艾葉配方顆粒HPLC特征圖譜及含量的測定

朱亞文,歐陽習葉,唐正平,易躍能

(1.湖南易能生物醫藥有限公司,長沙410221; 2.湖南春光九匯現代中藥有限公司,湖南 瀏陽410330)

0 引言

艾葉配方顆粒為符合炮制規范的艾葉飲片(ArtemisiaargyiLevl. et Vant.菊科植物艾的干燥葉)按標準湯劑的主要質量指標加工制成的配方顆粒,作為傳統中藥飲片的有益補充被應用于臨床。研究表明,艾葉的主要化學成分為揮發油、黃酮類、萜類、苯丙素類、有機酸類﹑甾體類、多糖類及微量元素等。非揮發性成分中,黃酮類與苯丙素類化合物含量較高且易于檢測,常作為指標性成分用于含量測定及指紋圖譜的研究[1]。本研究按照《中國藥典》2020年版一部,參考有關文獻[2-4],以艾葉為對照藥材,通過對艾葉藥材、飲片、標準湯劑、配方顆粒的相關性研究[5],為艾葉配方顆粒質量標準的建立提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Wayeal 3100高效液相色譜儀(安徽皖儀科技股份有限公司生產),Agilent 1100高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司生產),BSA124S[賽多利斯科學儀器(北京)有限公司生產],DHG-9246A電熱鼓風干燥箱 (上海精宏實驗設備有限公司生產),KQ-250E超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司生產)。

1.2 試藥

艾葉配方顆粒共3批,由湖南春光九匯現代中藥有限公司提供。綠原酸對照品(批號:110879-201703,純度99.7%)、艾葉對照藥材(批號:121130-202107)。乙腈、甲酸為色譜純,水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(150 mm×4.6 mm,3.0 μm),流動相A:乙腈,流動相B:0.1%甲酸溶液。梯度洗脫(0～4 min時10%A,4～40 min時10%A～28%A),流速1.0 mL·min-1,檢測波長325 nm,進樣量10 μL,柱溫30 ℃。理論板數按綠原酸峰計應不低于7000。

2.2 溶液制備

對照藥材溶液:取艾葉對照藥材0.1g,加水25 mL,回流提取30 min,放冷,濾過,濾液蒸干,殘渣加80%甲醇25 mL溶解,并轉移至具塞錐形瓶中,超聲處理(250 W,40 kHz)30 min,放冷,搖勻,過濾,取續濾液即得。

對照品溶液:精密稱定綠原酸對照品,加80%甲醇溶解,制成每1 mL含75 μg的溶液即得。

供試品溶液:精密稱定艾葉配方顆粒0.2 g,置具塞錐形瓶中,加入80%甲醇25 mL,稱定重量,超聲處理(200 W,40 kHz)30 min后,放冷,用80%甲醇補足減失重量,過濾,取續濾液即得。

陰性對照溶液:制備艾葉配方顆粒陰性樣品,按供試品溶液方法處理。

2.3 特征圖譜

2.3.1 方法學考察

精密度實驗:取供試品溶液,按“2.1”項色譜條件進樣測定。

重復性實驗:取樣品適量,按“2.2”項下制備供試品溶液,再按“2.1”項色譜條件進樣測定。

穩定性實驗:取供試品溶液適量,分別于室溫下放置0、2、4、8、12、18、24 h,按“2.1”項色譜條件進樣測定。

2.3.2 特征圖譜的建立及相對保留時間評價

按艾葉配方顆粒處方制備15批煎劑,按“2.1”項下色譜條件進樣測定,15 批煎劑特征圖譜見圖 1。在最優的特征圖譜色譜條件下,供試品一共呈現與標準湯劑、對照藥材一致的6個明顯的峰,對各個峰采用對照品定位指認,指認峰2為阿魏酸且峰響應值較高,故以峰2阿魏酸作為S峰。

圖1 15批標準煎劑高效液相色譜重疊特征圖譜Fig.1 15 batches of standard HPLC overlapping characteristic

供試品色譜中應呈現6個特征峰,應與對照藥材參照物色譜中的6個特征峰保留時間相對應,計算各特征峰與S峰的相對保留時間,其相對保留時間應在規定值的±10%范圍內。規定值分別為0.56(峰1)、1.11(峰3)、2.89(峰4)、3.02(峰5)、3.29(峰6),結果見圖2。

圖2 艾葉配方顆粒高效液相色譜對照特征圖譜Fig.2 HPLC reference characteristic of Artemisia argyi formula granules

2.4 指標成分含量測定

2.4.1 方法學考察

專屬性試驗:分別取供試品溶液、參照物溶液及空白溶劑,按照“2.1”項色譜條件進樣采集。結果表明,供試品色譜中呈現6個特征峰,與對照藥材參照物色譜中的6個特征峰保留時間相對應,陰性對照無干擾峰,結果見圖3。

圖3 高效液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram

線性關系考察:精密量取“2.2”項下對照品溶液,按“2.1”項下色譜條件進樣測定。以濃度(C)為橫坐標,以峰面積(A)為縱坐標,作標準曲線。結果表明,綠原酸濃度為5.01～200.01 mg·mL-1,即供試品綠原酸含量范圍為0.6263～25.0013 mg·g-1,回歸方程為y=32 167x-103 963,R2=0.999,線性良好。

儀器精密度試驗:取對照品溶液按“2.1”項下色譜條件連續進樣6次,記錄峰面積。結果表明,保留時間(t)與峰面積(A)RSD均小于2%,儀器精密度良好。

穩定性試驗:精密稱取艾葉配方顆粒適量,按“2.2”項下供試品溶液制備方法制備。分別在0、2、4、8、12、18、24 h按“2.1”項所述色譜條件進樣測定,綠原酸峰的保留時間(t)與峰面積(A)的RSD均小于2.0%,表明供試品溶液在室溫下放置24 h穩定。

重復性試驗:精密稱定樣品6份,按“2.2”項下方法制備供試品溶液,再按“2.1”項下色譜條件進行測定,計算綠原酸含量。樣品中綠原酸的平均含量為5731.64 μg·g-1,RSD值為0.1%,表明該方法的重復性良好。

中間精密度試驗:不同人員用不同儀器對同一批供試品進行測定,結果均值為5716.89 μg·g-1,RSD為1.4%,小于2%,表明本方法中間精密度好。

準確度試驗:精密稱取供試品0.1 g,按供試品含量約100%濃度水平進行前加標(加標被測物質濃度1000 μg·mL-1,加標體積為0.57 mL),按“2.2”項下供試品制備方法制備,依據重復性試驗結果作為樣品均值含量計算回收率,平均回收率為98.96%,RSD值為0.75%,結果表明該方法準確度良好。

2.4.2 3批樣品含量測定

采用上述色譜方法,對3批艾葉配方顆粒進行含量測定,結果分別為0.279 mg·g-1、0.307 mg·g-1、0.253 mg·g-1,RSD分別為1.3%、0.9%、0.6%,均小于2%,結果可靠。

2.4.3 揮發油

對15批次標準湯劑中揮發油進行研究,因100 g飲片標準湯劑濾液中僅提取到少量揮發油,為方便讀數,擴大樣品量考察標準湯劑中揮發油情況。將15批飲片加大投料量至500 g/批,每批5份(每份100 g),按標準湯劑工藝煎煮,合并濾液進行收油考察,15批標準湯劑中揮發油的平均轉移率為9.47%,均值±30%,轉移率范圍為6.63%～12.32%,轉移率分布范圍相對集中。綜合考慮揮發油使用劑量的安全性,建議按轉移率9.47%計算艾葉配方顆粒生產工藝中揮發油的加入量。

3 討論

參照《醫療機構中藥煎藥室管理規范》《中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要求》,以出膏率、指標/主要成分轉移率、特征圖譜為指標,對提取、固液分離、濃縮、干燥、制劑環節進行考察,以確保艾葉配方顆粒與標準湯劑質量的一致性。根據研究結果確定了艾葉配方顆粒的制備工藝與參數:取艾葉飲片400 g,加熱提取兩次,一煎加10倍水量,沸騰提取2 h,二煎加8倍水量,沸騰提取1 h,150目濾布趁熱過濾,合并濾液,70 ℃～80 ℃下減壓濃縮至相對密度為1.05～1.10(60 ℃),150目濾布趁熱過濾,加輔料適量噴霧干燥,再加輔料適量,16目篩網干法制粒,65目篩網整粒,即得。

艾葉配方顆粒依據飲片含揮發油含量不得少于0.4%(mL·g-1),按平均轉移率推算凍干粉中揮發油的下限為0.014%(mL·g-1),揮發油收集量占凍干粉中比例不到1 ‰。藥材與飲片中龍腦、桉油精兩成分的含量低下限分別為0.020%、0.050%,參照標準湯劑提取試驗結果中揮發油轉移率,則標準湯劑中龍腦、桉油精的含量低于萬分之一,故不選擇《中國藥典》中的這兩個揮發油成分指標作為含量測定,只將揮發油包合后加入干膏粉中制粒。

中藥配方顆粒在質量控制上缺少飲片性狀等重要指標,在質量控制標準制訂過程中測定指標應多元化。對15批標準湯劑擬合出對照指紋圖譜,與中試生產3批配方顆粒相擬合,指認出6個共有峰,測定綠原酸含量。通過實驗研究建立的方法操作簡單、準確,結合含量測定及指紋圖譜,可為艾葉配方顆粒的質量評價提供參考。