基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與動物實驗探究桂花醇提物對慢性腦缺血神經(jīng)損傷的保護(hù)作用及機(jī)制

程 芳，張 杰，胡加成，徐 歡，先勁燃，謝興亮，盛艷梅

? 藥理與臨床 ?

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與動物實驗探究桂花醇提物對慢性腦缺血神經(jīng)損傷的保護(hù)作用及機(jī)制

程 芳，張 杰，胡加成，徐 歡，先勁燃，謝興亮*，盛艷梅*

成都醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，四川 成都 610500

基于磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）通路探究桂花醇提物抗慢性腦缺血性神經(jīng)損傷的保護(hù)作用與機(jī)制。借助文獻(xiàn)檢索、TCMSP、BATMAN數(shù)據(jù)庫篩選桂花活性成分及靶點；OMIM、GeneCards疾病數(shù)據(jù)庫檢索疾病靶點。取交集靶點構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)。借助DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）功能和京都基因和基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，并建立“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)。采用右側(cè)頸總動脈結(jié)扎法建立慢性腦缺血小鼠模型，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、腦絡(luò)通（195 mg/kg）組和桂花醇提物低、高劑量（125、375 mg/kg）組。采用曠場實驗評價各組小鼠自發(fā)能力及探索行為；檢測各組小鼠海馬組織膽堿乙酰化酶（choline acetylase，ChAC）和膽堿酯酶（cholinesterase，ChE）水平；采用蘇木素-伊紅（HE）和TUNEL染色觀察腦組織病理結(jié)構(gòu)變化及神經(jīng)元凋亡情況；采用Western blotting檢測海馬組織PI3K/Akt信號通路及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選得到12種桂花活性成分及潛在靶點289個，慢性腦缺血疾病靶點3014個，桂花與慢性腦缺血的交集靶點198個，其中AKT1、血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein-asparate protease-3，Caspase-3）等為核心靶點。通過KEGG和GO分析進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能是桂花發(fā)揮慢性腦缺血神經(jīng)保護(hù)的重要途徑。采用右側(cè)頸總動脈結(jié)扎法復(fù)制慢性腦缺血小鼠模型，結(jié)果顯示，桂花醇提物可顯著升高腦組織ChAC水平（＜0.001），降低ChE水平（＜0.001），增強(qiáng)中樞膽堿系統(tǒng)功能；明顯提高腦缺血小鼠站立次數(shù)及中央?yún)^(qū)域運動距離（＜0.001），以改善認(rèn)知等神經(jīng)功能障礙，并抑制缺血區(qū)腦組織的神經(jīng)元凋亡（＜0.001）。其作用機(jī)制與調(diào)控PI3K/Akt信號通路，上調(diào)p-PI3K、p-Akt、B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）蛋白表達(dá)（＜0.05、0.01），同時下調(diào)促凋亡細(xì)胞色素C（cytoehrome C，Cyt-C）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）、cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)相關(guān)（＜0.01）。桂花醇提物可有效抑制腦缺血性神經(jīng)細(xì)胞損傷，改善神經(jīng)功能障礙，其腦神經(jīng)保護(hù)作用與調(diào)控PI3K/Akt通路、抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)。

桂花醇提物；慢性腦缺血；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；毛蕊花糖苷；紅景天苷；細(xì)胞凋亡；PI3K/Akt通路

慢性腦缺血是大腦灌注不足所引起的腦功能障礙疾病[1]。近年來，慢性腦缺血的患病率逐年攀升，其引發(fā)進(jìn)展性的認(rèn)知、學(xué)習(xí)、記憶能力下降使患者及家屬的生命質(zhì)量都受到巨大沖擊[2]。然而，目前臨床治療慢性腦缺血尚缺乏理想藥物。慢性腦缺血起病慢、防治時間長，及早識別和干預(yù)可以有效地阻止疾病的發(fā)展，提高患者生活質(zhì)量。研究表明，慢性腦缺血的病理機(jī)制十分復(fù)雜，包括神經(jīng)細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激、炎性損傷等[3]。長期腦組織血流量低灌注引發(fā)神經(jīng)元死亡，細(xì)胞凋亡便是其中主要的死亡形式，而腦白質(zhì)和海馬CA1區(qū)的神經(jīng)元凋亡又將引起認(rèn)知、學(xué)習(xí)記憶功能障礙[4]。因此抑制或減少腦缺血后的神經(jīng)元凋亡，對恢復(fù)缺血后神經(jīng)功能至關(guān)重要。

桂花屬藥食同源類中藥[5]，目前對其資源開發(fā)主要集中在浸膏、精油和食材應(yīng)用方面，而對于其藥用價值還缺乏深入探討[6]。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，桂花性溫，味辛、無毒，富含多種芳香成分，具芳香開竅藥的特性[7]。芳香開竅藥易通過血腦屏障、改善腦微循環(huán)、減輕腦水腫等途徑抵抗腦缺血損傷，已成為治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的常用藥物[5,8]。已有研究報道桂花醇提物可有效改善半乳糖引起的小鼠記憶力減退現(xiàn)象，并抑制小鼠大腦中神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）、神經(jīng)營養(yǎng)因子-3（neurotrophin-3，NT-3）的產(chǎn)生，從而發(fā)揮神經(jīng)損傷的保護(hù)作用[9]。Lee等[10]研究表明桂花醇提物可通過抗氧化作用保護(hù)大鼠皮層神經(jīng)元免受6-羥多巴胺（6-hydroxydopamine，6-OHDA）和谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷。此外，桂花醇提物中的苯乙醇苷也能有效抵抗氯化鈷誘導(dǎo)的PC12神經(jīng)細(xì)胞缺氧損傷[11]。目前關(guān)于桂花抗缺血損傷的機(jī)制尚未闡明，其藥用價值的開發(fā)與應(yīng)用受限。基于以上研究推測桂花醇提物或能成為改善慢性腦缺血神經(jīng)損傷的潛力藥物。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一門從多層次、多角度分析藥物與疾病關(guān)系，預(yù)測活性藥物靶點、作用機(jī)制等問題的新興學(xué)科[12]。本研究擬借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探究桂花治療慢性腦缺血的活性成分及作用靶點，并結(jié)合動物實驗評價桂花醇提物對慢性腦缺血小鼠神經(jīng)損傷的主要保護(hù)機(jī)制，為后期桂花相關(guān)產(chǎn)品的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 數(shù)據(jù)庫

TCMSP2.3數(shù)據(jù)庫（http://tcmspw.com/tcmsp. php）、SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫（http:// swisstargetprediction.ch/）、BATMAN數(shù)據(jù)庫（http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/index.php）、OMIM數(shù)據(jù)庫（https://www.omim.org）、GeneCards數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org）、VENNY2.1數(shù)據(jù)庫（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny）、STRING數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org）、DAVID數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov）。

1.2 動物

SPF級雄性KM小鼠60只，體質(zhì)量18～25 g，購自成都達(dá)碩實驗動物有限公司，許可證號SCXK（川）2020-030，飼養(yǎng)于成都醫(yī)學(xué)院動物實驗中心，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后進(jìn)行實驗。動物實驗遵守成都醫(yī)學(xué)院動物倫理委員會的倫理要求（批準(zhǔn)號：成醫(yī)動倫[2022]第015號）。

1.3 藥品與試劑

桂花購自廣西桂林，經(jīng)成都醫(yī)學(xué)院中藥學(xué)教研室游元元教授鑒定為木犀科木犀屬植物木犀(Thunb.) Lour.的花；腦絡(luò)通膠囊（批號20210601）購自廣東云方制藥有限公司；RIPA裂解液（批號P0013B）、PMSF（100 mmol/L，批號ST506）、磷酸酶抑制劑（批號P1082）、一抗稀釋液（批號P0023A）、二抗稀釋液（批號P0023D）、剪切型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cleaved cystein-asparate protease-3，cleaved Caspase-3）抗體（批號AF1150）購自上海碧云天生物科技有限公司；膽堿酯酶（cholinesterase，ChE）試劑盒（批號20211221）、膽堿乙酰化酶（choline acetylase，ChAC）試劑盒（批號2021220）購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（批號C1088）購自上海碧云天生物科技有限公司；磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）抗體（批號20584-1-AP）、p-PI3K抗體（批號10176-2-AP）、蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）抗體（批號60203-2-Ig）、p-Akt抗體（批號66444-1-lg）、細(xì)胞色素C（cytochrome-C，Cyt-C）抗體（批號10993-1-AP）、B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）抗體（批號26593-1-AP）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗體（批號60267-1-lg）、β-actin抗體（批號66009-1-Ig）購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗（批號BA1054）、山羊抗鼠二抗（批號BA1050）購自武漢博士德生物工程有限公司；水合氯醛（批號190420）購自成都市科龍化工試劑廠；注射用青霉素鉀（批號20190102）購自江西省科達(dá)動物藥業(yè)有限公司。

1.4 儀器

OFT-100型大小鼠曠場活動實驗系統(tǒng)（成都泰盟軟件有限公司）；Varioskan Flash酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；JW-2018H型離心機(jī)（安徽嘉文儀器裝備有限公司）；16030929型高通量快速勻漿器（美國MP Biomedicals公司）；電泳儀、成像系統(tǒng)儀（美國Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

2.1.1 獲取桂花活性成分及潛在靶點 通過TCMSP2.3數(shù)據(jù)庫，選擇以“Herb name”和“桂花”為檢索詞，將桂花活性成分篩選條件設(shè)為口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18，并將候選生物活性化合物2D結(jié)構(gòu)的SDF文檔導(dǎo)入SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫，以確定桂花活性成分的靶點。再利用BATMAN數(shù)據(jù)庫，選擇“Herb or Herb list”以“GUI HUA”為關(guān)鍵詞，篩選條件設(shè)置為Score cutoff≥20、＜0.05，篩得桂花的活性成分及作用靶點。通過文獻(xiàn)檢索補充已報道且有藥理作用的桂花活性成分，進(jìn)入化源網(wǎng)搜索得到其英文名，再進(jìn)入PubChem輸入其英文名得到相關(guān)SMILES號。打開SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫，將PubChem得到的SMILES號輸入，點擊預(yù)測即可得到化合物相關(guān)靶點。將上述數(shù)據(jù)庫結(jié)果匯總、去重，建立桂花活性成分-靶點數(shù)據(jù)集。

2.1.2 獲取慢性腦缺血疾病靶點 以“chronic cerebral ischemia”為關(guān)鍵詞，檢索疾病數(shù)據(jù)庫（OMIM、GeneCards）中的疾病靶點，將2個數(shù)據(jù)庫結(jié)果合并、去重，所得結(jié)果即為慢性腦缺血疾病靶點數(shù)據(jù)集。

2.1.3 獲取桂花與慢性腦缺血交集靶點并構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò) 將桂花和慢性腦缺血的潛在靶點導(dǎo)入VENNY2.1以獲取交集靶點。將得到的交集靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，選擇交互作用閾值＞0.4，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖。獲得TSV格式文件，并將其導(dǎo)入Cytoscape軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓樸分析。

2.1.4 桂花與慢性腦缺血交集靶點的基因本體（gene ontology，GO）功能及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析 在線打開DAVID數(shù)據(jù)庫，將核心靶點導(dǎo)入到數(shù)據(jù)庫中，選擇官方基因名稱，物種限定為“Homo sapiens”，分析背景選擇為“Homo sapiens”，分別進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路分析并整理所得數(shù)據(jù)。獲得顯著富集且與慢性腦缺血相關(guān)的通路及生物學(xué)過程，＜0.05表示具有統(tǒng)計學(xué)意義，按基因數(shù)進(jìn)行排序，篩選出具有顯著差異的生物過程和可靠的靶點通路，在線打開微生信繪圖網(wǎng)站繪制柱狀圖和氣泡圖，并將所得的通路構(gòu)建“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)。

2.2 桂花醇提物對慢性腦缺血小鼠的保護(hù)作用及機(jī)制研究

2.2.1 桂花醇提物的制備 桂花醇提物由成都醫(yī)學(xué)院國家中醫(yī)藥管理局中藥藥劑學(xué)二級實驗室制備提供。稱取200 g桂花，加入95%乙醇2400 mL，回流提取3 h，200目濾布濾過，提取液50 ℃減壓濃縮至相對密度為1.05（50 ℃）的清膏，冷凍干燥得桂花乙醇提取物64.1 g（即1 g提取物相當(dāng)于3.12 g桂花生藥），采用高效液相色譜法測得其中毛蕊花糖苷、紅景天苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為30.03%、5.21%。

2.2.2 慢性腦缺血模型復(fù)制、分組及給藥 采用右側(cè)頸總動脈結(jié)扎法制作慢性腦缺血小鼠模型[13]，模型復(fù)制成功評判標(biāo)準(zhǔn)[14]：①結(jié)扎后小鼠右眼變?yōu)闇\白色，自然蘇醒后，右眼半閉且顏色轉(zhuǎn)變成微紅；②激光散斑血流檢測小鼠右側(cè)腦血流較左側(cè)下降20%～30%，將造模符合標(biāo)準(zhǔn)的小鼠納入研究。小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、腦絡(luò)通（195 mg/kg）組和桂花醇提物低、高劑量（125、375 mg/kg）組，每組10只。腦絡(luò)通膠囊成人給藥劑量為1.5～3 g/d，取1.5 g/d；桂花取人用生藥量3、9 g[15]，成人體質(zhì)量以70 kg計，依據(jù)人與小鼠體表面積換算系數(shù)得到小鼠桂花低、高劑量組生藥量分別390、1170 mg/kg。并根據(jù)提取物得率（即1 g桂花相當(dāng)于0.32 g提取物）換算得到小鼠的給藥劑量分別為125、375 mg/kg。各給藥組連續(xù)30 d ig相應(yīng)藥物（10 mL/kg），假手術(shù)組和模型組ig等體積的生理鹽水。

2.2.3 神經(jīng)行為評價 給藥結(jié)束后，采用大小鼠曠場活動實驗系統(tǒng)評估各組小鼠自發(fā)行為及探索行為。曠場箱底部由40 cm×40 cm的光滑黑板構(gòu)成，側(cè)壁由高40 cm的光滑黑板構(gòu)成，配有動物行為學(xué)數(shù)據(jù)自動采集和處理系統(tǒng)。數(shù)碼攝像頭置于曠場箱正上方1 m處，用于記錄小鼠整個曠場箱視野內(nèi)的運動影像。曠場實驗參考文獻(xiàn)方法[16]，將底部20 cm×20 cm的正方形區(qū)域劃分為中央?yún)^(qū)，小鼠放入中央?yún)^(qū)的格子，打開攝像頭開始計時。每只小鼠實驗時間5 min，第1分鐘為適應(yīng)時間，不進(jìn)行計數(shù)，第2分鐘開始計錄小鼠在4 min內(nèi)的站立次數(shù)及中央?yún)^(qū)域運動距離，連續(xù)測試3 d。

2.2.4 蘇木素-伊紅（HE）染色觀察腦組織病理變化 曠場實驗結(jié)束后，小鼠ip 10%水合氯醛麻醉后斷頭后取腦，置4%多聚甲醛浸泡1周固定，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察腦組織海馬區(qū)細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化并拍攝圖片。

2.2.5 TUNEL染色觀察腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況 腦組織經(jīng)固定、包埋、切片后，按照TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，在200倍光鏡下，觀察大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況，統(tǒng)計正常及凋亡神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量，計算細(xì)胞凋亡率。

細(xì)胞凋亡率＝細(xì)胞凋亡數(shù)/(細(xì)胞凋亡數(shù)＋正常細(xì)胞數(shù))

2.2.6 小鼠海馬組織ChAC和ChE含量檢測 小鼠處死后，迅速取腦，冰上剝離海馬組織，加入預(yù)冷的生理鹽水，冰浴條件下勻漿處理，3000 r/min離心10 min，取上清按照試劑盒說明書進(jìn)行檢測。

2.2.7 Western blotting檢測海馬組織PI3K/Akt信號通路及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) 取各組小鼠海馬組織，加入RIPA裂解液（RIPA∶PMSF∶磷酸酶抑制劑100∶1∶1），提取總蛋白，BCA法測定蛋白含量。蛋白樣品經(jīng)12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1.5 h，加入一抗，4 ℃過夜孵育；TBST洗膜后，加入二抗（1∶5000），37 ℃孵育1.5 h；TBST洗膜后，結(jié)合ECL化學(xué)發(fā)光法顯影，凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，Image J軟件進(jìn)行分度值分析。

2.3 統(tǒng)計學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果

3.1.1 桂花活性成分-慢性腦缺血潛在靶點及PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過TCMSP、BATMAN數(shù)據(jù)庫及文獻(xiàn)檢索共檢索到桂花活性成分12種（表1），可能作用于289個潛在靶點。從OMIM、GeneCards數(shù)據(jù)庫獲得的3014個慢性腦缺血相關(guān)靶點，通過Venn圖對桂花成分靶點與慢性腦缺血疾病靶點進(jìn)行映射，得二者交集靶點198個（圖1-A）。將交集靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，選擇交互作用閾值＞0.4，去除游離節(jié)點，借助Cytoscape軟件得到包含198個節(jié)點、2207條邊的PPI網(wǎng)絡(luò)（圖1-B），再按度值大小篩選前20個靶點作為核心靶點，得到包含20個節(jié)點、323條邊的核心靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖，其中核心靶點分別為AKT1、血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、非受體酪氨酸激酶（sarcoma receptor coactivator，SRC）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（cystein-asparate protease-1，CASP1）、CASP3等（圖1-C）。

表1 桂花活性成分

Table 1 Active ingredients of O. fragrans

編號成分OB/%DL GH1柚皮素42.360.21 GH21-羥基-2,3,5-三甲氧基呫噸酮101.060.30 GH36-羥基山柰酚62.130.27 GH4黃芩苷33.520.21 GH5芒柄花素69.670.21 GH6山柰酚41.880.24 GH7木犀草素36.160.25 GH8槲皮素46.430.28 GH9*毛蕊花糖苷2.940.62 GH10*紅景天苷7.010.20 GH11*異類葉升麻苷1.520.66 GH12*松果菊苷3.140.38

*基于文獻(xiàn)檢索補充已報道的桂花活性成分

*supplement the reported active ingredients ofbased on literature

3.1.2 桂花的GO功能與KEGG通路富集分析 在線打開DAVID數(shù)據(jù)庫，導(dǎo)入20個“桂花-慢性腦缺血”共同靶點，分別從生物過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）、細(xì)胞組成（cellular component，CC）3個方面進(jìn)行功能富集分析，根據(jù)基因數(shù)進(jìn)行排序，對富集結(jié)果排名靠前且＜0.05的條目進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，桂花治療慢性腦缺血靶點的生物過程與細(xì)胞凋亡過程的負(fù)調(diào)節(jié)、RNA聚合酶II啟動子轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)節(jié)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)磷酸化的正向調(diào)節(jié)等相關(guān)，細(xì)胞組分主要富集于細(xì)胞質(zhì)、質(zhì)膜、胞質(zhì)、核、核質(zhì)、膜筏等，分子功能則與蛋白質(zhì)結(jié)合、酶結(jié)合、蛋白激酶活性等密切相關(guān)（圖2-A）。KEGG結(jié)果顯示共有131條信號通路被顯著富集，包括癌癥通路、PI3K/Akt信號通路、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥、VEGF信號通路、催乳素信號通路、Ras信號通路、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）信號通路等（圖2-B）。將結(jié)果可視化構(gòu)建“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)（圖2-C）。

圖1 桂花成分靶點與慢性腦缺血疾病靶點交集Venn圖 (A)、桂花與慢性腦缺血共同靶點PPI網(wǎng)絡(luò)及核心網(wǎng)絡(luò)(B)、度值排名前20位的核心靶點(C)

3.2 桂花醇提物對慢性腦缺血小鼠的神經(jīng)保護(hù)作用

3.2.1 桂花醇提物對慢性腦缺血小鼠神經(jīng)行為的影響 曠場實驗結(jié)果（表2）顯示，腦缺血模型小鼠出現(xiàn)抑郁情緒及探索能力減弱等認(rèn)知功能障礙，表現(xiàn)為站立次數(shù)及中央?yún)^(qū)域運動距離顯著減少（＜0.001）；與模型組比較，桂花醇提物能明顯提高小鼠的站立次數(shù)與中央?yún)^(qū)域運動距離（＜0.01、0.001），提示其能有效改善小鼠的抑郁情緒。同時曠場運動軌跡結(jié)果（圖3）顯示，模型小鼠活動具邊緣周圍活動傾向，而桂花醇提物可提高小鼠向中央?yún)^(qū)域探索的能力，改善其認(rèn)知功能。

圖2 桂花治療慢性腦缺血靶點的GO功能 (A)、KEGG通路富集分析(B) 和“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)(C)

表2 桂花醇提物對慢性腦缺血小鼠神經(jīng)行為的影響(, n = 10)

與假手術(shù)組比較：###＜0.001；與模型組比較：**＜0.01***＜0.001，下表同

###< 0.001sham group;**< 0.01***< 0.001model group, same as below tables

圖3 各組小鼠曠場實驗運動軌跡

3.2.2 桂花醇提物對慢性腦缺血小鼠海馬組織ChE和ChAC水平的影響 如表3所示，與假手術(shù)組比較，模型組小鼠海馬中ChE水平顯著升高（＜0.001），ChAC水平顯著降低（＜0.001）；與模型組比較，桂花醇提物高、低劑量組可通過升高ChAC水平（＜0.001），降低ChE水平（＜0.001），增強(qiáng)中樞膽堿系統(tǒng)功能，改善認(rèn)知功能障礙。

3.2.3 桂花醇提物對慢性腦缺血小鼠海馬組織病理變化的影響 如圖4所示，假手術(shù)組海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整、排列緊密且規(guī)則，染色均勻。模型組海馬神經(jīng)細(xì)胞較多出現(xiàn)形態(tài)異常呈不規(guī)則梭形，細(xì)胞核固縮深染。桂花醇提物可不同程度地減少海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷，其中高劑量組藥效更明顯。

表3 桂花醇提物對慢性腦缺血小鼠海馬組織ChE和ChAC水平的影響(, n = 7)

紅色箭頭代表受損海馬神經(jīng)細(xì)胞

3.2.4 桂花醇提物對慢性腦缺血小鼠大腦皮層神經(jīng)元凋亡率的影響 如圖5和表4所示，與假手術(shù)組比較，模型組小鼠大腦皮層神經(jīng)元TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量增多，凋亡率顯著升高（＜0.001）；與模型組比較，桂花醇提物可有效減少腦缺血小鼠腦皮層TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)，抑制細(xì)胞凋亡（＜0.001）。

圖5 桂花醇提物對慢性腦缺血小鼠腦組織神經(jīng)元凋亡的影響(×200)

表4 桂花醇提物對慢性腦缺血小鼠腦組織神經(jīng)元凋亡率的影響(, n = 5)

3.2.5 桂花醇提物對慢性腦缺血小鼠海馬組織PI3K/Akt信號通路及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 如圖6所示，與假手術(shù)組比較，模型組小鼠海馬組織p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt值顯著降低（＜0.05），Cyt-C蛋白表達(dá)水平明顯升高（＜0.001）；與模型組比較，桂花醇提物高、低劑量組p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt值顯著升高（＜0.05、0.01），桂花醇提物高劑量組Cyt-C蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.01）。

如圖7所示，與假手術(shù)組比較，模型組Bcl-2/Bax值及Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低（＜0.05、0.01），Bax和cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯升高（＜0.01、0.001）；與模型組比較，桂花醇提物高、低劑量組Bcl-2/Bax值和Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯升高（＜0.05、0.01），Bax和cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯降低（＜0.01）。

與假手術(shù)組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，圖7同

圖7 桂花醇提物對慢性腦缺血小鼠海馬組織Bcl-2、Bax和cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)的影響(, n = 3)

4 討論

近年來，慢性腦缺血患者的數(shù)量大量增加。不同年齡階段統(tǒng)計的慢性腦缺血發(fā)病率顯示，80歲及以上老人占80%，60歲及以上發(fā)病率為70%，45～50歲中也有1/4的人存在慢性腦缺血癥狀。由此可見，該病發(fā)生率趨向年輕化，重視和有效防治慢性腦缺血是當(dāng)前亟待解決的問題[17]。目前，中藥通過多靶點、多途徑的整體調(diào)控治療腦缺血已凸顯出顯著優(yōu)勢。桂花富含多種芳香成分[7]，味辛，具有發(fā)散、行氣、活血等作用特點，易通過血腦屏障、改善腦微循環(huán)等途徑抵抗腦缺血神經(jīng)損傷，但其治療慢性腦缺血的具體分子機(jī)制尚不明確，因此本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究桂花治療慢性腦缺血的潛在作用機(jī)制并結(jié)合動物實驗進(jìn)行驗證，以為后期研究提供理論及實驗參考。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出桂花潛在作用靶點289個，并預(yù)測其可作用于198個慢性腦缺血疾病靶點。通過對這198個靶蛋白進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，篩得桂花治療慢性腦缺血的關(guān)鍵靶點為AKT1、VEGFA、CASP3等。AKT1作為一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，還有AKT2和AKT3 2種亞型，其中AKT1主要存在于腦、心臟和肺中[18]。研究發(fā)現(xiàn)，AKT1可通過抗凋亡機(jī)制促進(jìn)急性腦缺血、阿爾茨海默病等神經(jīng)系統(tǒng)性疾病的神經(jīng)元存活，發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用[19]。VEGFA是一種促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子。腦缺血發(fā)生后，VEGFA通過促進(jìn)腦部神經(jīng)血管形成及重構(gòu)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[20-21]。CASP3作為介導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生的啟動子，其活化將觸發(fā)腦缺血神經(jīng)元凋亡及細(xì)胞焦亡的發(fā)生[22]。KEGG通路富集結(jié)果表明桂花治療慢性腦缺血可能與調(diào)控癌癥通路、PI3K/Akt信號通路、VEGF信號通路等相關(guān)，結(jié)合PI3K/Akt信號通路富集靶點基因數(shù)及核心靶點中AKT1的重要性，推測桂花可能主要通過調(diào)控PI3K/Akt信號通路發(fā)揮抗慢性腦缺血神經(jīng)損傷作用。為進(jìn)一步驗證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測結(jié)果，本研究采用動物實驗探討桂花對慢性腦缺血的神經(jīng)保護(hù)作用及其機(jī)制。

長期腦組織血流量低灌注引發(fā)認(rèn)知功能障礙，且慢性腦缺血所致認(rèn)知功能障礙的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)是膽堿能神經(jīng)元功能障礙，主要表現(xiàn)為ChE活性升高、ChAC活性及乙酰膽堿水平降低等[23-24]。因此，借助相關(guān)檢測方法評價桂花醇提物改善慢性腦缺血致神經(jīng)功能障礙等作用是一種重要措施。右側(cè)頸總動脈結(jié)扎法因其死亡率低，可保證腦血流量（cerebral blood flow，CBF）持續(xù)輕度降低，并出現(xiàn)符合人體疾病進(jìn)程的腦缺血認(rèn)知功能障礙，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于慢性腦缺血的實驗研究[25-26]。本研究采用右側(cè)頸總動脈結(jié)扎法復(fù)制慢性腦缺血模型，結(jié)合行為學(xué)評價方法曠場實驗發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，桂花醇提物組小鼠的站立次數(shù)、中央?yún)^(qū)域運動距離均明顯增加。且運動軌跡圖也顯示，模型組小鼠探索行為減少，表現(xiàn)明顯的趨觸性：即沿著邊緣運動，空間中央探索運動減少；相較模型組，桂花醇提物可有效改善以上功能障礙。同時，模型組ChAC活性顯著降低，ChE活性升高，而桂花醇提物給藥后可以顯著逆轉(zhuǎn)。以上結(jié)果提示，桂花醇提物可有效增強(qiáng)中樞膽堿能系統(tǒng)功能，改善腦缺血小鼠的認(rèn)知功能障礙。

長期的腦灌注不足極易對大腦皮層及海馬產(chǎn)生影響。研究發(fā)現(xiàn)，因慢性腦缺血誘發(fā)的認(rèn)知功能障礙大鼠海馬與皮質(zhì)區(qū)的神經(jīng)元大量丟失、組織結(jié)構(gòu)異常[27-28]。HE染色結(jié)果表明，模型小鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，有些甚至固縮為梭形和三角形，海馬中的神經(jīng)細(xì)胞較假手術(shù)組排列稀疏、紊亂，而桂花醇提物可以修復(fù)海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞損傷。TUNEL染色結(jié)果也進(jìn)一步提示，桂花醇提物可以顯著減少腦缺血小鼠皮層區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果表明桂花可能通過調(diào)控PI3K/Akt信號途徑發(fā)揮慢性腦缺血損傷保護(hù)作用。PI3K/Akt信號通路作為經(jīng)典的抗凋亡、促存活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在維持細(xì)胞生存以及抑制細(xì)胞凋亡中起著重要的作用[29]。激活PI3K/Akt通路，促進(jìn)Akt磷酸化，降低凋亡蛋白Bax和cleaved Caspase-3等的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡，是促進(jìn)神經(jīng)元存活的重要措施[30-32]。Western blotting檢測結(jié)果表明，與假手術(shù)組比較，模型小鼠p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、Bcl-2/Bax值明顯降低，Cyt-C和cleaved Caspase-3表達(dá)明顯增加；與模型組比較，桂花醇提物可明顯提高p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、Bcl-2/Bax值，下調(diào)促凋亡蛋白Cyt-C、cleaved Caspase-3、Bax等的表達(dá)。本研究結(jié)果驗證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析提示的桂花通過調(diào)節(jié)AKT1、CASP3等關(guān)鍵靶點發(fā)揮抗慢性腦缺血神經(jīng)損傷作用。

綜上，本研究首次報道了桂花醇提物抗慢性腦缺血小鼠神經(jīng)損傷的保護(hù)作用及可能機(jī)制，為桂花用于慢性腦缺血疾病的防治提供科學(xué)依據(jù)，也為相應(yīng)腦缺血神經(jīng)保護(hù)藥物的研發(fā)開辟新思路。然而其主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及其多途徑、多靶點抗腦缺血神經(jīng)損傷的深入機(jī)制尚待進(jìn)一步探究。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 穆浩月, 鞠奕, 趙性泉. 慢性腦缺血病理生理機(jī)制與臨床表現(xiàn)的研究進(jìn)展 [J]. 中國醫(yī)學(xué)前沿雜志: 電子版, 2021, 13(4): 21-25.

[2] 李江云, 陳紅霞. 慢性腦缺血中西醫(yī)治療進(jìn)展 [J]. 新疆中醫(yī)藥, 2021, 39(3): 115-118.

[3] 高利. 慢性腦缺血中西醫(yī)結(jié)合診療專家共識 [J]. 中國中西醫(yī)結(jié)合雜志, 2018, 38(10): 1161-1167.

[4] 楊柳, 張敏, 賀曦, 等. 姜黃素對大鼠慢性腦缺血誘發(fā)腦損傷的保護(hù)作用及分子機(jī)制研究 [J]. 中國藥業(yè), 2015, 24(4): 31-34.

[5] 倪彩霞. 芳香開竅藥抗腦缺血及影響血腦屏障功能的實驗研究 [D]. 成都: 成都中醫(yī)藥大學(xué), 2011.

[6] 房仙穎, 周江蓮, 王靖秋, 等. 桂花渣粕黃酮提取物的制備及酶法修飾 [J]. 林業(yè)工程學(xué)報, 2020, 5(6): 99-105.

[7] 趙東, 袁杰彬, 孫琳, 等. 桂花及桂花酒的研究進(jìn)展 [J]. 釀酒科技, 2017(1): 90-94.

[8] 王利蘋, 奉建芳, 胡凱莉. 芳香開竅中藥對血腦屏障通透性的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制研究進(jìn)展 [J]. 中國中藥雜志, 2014, 39(6): 949-954.

[9] 熊麗娜, 毛淑琴, 陸柏益, 等. 桂花提取物及毛蕊花糖苷抗-半乳糖致小鼠衰老作用研究[A] // 中國食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會第十一屆年會論文摘要集[C]. 杭州: 中國食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會, 2014: 139-140.

[10] Lee H H, Lin C T, Yang L L. Neuroprotection and free radical scavenging effects of[J]., 2007, 14(6): 819-827.

[11] Zhou F, Zhao Y J, Li M Q,. Degradation of phenylethanoid glycosides inLour. flowers and its effect on anti-hypoxia activity [J]., 2017, 7(1): 10068.

[12] 牛明, 張斯琴, 張博, 等.《網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)評價方法指南》解讀 [J]. 中草藥, 2021, 52(14): 4119-4129.

[13] Zhou Y T, Zhang J, Wang L,. Interleukin-1β impedes oligodendrocyte progenitor cell recruitment and white matter repair following chronic cerebral hypoperfusion [J]., 2017, 60: 93-105.

[14] 程芳, 周子航, 靳冰瑞, 等. 黃芪-燈盞細(xì)辛成分聯(lián)用對慢性腦缺血小鼠神經(jīng)損傷的保護(hù)機(jī)制研究 [J]. 中國藥學(xué)雜志, 2023, 58(1): 57-64.

[15] 殷博武. 名花良藥好食材: 桂花 [J]. 中國藥店, 2013(18): 77.

[16] 張陽. CSE源性H2S調(diào)控RhoA/ROCK通路對小鼠腦缺血再灌注后星形膠質(zhì)細(xì)胞功能和神經(jīng)損傷的作用研究 [D]. 合肥: 安徽醫(yī)科大學(xué), 2021.

[17] 李建章, 張杰文, 劉恒方. 慢性腦缺血臨床診治專家共識 [J]. 中國實用神經(jīng)疾病雜志, 2022, 25(6): 661-667.

[18] Gao Q, Deng H, Yang Z F,. Sodium danshensu attenuates cerebral ischemia-reperfusion injury by targeting AKT1 [J]., 2022, 13: 946668.

[19] 劉艷青. 癲癇持續(xù)狀態(tài)后AKT1在顳葉癲癇大鼠海馬中的表達(dá)變化 [D]. 天津: 天津醫(yī)科大學(xué), 2010.

[20] 潘之光, 毛穎, 孫鳳艷. 血管內(nèi)皮生長因子促損傷腦內(nèi)神經(jīng)血管單元的重構(gòu) [J]. 生理學(xué)報, 2017, 69(1): 96-108.

[21] 渠澤平, 楊丙飛, 格日樂圖, 等. 遠(yuǎn)隔缺血預(yù)適應(yīng)對腦小血管病患者認(rèn)知功能障礙及血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)水平的影響 [J]. 中國實用神經(jīng)疾病雜志, 2021, 24(8): 675-679.

[22] Rogers C, Fernandes-Alnemri T, Mayes L,. Cleavage of DFNA5 by caspase-3 during apoptosis mediates progression to secondary necrotic/pyroptotic cell death [J]., 2017, 8: 14128.

[23] Chen D D, Peng C, Xie X F,. Low dose of anisodine hydrobromide induced neuroprotective effects in chronic cerebral hypoperfusion rats [J]., 2017, 16(10): 1111-1119.

[24] Sun Y N, Zhao Z L, Li Q,. Dl-3-n-butylphthalide regulates cholinergic dysfunction in chronic cerebral hypoperfusion rats [J]., 2020, 48(7): 300060520936177.

[25] Yoshizaki K, Adachi K, Kataoka S,. Chronic cerebral hypoperfusion induced by right unilateral common carotid artery occlusion causes delayed white matter lesions and cognitive impairment in adult mice [J]., 2008, 210(2): 585-591.

[26] 項麗玲, 李艷, 曹利華, 等. 基于臨床病癥特點的慢性腦缺血動物模型分析 [J]. 中藥新藥與臨床藥理, 2021, 32(1): 93-98.

[27] 牟靜靜. 慢性腦缺血致認(rèn)知障礙大鼠線粒體損傷機(jī)制及腦脈泰保護(hù)作用研究 [D]. 長春: 吉林大學(xué), 2015.

[28] 丁利靜, 趙丹丹, 劉波, 等. 蛇床子素抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活改善血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶能力 [J]. 中國新藥與臨床雜志, 2021, 40(6): 470-475.

[29] Zhang Z, Yao L, Yang J H,. PI3K/Akt and HIF?1 signaling pathway in hypoxia?ischemia (review) [J]., 2018, 18(4): 3547-3554.

[30] 趙蕾, 張曉紅, 吳柏成, 等. 山楂葉總黃酮對腦缺血大鼠腦組織PI3K/Akt信號通路的影響 [J]. 廣東醫(yī)學(xué), 2014, 35(7): 982-984.

[31] 仇志富, 吳曉光, 顏勇, 等. 姜黃素對腦缺血大鼠腦組織PI3K/AKT信號通路的影響 [J]. 中國老年學(xué)雜志, 2017, 37(19): 4756-4758.

[32] 丁曉麗, 薛丁嘉, 鄧萬娟, 等. 鐵筷子揮發(fā)油對慢性腦缺血致血管性認(rèn)知功能障礙大鼠的作用及機(jī)制研究 [J]. 中草藥, 2022, 53(17): 5389-5399.

Protective mechanism ofethanol extract on chronic cerebral ischemia nerve injury based on network pharmacology and animal experiments

CHENG Fang, ZHANG Jie, HU Jia-cheng, XU Huan, XIAN Jin-ran, XIE Xing-liang, SHENG Yan-mei

School of pharmacy, Chengdu Medical College, Chengdu 610500, China

To explore the protective effect and mechanism ofethanol extract against chronic cerebral ischemic nerve injury based on phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/protein kinase B (Akt) pathway.The active components and targets ofwere screened by literature, TCMSP and BATMAN database; OMIM and GeneCards disease databases were used to search for disease targets. Protein-protein interaction (PPI) network was constructed by taking intersecting targets. With the help of DAVID database, gene ontology function and Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) pathway enrichment analysis were carried out, and “component-target-pathway” network was established. The model of chronic cerebral ischemia in mice was established by ligating the right common carotid artery. The mice were randomly divided into sham group, model group, Naoluotong (腦絡(luò)通, 195 mg/kg) group andethanol extract low- and high-dose (125, 375 mg/kg) groups. Open field experiments was used to evaluate the spontaneous ability and exploratory behavior of mice in each group; Levels of choline acetylase (ChAC) and cholinesterase (ChE) in hippocampus of mice in each group were detected; HE and TUNEL staining were used to observe pathological changes in brain tissue and neuronal apoptosis; Western blotting was used to detect PI3K/Akt signaling pathway and apoptosis-related protein expressions in hippocampal tissue.A total of 12 active ingredients and 289 potential targets of, 3014 targets of chronic cerebral ischemia disease, and 198 intersection targets ofand chronic cerebral ischemia were screened by network pharmacology, among which AKT1, vascular endothelial growth factor A (VEGFA), and cysteine aspartic protease-3 (Caspase-3) were core targets. Further analysis using KEGG and GO revealed that PI3K/Akt signaling pathway may be an important pathway forto exert neuroprotective effects on chronic cerebral ischemia. The mouse model of chronic cerebral ischemia was replicated using the ligation of the right common carotid artery. The results showed thatethanol extract significantly increased ChAC level in brain tissue (< 0.001), decreased ChE level (< 0.001), and enhanced the function of the central cholinergic system; Significantly increased the number of standing times and central area movement distance in mice with cerebral ischemia (< 0.001), improved cognitive and other neurological dysfunction, and inhibited neuronal apoptosis in the ischemic brain tissue (< 0.001). Its mechanism was related to regulating PI3K/Akt signaling pathway, up-regulating the expressions of p-PI3K, p-Akt and B-cell lymphoma-2 (Bcl-2) proteins (< 0.05, 0.01), and down-regulating the expressions of cytochrome C (Cyt-C), Bcl-2 associated X protein (Bax) and cleaved Caspase-3 proteins (< 0.01).ethanol extract can effectively inhibit the damage of cerebral ischemic nerve cells and improve the neurological dysfunction. Its protective effect on cranial nerves is related to the regulation of PI3K/Akt pathway and inhibition of cell apoptosis.

ethanol extract; chronic cerebral ischemia; network pharmacology; verbascoside; salidroside; apoptosis; PI3K/Akt pathway

R285.5

A

0253 - 2670(2023)16 - 5233 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.16.012

2023-03-19

四川省科技廳重點研發(fā)項目（2020YFS0325）；成都醫(yī)學(xué)院研究生創(chuàng)新科研基金項目（YCX2022-01-30）

程 芳，碩士研究生，研究方向為中藥藥效與毒理。E-mail: 1439010973@qq.com

謝興亮，碩士生導(dǎo)師，教授，研究方向為中藥新制劑與新劑型。E-mail: 421733038@qq.com

盛艷梅，碩士生導(dǎo)師，教授，研究方向為中藥腦缺血神經(jīng)保護(hù)機(jī)制。E-mail: 467131233@qq.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]