細胞焦亡與鐵死亡在口腔癌治療中的研究進展

洪浩 綜述 王帥 審校

1.遵義醫科大學附屬口腔醫院口腔種植科，貴州 遵義 563000；2.遵義醫科大學口腔醫學院，貴州 遵義 563000；3.遵義醫科大學附屬口腔醫院科研科，貴州 遵義 563000

口腔癌(OSCC)又稱口腔鱗狀細胞癌，是指發生在嘴唇、硬腭、上下牙槽嵴、舌前2/3、舌下區、頰黏膜、磨牙后三角和口底等區域的惡性腫瘤[1]。根據世界衛生組織《全球癌癥觀察(GLOBOCAN)》統計，2020年全球口腔癌新增病例已達377 713 例，新增死亡病例已達177 757 例，占全球癌癥新增病例和新增死亡病例的2%和1.8%[2]。一直以來，手術和放射治療因為存活率較高成為口腔癌患者的主要治療手段。但是兩種療法的副作用和后遺癥也會極大地降低患者的生活質量[3]。同時口腔癌細胞極易對多種化療藥物產生耐藥性，無法顯著提高患者的存活率或生活質量[4-5]。近年來，免疫療法成為新興的研究熱點，然而較窄的抗癌譜和自身免疫引起的潛在毒性仍然是免疫治療在臨床上大規模應用的主要障礙[6-7]。因此許多研究者仍然嘗試利用其他途徑研發適用于口腔癌的治療方法，嘗試為癌癥治療開辟新的前景。

鐵死亡和細胞焦亡是近年來公認的一類受調節的細胞死亡形式。不同于傳統的細胞凋亡、壞死和自噬，細胞焦亡是一種由Caspase-1 介導的程序性細胞死亡程序，也稱為細胞炎性壞死，而細胞鐵死亡則涉及鐵離子的積累和脂質過氧化等過程[8-10]。近年來有研究提示CD8+T 細胞及其衍生的γ-干擾素可以同時激發腫瘤細胞的焦亡和鐵死亡機制，共同造成細胞膜穿孔的現象，表明兩者不僅在宏觀上與腫瘤的發生和發展過程密切相關，同時在微觀上兩者有著相似的功能和高度的關聯性[11-12]。若能在口腔癌細胞中探明這兩種機制，則不僅可以有效抑制癌癥的演進，同時有助于針對這兩種機制設計診斷、治療和預后策略。為此，本文針對細胞焦亡和鐵死亡在口腔癌中的研究現狀和未來展望綜述如下：

1 口腔癌細胞鐵死亡

鐵是人體不可缺少的微量元素，在細胞新陳代謝、生長和發育過程中發揮著關鍵作用。同時鐵離子在腫瘤的生長過程中具有雙重特性，正常情況下癌細胞對鐵的依賴性增加，巨噬細胞則將鐵傳遞給癌細胞，從而促進腫瘤生長[13]。但是過度提高鐵離子的濃度則會誘導癌細胞的鐵死亡。除了細胞內需要維持一定的鐵離子濃度以外，細胞內活性氧(ROS)水平和脂質過氧化積累共同構成了影響腫瘤細胞鐵死亡的關鍵因素[14]。在此過程中，胱氨酸通過由溶質載體家族7 成員11 蛋白(SLC7A11)和蛋白SLC3A2 組成的胱氨酸/谷氨酸轉運受體交換進入細胞內，并還原成半胱氨酸參與細胞內自由基清除劑谷胱甘肽(GSH)的合成，而GSH 也是谷胱甘肽過氧化物酶(GPX4)的輔助因子[15]。若胱氨酸的轉運或GPX4 的合成出現干擾，則細胞體內的活性氧水平將快速上升，使細胞發生鐵死亡現象。目前，Yang 等[14]從口腔癌組織免疫組化的結果中發現核心生物鐘基因(PER1)與GPX4和SLC7A11 的表達水平呈顯著負相關(P<0.01)。從組織培養的角度發現當PER1 過表達時，腫瘤體積縮小了4 倍，重量則減輕了1 倍。隨后的細胞實驗則發現PER1 過表達可以使缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)的表達水平下降9 倍，同時轉鐵蛋白受體(TFRC)表達升高了1 倍，SLC7A11 和GPX4 的表達則降低了接近30%。然而該過表達體系使用HIF-1α 激活劑處理后，GPX4 和SLC7A11 蛋白水平分別升高了50%和150%，而TFRC 的蛋白水平和細胞活性氧含量則下降了接近40%。上述的結果充分說明了PER1 與HIF-1α 形成的負反饋環對口腔癌細胞的鐵死亡起到了重要的調節作用[16]。Li 等[17]和Hou 等[18]通過篩選和分析189 個鐵死亡相關基因在口腔癌細胞和鄰近正常組織之間的表達差異，發現其中14 個基因與口腔癌患者的預后存在極高的關聯。值得注意的是，在上述14 個強關聯的鐵死亡基因中，ATG5、MAP1LC3A 和MAP3K5 等3 個基因同時對細胞自噬起到關鍵作用；細胞自噬也會激活鐵蛋白FTH1 的降解，引發細胞鐵死亡(表1)。該現象表明口腔癌細胞的自噬和鐵死亡之間可能存在關鍵的相互作用。這些結果都可能為優化癌癥聯合治療提供一個有前景的思路。

此外，也有諸多研究表明RNA參與了口腔癌細胞鐵死亡機制的調控。Yang 等[31]發現當環狀RNA FNDC3B(circFNDC3B)過表達時，口腔癌細胞增值速度提高了2.5 倍。然而當circFNDC3B 的表達受到miR-520d-5p 抑制時，細胞中SLC7A11 和GPX4 的表達出現顯著降低(P<0.01)，鐵離子和活性氧水平升高了近80%，證明了circFNDC3B 可以通過調節鐵死亡保護相關蛋白從而抑制口腔癌細胞的鐵死亡。除此之外，近年來也有數篇報道通過基因比對發現非編碼RNA(ncRNA)也在口腔癌的發生發展中發揮著重要作用，并且能夠利用ncRNA構建較為準確的口腔癌預后模型，但是其具體的作用機制仍待進一步的探索[1，32-33]。

2 口腔癌細胞焦亡

與常見的細胞凋亡不同，細胞焦亡是一種由Caspase-1介導的程序性細胞死亡形式。在識別外源性或內源性信號后，細胞會經歷炎性體組裝、孔蛋白家族Gasdermin(GSDM)蛋白裂解、促炎細胞因子和其他細胞內容物釋放等過程并最終導致炎性細胞死亡。根據GSDM 被激活的焦亡途徑，細胞焦亡可以被分為炎癥小體依賴性焦亡或非炎癥小體依賴性焦亡。炎癥小體依賴性焦亡的特點在于需要炎性小體受病毒或細菌刺激后激活Caspase-1/4/5/11 蛋白介導GSDMD的切割。將GSDMD 切割成N 端和C 端片段后，其中N-末端與膜上的磷脂酰肌醇結合并繼續構建弧形、狹縫和環形寡聚體。這些寡聚體在細胞膜表面成孔以誘導裂解并開始細胞焦亡的過程[34-35]。Jiang等[36]通過敲低長鏈非編碼RNA LINC00958 發現口腔癌細胞HSC4 中caspase-1 的表達水平下降了60%，IL-1β和IL-18 的表達水平也分別下降了近30%和50%，這表明LINC00958 抑制了炎癥小體的活化并降低了細胞焦亡水平。非炎癥小體依賴性焦亡則只需要各自蛋白酶的作用，而無需炎性小體復合物的激活。例如Caspase-3在被激活后直接切割GSDME生成GSDME的N端片段。該片段結構域與GSDMD的N端結構域相似，都會導致細胞膜孔形成和細胞焦亡[37-38]。近年來，諸多研究認為GSDME與腫瘤免疫的關系密切，當Caspase-3 介導的細胞焦亡機制被細胞毒性化合物或放射線激活時，GSDME 可以發揮抗腫瘤作用[39-40]。Wang等[41]利用siRNA 抑制GSDME表達后，發現順鉑誘導的焦亡細胞率相較于未敲除細胞下降了20%，同時細胞免疫因子IL-1b、IL-6 和CCL-2 的轉錄水平也下降了近50%。當低表達GSDME 的SCC7 細胞接種到小鼠中則可見順鉑用藥15 d 后腫瘤大小與同條件的shRNA 陰性對照組的小鼠相比增大了近6 倍。可見GSDME的減少不僅可以避免化療藥物激活口腔癌細胞的焦亡機制，同時抑制了免疫原性物質的釋放，從而對順鉑產生耐藥性。此外部分基因也可能通過其他途徑影響口腔癌的焦亡。Zeng等[42]利用Lasso cox回歸模型篩選并分析了細胞焦亡相關的調節基因與口腔癌患者預后的相關性。其中7 個基因(FAM72D、COL27A1、HIST1H3F、MAML3、LOC283314、FST 和MCEE)與口腔癌患者的預后呈現較強的關聯性。但是上述基因在口腔癌細胞焦亡的過程中所發揮的具體作用仍待進一步探明。總體而言通過上調炎癥小體和Caspase家族蛋白的表達促進細胞焦亡可能是開發耐藥性口腔癌治療方法的新思路。

3 細胞焦亡與鐵死亡在口腔癌治療中的研究

3.1 基于納米材料的口腔癌靶向治療工具 納米材料作為可定制的靶向藥物遞送工具，能夠在保留健康細胞的前提下將化療藥物或治療基因運送到癌細胞中[43]。近年來，納米材料誘導癌細胞的鐵死亡成為耐藥性癌癥治療的潛在思路。Huang等[44]發現零價鐵納米粒子可以誘導芬頓反應引發細胞內活性氧物質激增，進而激活耐藥型口腔癌細胞的鐵死亡現象。邢如霄[45]則將維甲酸和二茂鐵兩種功能基團組裝成納米粒子，當該納米粒子與谷胱甘肽相遇后立即發生解離。解離后的兩部分則可以在抑制SLC7A11 表達的同時大幅度地消耗口腔腫瘤細胞內谷胱甘肽，使細胞內活性氧水平大幅上升。同時由于正常細胞內GSH含量較低，因此該納米粒子基本不會在正常組織細胞內解離，對正常組織細胞無毒副作用。光動力療法(PDT)是近年來興起的腫瘤治療方式，該療法將光敏劑輸送到腫瘤部位，隨后用某些波長的光照射使光敏劑產生細胞毒性和活性氧[34]。然而細胞內的過氧化氫濃度有限，無法分解出能夠破壞細胞所需的活性氧濃度，使光動力療法無法達到預期的效果；因此Zhu等[47]嘗試聯合細胞鐵死亡機制與光動力療法，利用芬頓反應提高活性氧含量，從而破解光動力療法的瓶頸。從實驗結果可見，當光敏劑二氫卟酚e6(Ce6)與鐵死亡誘導劑Erastin 通過超分子相互作用組裝成納米顆粒組成納米藥物后，凋亡細胞率相較于Ce6 單體提高了63.1%。蛋白質印跡顯示，Ce6-erastin 納米顆粒與游離的Ce6/erastin 混合物組相比顯著下調了GPX4的表達。小鼠實驗則發現注射Ce6-erastin 納米顆粒后腫瘤體積增長明顯放緩，腫瘤抑制率高達70.6%，相較于游離的Ce6/erastin 混合物組提高了17.8%，而單Ce6的抑制率僅有46.1%。上述結果充分表明納米材料與細胞鐵死亡的交叉研究可以為口腔癌治療提供新的思路和理論基礎。

3.2 基于小分子RNA的口腔癌細胞代謝調節 由19~25個核苷酸組成的小分子RNA(miRNA)在細胞分化、細胞周期調節和細胞凋亡等過程中發揮著重要作用。在癌癥治療中，miRNA 可以在干擾惡性腫瘤的特殊代謝通路的同時減少對周圍正常組織的影響。Zhou 等[48]將缺氧誘導因子1α(HIF-1α)的小分子干擾RNA(siRNA)與二氧化鈦-釕基光敏材料(TiO2@Ru)組合成納米顆粒TiO2@Ru@siRNA。通過細胞實驗可見經激光處理后含TiO2@Ru@siRNA的細胞不僅從表觀層面出現了焦亡引起的細胞腫脹、膜破裂和大量表面絨毛減少等現象，同時從蛋白層面可見Gasdermin D(GSDMD) 蛋白和Caspase-1 顯著上調。小鼠實驗則可見對照組病灶伴有糜爛、潰瘍和邊界不清的內源性生長，而TiO2@Ru@siRNA 介導組病灶顯著中斷了惡性轉化過程。TiO2@Ru@siRNA 介導組的組織蘇木精和伊紅染色(H&E)評分則為對照組的一半(P<0.05)。在其他種類的癌細胞研究中，細胞鐵死亡被證實與P53 通路相關，其中非編碼RNA miR-34c-3p對該通路起到了關鍵的調節作用[49-50]。Sun 等[51]則發現miR-34c-3p 在口腔癌細胞的鐵死亡過程中同樣具有重要作用。在miR-34c-3p 過表達的前提下，SLC7A11 蛋白表達水平下降了近3 倍，同時CCK8 結果也表明miR-34c-3p 的過表達可以顯著降低口腔癌細胞的增殖和細胞活力。而SLC7A11 的過表達則可以扭轉由miR-34c-3p 模擬物引起的增殖抑制，使細胞數量提升20%以上。這些現象也充分說明了miR-34c-3p 在口腔癌細胞的鐵死亡調節中具有重要的作用。隨著基因療法與核酸藥物的研究不斷深入，針對Caspase蛋白家族和SLC7A11蛋白研發相關核酸抑制劑有望使口腔癌的臨床治療進入新的階段。

3.3 化學藥物的創新應用 隨著研究者對癌細胞耐藥機制和潛在治療靶點的不斷探索，部分用于治療其他疾病的藥物也被證實可以用于口腔癌的治療。Yue 等[52]在細胞實驗中發現常用于預防心血管疾病和糖尿病的花青素參與了口腔癌細胞的焦亡過程。經過花青素處理后，Caspase-1的炎癥小體NLRP3的表達水平提高了6 倍，Caspase-1 的表達水平則提高了1 倍。當口腔癌細胞被Caspase-1 抑制劑AC-YVAD-CMK處理后，細胞活性則不再受花青素的影響；同時基因NLRP3的表達水平相較于單青花素處理組下降了3倍，Caspase-1 的表達水平也下降了60%以上。與花青素不同的是，毛蘭素通過誘導GSDME表達促進口腔癌細胞焦亡。Luo等[53]在口腔癌細胞實驗中給藥后12 h可見GSDME-N片段的表達水平相較于給藥前提升了約5 倍，給藥后24 h 的表達水平則相較于給藥前提升了約12 倍。除了調節焦亡相關基因的表達可以減少口腔癌細胞對順鉑產生耐藥性以外，通過促進細胞鐵死亡也可以提高耐順鉑癌細胞的殺傷效果。Lu 等[54]發現鼠尾草酸可以在不傷害正常口腔組織的前提下促進耐順鉑口腔癌細胞死亡。經鼠尾草酸處理后的耐順鉑口腔癌細胞內谷胱甘肽減少了近50%，同時細胞內活性氧含量提高了1倍以上。通過進一步研究還發現耐順鉑口腔癌細胞經處理后與化學耐藥相關的Nrf2-HO1-xCT 信號蛋白含量下降了近1 倍，若利用rNrf2 質粒增強Nrf2 信號蛋白的表達則可以有效逆轉耐藥癌細胞的鐵死亡，從而恢復癌細胞的耐藥水平。除了增強口腔癌療效，細胞焦亡的深入探究也可以用于減輕放化療引起的副作用。口腔黏膜和胃腸道不適是口腔癌化療過程中最常見的副作用。Huang等[55]在口腔癌細胞和周圍組織的免疫染色結果中發現，正常組織細胞的GSDME表達水平相較于口腔癌細胞上調了27.5%。而使用維生素D 抑制Caspase 相關炎癥信號后，免疫印跡結果顯示GSDME 和Caspase-3 的表達顯著減少，同時細胞死亡率下降了近30%。表明順鉑引起的化療副作用與正常組織細胞中GSDME的裂解存在較強關聯，且高濃度維生素D可促進正常組織保護并減少化療副作用。因此針對口腔癌細胞的鐵死亡和焦亡機制展開深入研究可以有助于研究者開發新藥以應對傳統化療帶來的耐藥性和副作用，提高患者治療的依從性。

3.4 細胞焦亡與鐵死亡雙誘導聯合抗癌治療 如前言所述，細胞焦亡和鐵死亡機制具有高度的關聯性。兩者除了可以被同時激活以外，Zhou等[56]在黑色素瘤細胞中證明了Tom20-Bax-caspase-GSDME 信號通路通過激活ROS 信號傳導參與了細胞焦亡。Xu等[57]也在轉鐵蛋白納米藥物的研究中發現細胞鐵死亡過程中IL-1β、LDH和GSDMD 的表達水平均出現了不同程度的上調，表明鐵離子和ROS水平的上升也可以激活細胞焦亡。雖然上述報道尚未在口腔癌細胞中得到進一步確認，但是深入研究口腔癌細胞焦亡和鐵死亡之間的關聯與串擾將有助于為兩者的聯合療法提供新的思路。

4 結語

近年來由于大多數腫瘤對細胞凋亡具有先天抗性，新興的生物學發現和技術創新與傳統療法的結合已成為高效治療癌癥的趨勢。但是以細胞焦亡和鐵死亡機制為中心的口腔癌治療研究仍處在初級階段。隨著免疫學、分子生物學、生物信息學以及納米技術的發展，未來需要更多的細胞與臨床試驗來研究以細胞焦亡和鐵死亡為中心的口腔癌治療和新藥研發策略。