD值，以此表示MDA、GSH和Gpx4活性，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.6 細(xì)胞Fe2+檢測(cè) 采用總鐵比色法。取各組分組處理后的細(xì)胞，加入裂解液孵育15 min，收集裂解液，離心后取上清進(jìn)行樣本測(cè)定。標(biāo)準(zhǔn)孔中加入100 μL分析緩沖液，樣品孔中加入5 μL樣品并用分析緩沖液稀釋至100 μL/孔。在每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)孔中加入5 μL鐵還原劑，每個(gè)樣品孔中加入5 μL分析緩沖液，37 ℃條件下孵育30 min。加入Fe2+探針100 μL，室溫下避光孵育1 h。采用酶標(biāo)儀檢測(cè)各組在波長(zhǎng)593 nm處的OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算Fe2+含量，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.7 細(xì)胞TLR4、Gpx4蛋白檢測(cè) 采用Western blotting法。取各組分組處理后的細(xì)胞，加入SDS裂解液孵育30 min，收集細(xì)胞裂解液，離心后取上清，檢測(cè)蛋白濃度后定量為3 000 ng/mL。SDS-PAGE電泳蛋白樣本，轉(zhuǎn)膜后采用5%羊血清封閉1 h，加入抗TLR4、Gpx4及內(nèi)參GAPDH一抗（稀釋比例為1∶ 1 000），4 ℃溫孵過(guò)夜；加入二抗（稀釋比例為1∶ 1 000），室溫孵育1 h。加入顯影液進(jìn)行顯色反應(yīng)，凝膠系統(tǒng)掃描，Image J軟件分析條帶灰度值，計(jì)算TLR4及Gpx4蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料采用Shapiro-Wilk正態(tài)性檢驗(yàn)，呈正態(tài)分布以表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)采用重復(fù)測(cè)量的方差分析；非正態(tài)分布以M（P25，P75）表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖率比較 LPS組、Metrnβ+LPS組、Metrnβ組及對(duì)照組細(xì)胞增殖率分別為40.49% ±10.68%、72.68% ± 8.23%、102.86% ± 18.44%、100.00% ± 14.26%，與Metrnβ組、對(duì)照組比較，LPS組及Metrnβ+LPS組細(xì)胞增殖率均降低，且LPS組降低更明顯（P均＜0.05）。

2.2 各組細(xì)胞LDH、炎癥相關(guān)因子、氧化反應(yīng)相關(guān)因子及Gpx4表達(dá)比較 與Metrnβ組、對(duì)照組比較，LPS組及Metrnβ+LPS組細(xì)胞LDH、TNF-α、IL-1β、IL-6、ROS、MDA表達(dá)均升高，GSH、Gpx4表達(dá)均降低，且LPS組變化更明顯（P均＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組細(xì)胞LDH、炎癥相關(guān)因子、氧化反應(yīng)相關(guān)因子及Gpx4表達(dá)比較（）

表1 各組細(xì)胞LDH、炎癥相關(guān)因子、氧化反應(yīng)相關(guān)因子及Gpx4表達(dá)比較（）

注：與Metrnβ組及對(duì)照組比較，*P＜0.05；與LPS組比較，#P＜0.05。

組別LPS組Metrnβ+LPS組Metrnβ組對(duì)照組ROS（ng/L）28.83 ± 4.53*11.66 ± 3.50*#1.83 ± 0.98 2.00 ± 1.26 LDH（U/L）44.56 ± 10.88*19.01 ± 5.98*#7.43 ± 2.21 7.93 ± 1.59 TNF-α（ng/L）396.25 ± 48.87*167.76 ± 18.36*#10.85 ± 3.44 10.91 ± 4.15 IL-1β（ng/L）314.45 ± 51.88*101.10 ± 13.98*#8.35 ± 1.09 5.71 ± 2.65 IL-6（ng/L）308.56 ± 45.92*89.55 ± 16.45*#7.83 ± 1.93 11.36 ± 3.02 MDA（nmol/L）3.25 ± 0.81*1.52 ± 0.15*#0.71 ± 0.18 0.78 ± 0.12 GSH（nmol/mg）71.96 ± 10.97*129.36 ± 16.52*#180.05 ± 10.13 176.21 ± 11.21 Gpx4（μmol/g）53.00 ± 6.27*104.02 ± 12.79*#151.41 ± 10.93 147.90 ± 12.42

2.3 各組細(xì)胞Fe2+含量及TLR4、Gpx4蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 與Metrnβ組、對(duì)照組比較，LPS組及Metrnβ+LPS組細(xì)胞Fe2+含量升高、Gpx4蛋白相對(duì)表達(dá)量均降低，且LPS組變化更明顯（P均＜0.05）。與Metrnβ組、對(duì)照組及Metrnβ+LPS組比較，LPS組TLR4蛋白相對(duì)表達(dá)量升高（P均＜0.05）。見(jiàn)表2及圖1。

圖1 各組細(xì)胞TLR4、Gpx4蛋白表達(dá)條帶圖（Western blotting法）

表2 各組細(xì)胞Fe2+含量及TLR4、Gpx4蛋白表達(dá)比較（）

表2 各組細(xì)胞Fe2+含量及TLR4、Gpx4蛋白表達(dá)比較（）

注：與Metrnβ組及對(duì)照組比較，*P＜0.05；與LPS組比較，#P＜0.05。

組別LPS組Metrnβ+LPS組Metrnβ組對(duì)照組Fe2+（nmol/μg）0.39 ± 0.04*0.18 ± 0.04*#0.06 ± 0.01 0.09 ± 0.01 TLR4 1.42 ± 0.09*0.40 ± 0.08#0.38 ± 0.08 0.40 ± 0.08 Gpx4 0.46 ± 0.06*1.06 ± 0.08*#1.95 ± 0.18 2.03 ± 0.17

3 討論

膿毒血癥與全身炎癥反應(yīng)可引起多器官損傷，其中心功能不全是常見(jiàn)表現(xiàn)［9］。LPS是細(xì)菌的主要致病成分之一，也是膿毒血癥的強(qiáng)激活劑，可用于在動(dòng)物模型中誘導(dǎo)膿毒血癥［10］。本研究結(jié)果顯示，與Metrnβ組、對(duì)照組比較，LPS組細(xì)胞LDH升高、細(xì)胞增殖率降低，提示成功使用LPS誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷。Metrnβ是一種新的脂肪因子，在調(diào)控脂肪代謝、炎癥、免疫性疾病中發(fā)揮重要作用［10］。近期研究表明，血清Metrnβ水平與冠心病、糖尿病等疾病的發(fā)生密切相關(guān)［14-15］。本研究結(jié)果顯示，Metrnβ+LPS組細(xì)胞增殖率高于LPS組，細(xì)胞LDH低于LPS組，提示Metrnβ能夠減輕LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷，提高心肌細(xì)胞活性并減少LDH釋放。

鐵死亡被確定為膿毒血癥引起心臟損傷的主要致病機(jī)制之一［11］。鐵死亡區(qū)別于以往發(fā)現(xiàn)的死亡方式，表現(xiàn)為細(xì)胞膜完整、細(xì)胞內(nèi)無(wú)氣泡、細(xì)胞核大小正常，無(wú)染色質(zhì)凝聚，伴有特征性的線粒體縮小及膜密度增加［1］。多種因素導(dǎo)致的鐵代謝異常引起Fe2+含量增高，可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生鐵死亡［6］。QIU等［12］揭示了鐵死亡在心臟缺血再灌注（I/R）中的作用，并證實(shí)抑制鐵死亡可以減少I(mǎi)/R引起的心臟損傷。隨后研究發(fā)現(xiàn)，在心臟移植后再灌注引發(fā)的無(wú)菌性炎癥中，鐵死亡促進(jìn)了中性粒細(xì)胞的募集，加劇了心臟炎癥反應(yīng)［13］。Gpx4是調(diào)控鐵死亡的重要蛋白，Gpx4缺失可導(dǎo)致小鼠脂質(zhì)過(guò)氧化加重，心肌細(xì)胞鐵死亡增加。本研究結(jié)果顯示，與Metrnβ組、對(duì)照組比較，LPS組及Metrnβ+LPS組細(xì)胞Fe2+含量升高、Gpx4表達(dá)降低，且LPS組改變更明顯；這提示鐵死亡參與了LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷，而Metrnβ可以減輕LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞鐵死亡，從而減輕心肌細(xì)胞損傷。

鐵死亡是一個(gè)由多種機(jī)制調(diào)節(jié)的復(fù)雜過(guò)程。磷脂與多不飽和脂肪酰基尾部的過(guò)氧化被認(rèn)為是鐵死亡的主要驅(qū)動(dòng)因素［16］。既往研究已經(jīng)證明，鐵死亡的發(fā)生需要3個(gè)關(guān)鍵事件，即鐵積累、GSH耗竭和脂質(zhì)過(guò)氧化［17］。本研究結(jié)果顯示，LPS組細(xì)胞內(nèi)ROS及細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化的中間代謝產(chǎn)物MDA表達(dá)均高于對(duì)照組，抗氧化酶GSH表達(dá)低于對(duì)照組，提示LPS可促進(jìn)心肌細(xì)胞的氧化反應(yīng)。EL-ASHMAWY等［14］研究顯示，血清中低水平的Metrnβ與胰島素抵抗、內(nèi)皮功能損傷和動(dòng)脈粥樣硬化程度有關(guān)。此外，REBOLL等［5］研究發(fā)現(xiàn)，Metrnβ可以促進(jìn)人血管內(nèi)皮細(xì)胞血管生成，減少心肌梗死后心力衰竭的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，Metrnβ+LPS組細(xì)胞ROS、MDA表達(dá)均低于LPS組，GSH表達(dá)均高于LPS組，表明Metrnβ可減輕LPS引起的心肌細(xì)胞氧化反應(yīng)。

心肌細(xì)胞鐵死亡可增加損傷相關(guān)分子模式（DAMP）的釋放，DAMP可觸發(fā)先天免疫系統(tǒng)，從而加速細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。鐵死亡后TLR4的激活是細(xì)胞炎癥反應(yīng)加重的主要機(jī)制之一［18］。鐵死亡可促進(jìn)TLR4激活，并導(dǎo)致NF-κB從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，并隨后表達(dá)一系列炎癥因子，如TNF-α、IL-1β和IL-6［18］。研究發(fā)現(xiàn)，TLR4信號(hào)通路激活在膿毒血癥誘導(dǎo)的心臟損傷中發(fā)揮重要作用［19］。本研究結(jié)果顯示，LPS組細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-6及TLR4均表達(dá)高于對(duì)照組，提示LPS可促進(jìn)心肌細(xì)胞的氧化反應(yīng)。HU等［8］研究顯示，Metrnβ可以通過(guò)cAMP信號(hào)通路改善阿奇霉素導(dǎo)致的心肌損傷。REBOLL等［5］研究顯示，Metrnβ可以通過(guò)激活內(nèi)皮細(xì)胞上的KIT受體酪氨酸激酶，減輕心肌梗死損傷。本研究結(jié)果顯示，Metrnβ+LPS組細(xì)胞促炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6及TLR4表達(dá)均低于LPS組；這提示Metrnβ可通過(guò)抑制心肌細(xì)胞鐵死亡及鐵死亡誘導(dǎo)的TLR4表達(dá)升高，從而抑制心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)，減少各種促炎癥因子釋放及細(xì)胞死亡。

綜上所述，Metrnβ可以減輕LPS引起的心肌細(xì)胞損傷，其機(jī)制可能與減少細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)及鐵死亡有關(guān)，而鐵死亡又與氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，其具體的相互作用及調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。