補肺湯治療慢性阻塞性肺疾病的作用機制探討

焦玉潔，高智星，張曉誼

烏魯木齊市中醫醫院呼吸與危重癥醫學科，烏魯木齊 830000

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是目前老年患者中較為常見的慢性疾病，通過針對性制定治療方案能有效控制病情，而中西醫結合治療COPD已經被證實能更好地控制患者病情發展，降低COPD急性發作的可能［1-2］。中醫認為，陽虛痰瘀是COPD的病機，發病根本在于脾陽、肺陽兩虛，二者互為影響，而補肺湯是治療肺脾兩虛證的經典方劑。國內已經有研究顯示，補肺湯對于COPD具有較好的輔助治療效果［3-4］。但目前關于補肺湯治療COPD的有效成分及具體作用機制鮮見報道。2022年11月—2023年1月，本研究采用網絡藥理學方法分析補肺湯治療COPD的有效成分及作用靶點，為探討其具體的作用機制提供依據。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 補肺湯的有效成分及作用靶點篩選 在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）以及中國天然產物化學成分庫中，以補肺湯的組成中藥“人參、黃芪、熟地黃、五味子、紫菀、桑白皮”為關鍵詞，通過關鍵詞檢索法對有效成分進行初步篩選。同時基于TCMSP，在全網數據庫中對補肺湯作用靶點的相關文獻進行分析。基于Uniprot數據庫，將藥物有效成分經過口服利用度和類藥性轉化后的對應作用靶點與TCMSP數據庫搜索的補肺湯作用靶點合并以后刪除重復值，得到有效成分作用靶點。

1.2 補肺湯治療COPD的潛在基因篩選 在Gene Expression Omnibus（GEO）、Drugbank及Genecards數據庫中篩選COPD相關表達譜芯片數據集，時間截點為2022年5月，篩選條件為“Chronic obstructive pulmonary disease”，物種選擇“human”。利用R語言將GEO數據庫對COPD患者與健康人的基因表達譜數據的表達強度歸一化。利用R語言limma包篩選出COPD相關靶點，篩選條件：Log Fold Change＞2且P＜0.05。將COPD相關靶點與“1.1”得到的有效成分作用靶點取交集，得到補肺湯治療COPD的潛在基因。

1.3 補肺湯治療COPD的主要活性成分篩選 采用拓撲分析法，篩選補肺湯治療COPD的主要活性成分，基于Cytoscape 3.6. 0（http： //www. cytoscape.org/）軟件，建立補肺湯治療COPD的藥物、有效成分及靶點網絡相關圖，即疾病—藥物—主要活性成分—靶點網絡圖。

1.4 補肺湯治療COPD潛在基因的功能及相關信號通路分析 ①GO功能分析：對“1.2”中得到的補肺湯治療COPD的潛在基因進行GO功能富集分析，從生物學過程、細胞組分以及分子功能三個層面分析其功能，取P＜0.05且P值最小排序的前10個結果。②KEGG信號通路分析：將“1.2”中得到的補肺湯治療COPD的潛在基因輸入DAVID 6.8在線分析網站，而后對其進行KEGG信號通路分析，分析結果輸入R語言中，采用ggplot2包篩選出P＜0.05且相關性較高的信號通路。

1.5 作用靶點篩選 將補肺湯作用靶點以及COPD相關靶點輸入STRING數據庫，構建蛋白互作網絡（PPI）圖，剔除無相互作用的孤立蛋白，篩選標準：蛋白間相互作用得分＞0.4，篩選作用靶點。構建最終的PPI圖，并進行可視化處理，建立最終能反映補肺湯治療COPD的PPI圖。

2 結果

2.1 補肺湯的有效成分及作用靶點篩選結果 補肺湯的有效成分初步篩選出738種，其中人參210種、黃芪185種、熟地75種、五味子97種、紫菀63種、桑白皮108種；經過口服利用度和類藥性篩選后獲得人參的有效成分40種、黃芪27種、熟地9種、五味子19種、紫菀22種、桑白皮36種；其中，槲皮素、黃芪異黃烷苷、山奈酚、異鼠李素、刺芒柄花素、β-谷甾醇、谷甾醇、原阿片堿、3，9 -二甲氧基紫檀烷、7-甲基醚—青榆烯C為重要性排名前10位的有效成分，見表1。篩選得到有效成分的作用靶點141個。

表1 補肺湯重要性排名前10位的有效成分

2.2 補肺湯治療COPD的潛在基因篩選結果 在GEO、Drugbank及Genecards檢索后共收集到1 730個COPD相關靶點，與2.1篩選得到的141個有效成分作用靶點取交集，共得到補肺湯治療COPD的潛在基因80個。韋恩圖見OSID碼圖1。

2.3 補肺湯治療COPD的主要活性成分篩選結果 槲皮素、黃芪異黃烷苷及山奈酚等成分可能是補肺湯治療COPD的主要活性成分。疾病—藥物—主要活性成分—靶點網絡圖見OSID碼圖2。

2.4 補肺湯治療COPD潛在基因的GO功能分析結果 從生物學過程、細胞組分以及分子功能三個層面，共計篩選出30個排名靠前的差異顯著富集條目，主要涉及炎癥反應、細胞凋亡、細胞增殖、氧化還原等。見OSID碼圖3。

2.5 補肺湯治療COPD潛在基因的KEGG信號通路富集分析結果 共富集得到20條差異顯著的信號通路（P均＜0.05），其中排名前10位的分別是細胞衰老途徑、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路、細胞周期循環途徑、神經營養蛋白信號通路、細胞凋亡途徑、Th17細胞分化途徑、FoxO信號通路、PI3K/AKT信號通路、Rap1信號通路、Ras信號通路。見OSID碼圖4。

2.6 補肺湯治療COPD的作用靶點篩選結果 篩選后作用靶點包括絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、熱休克蛋白90α家族A類成員1（HSP90AA1）、禽肉瘤病毒17的轉化基因（JUN）、表皮生長因子受體（EGFR）、腫瘤壞死因子（TNF）、cAMP依賴性蛋白激酶α催化亞基（PRKACA）、腫瘤蛋白53（TP53）、雌激素受體1（ESR1）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK14）、絲裂原活化蛋白激酶8（MAPK8）。PPI圖見OSID碼圖5。

3 討論

COPD屬于中醫“喘癥”“肺脹”范疇，對于其穩定期患者常見證型是肺腎兩虛證，其臨床表現為氣喘憋氣、動則加重、氣不得續、腰膝酸軟、咳嗽咳痰。臨床上多選用補肺湯主治肺腎兩虛證COPD，該方出自《永類靈方》，主要功效是補肺益氣、納腎平喘、止咳化痰。方中人參為君藥，可益氣、補五臟之氣；黃芪歸脾經，補氣健脾生氣；熟地歸腎經，可補腎氣；五味子歸肝經，可酸溫斂肝、疏肝氣；紫菀歸肺經，為肺經引經藥物，可斂肺止咳；桑白皮歸肺經，瀉肺平喘，利水消腫。六味藥物協同，可達到補肺納腎、益氣止咳平喘之功，有助于提升COPD患者的肺功能，改善臨床癥狀，提高生活質量。網絡藥理學是從系統水平角度出發，基于網絡觀點分析藥物種類、具體化學成分、作用靶點之間關系的研究策略，該方法與中醫的整體觀點類似［5-6］。目前國內外有大量研究使用該方法對單味藥物及藥方進行研究，有助于深入地了解中藥治療疾病的具體作用機制［7-8］。研究顯示，補肺湯能降低氣道炎癥反應，減少局部氣道痰液分泌，提升免疫功能，增強抵抗力，對于COPD具有一定的輔助治療作用［9］。但目前關于補肺湯治療COPD的有效成分及作用靶點尚未可知。

本研究通過網絡藥理學的方法，從補肺湯的6味中藥中獲取了141個有效成分，在建立拓撲分析網絡后發現，槲皮素、黃芪異黃烷苷及山奈酚等成分可能是本方發揮作用的主要活性成分，其中槲皮素、黃芪異黃烷苷、山奈酚、異鼠李素、刺芒柄花素均是類黃酮化合物。研究顯示，黃酮類化合物可以通過降低NF-κB通路中κB蛋白、IκB激酶及MAPK通路中ERK、p38蛋白表達，從而抑制上述通路參與的腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素（IL）-1及IL-6等炎癥因子激活，最終減輕COPD氣道重塑，避免病情進展［10-11］。本研究發現，人參的重要成分原阿片堿也是對COPD作用較顯著的成分之一，但目前臨床上對于阿片類藥物應用于COPD的治療尚存在一定爭議，故需要進一步研究予以證實［12］。β-谷甾醇及豆甾醇均屬于醇類化合物，可通過抑制黃酸誘導基因Ⅰ（RIG-Ⅰ）激活，減少STAT信號表達，進而導致干擾素刺激基因因子3（ISGF3）復合物的轉錄活性降低，最終使得干擾素致敏細胞促炎癥放大作用減弱，發揮降低COPD氣道局部炎癥的作用［13-14］。

從本研究GO功能富集分析結果可以推測，補肺湯治療COPD并非單一途徑或單一作用點，而其中主要途徑還是控制炎癥反應。本研究KEGG分析結果顯示，細胞衰老是導致慢性肺部疾病發生的主要病因。BARNES等［15］研究顯示，COPD等慢性肺部疾病可以激活p53和p16INK4a，從而激活p21CIP1，并導致細胞周期停滯，是導致細胞衰老的主要原因。氧化應激反應也是引發細胞衰老的關鍵因素，會導致炎癥反應進一步加劇，而補肺湯中的人參及半夏均被證實對于抑制細胞衰老、改善細胞周期具有一定作用［16-17］。研究顯示，NF-κB和FoxO在COPD患者血清中高表達，而NF-κB可以促進FoxO激活，從而導致肺支氣管壁中的微結構發生自噬，引起氣管壁細胞凋亡［18］。補肺湯中的主要成分對于NF-κB通路具有抑制作用，因此對于FoxO表達也有一定的抑制作用。Rap1/Ras/PI3K/AKT通路是誘導細胞凋亡的主要途徑，還能促進IL、TNF、干擾素等炎癥因子生成，同時上述傳導通路相互影響，從而構建起炎癥反應關系網，進一步促進局部炎癥反應增加，最終導致COPD的病程進展［19-20］。Th17/Treg平衡是影響體內炎癥反應的重要因素，而Th17細胞分化是導致Th17/Treg平衡改變的主要因素之一。研究顯示，補肺湯中人參的主要成分人參皂甙對于Th17/Treg平衡具有重要影響［21］。本研究結果顯示，Th17細胞分化是補肺湯影響COPD的途徑之一，但具體作用機制尚未可知，可以作為今后的研究重點。

在本研究最終建立的PPI圖中，補肺湯的作用靶點包括MAPK1、HSP90AA1、JUN、EGFR、TNF、PRKACA、TP53、ESR1、MAPK14、MAPK8。正如之前所述，補肺湯中的類黃酮物質及β-谷甾醇等對MAPK表達具有抑制作用，PPI圖顯示MAPK1、MAPK8、MAPK14正是補肺湯的作用靶點。TNF是介導體內炎癥反應的重要基因，其中TNF-α是導致IL釋放并促使局部炎癥反應加重的重要原因。研究顯示，補肺湯能降低COPD患者血清TNF-α水平，說明TNF可能是補肺湯的主要作用靶點［22］。HSP90AA1是熱休克蛋白家族成員之一，其在COPD患者體內表達發生改變，還能影響單核細胞內TNF的釋放，從而影響局部炎癥反應［23］。PRKACA、JUN、EGFR、TP53、ESR1是參與影響細胞增殖過程的重要基因。研究顯示，在COPD的病理改變過程中，成纖維細胞增殖是氣道重塑的重要原因［24］。本研究結果顯示，補肺湯可能通過抑制PRKACA、JUN、EGFR、TP53、ESR1表達，來阻止成纖維細胞增殖，從而達到抑制氣道重塑的作用，但其具體機制仍需要進一步明確。

綜上所述，補肺湯治療COPD的有效成分是槲皮素、山奈酚等，可能通過MAPK1、HSP90AA1、JUN等作用靶點調控細胞衰老途徑、MAPK信號通路、細胞凋亡途徑等而發揮作用。本研究通過網絡藥理學方法對補肺湯作用于COPD的具體機制進行了較為詳盡的分析，利用有效成分、基因及作用途徑等客觀數據對補肺湯的作用機制進行了闡述，為開展實驗室研究提供了有效的參考，便于今后臨床進一步對補肺湯開展動物或人體實驗。