鼠尾草酸通過抑制阿爾茨海默病小鼠腦內(nèi)炎癥反應(yīng)減少β淀粉樣蛋白沉積的機(jī)制

賀曉文，邊競

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部，沈陽 110001）

阿爾茨海默病 （Alzheimer’s disease，AD） 又稱為老人失智癥、老年癡呆癥、腦退化癥，是最常見的神經(jīng)退行性疾病。目前，AD已成為世界上最常見的癡呆類型之一。且隨著世界老齡化人口增加，AD發(fā)病率逐年上升。由于AD暫無有效的防治手段，給患者家庭和社會(huì)均帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，找到AD的發(fā)病原因并尋找有效的預(yù)防手段尤其重要［1］。

AD的病因不明，其主要病理特征為神經(jīng)元內(nèi)tau蛋白過度磷酸化形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)和胞外剪切生成的以β淀粉樣蛋白 （amyloid β-protein，Aβ）沉積形成的老年斑［2-3］。大量研究結(jié)果顯示，炎癥反應(yīng)是AD發(fā)病的主要原因之一，腦內(nèi)沉積的Aβ可通過與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞上的受體結(jié)合，激活星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞，釋放大量炎性細(xì)胞因子和趨化因子，炎性細(xì)胞因子包括NOD樣受體蛋白3 （NOD-like receptor protein 3，NLRP3）、腫瘤壞死因子-α （tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素 （interleukin，IL） -6和IL-1β等。這些炎性細(xì)胞因子可進(jìn)一步促進(jìn)淀粉樣前體蛋白 （amyloid precursor protein，APP） 向淀粉樣蛋白剪切途徑進(jìn)行，促使Aβ生成增多，最終形成惡性循環(huán)，加快AD的進(jìn)程［4-5］。

近年來，針對(duì)AD的治療藥物越來越多，主要包括膽堿酯酶抑制劑 （多奈哌齊等）、谷氨酸受體拮抗劑 （美金剛） 以及甘露特納，但是這些藥物都無法達(dá)到預(yù)期的治療效果，且存在潛在的不良反應(yīng)［6-7］。鼠尾草酸 （carnosic acid，CA） 主要存在于鼠尾草和迷迭香等植物中，具有抗炎、抗氧化和抗菌等作用［8-10］。研究［11］發(fā)現(xiàn)，CA能夠抑制多種皮膚炎癥，且對(duì)人體無毒。此外，CA能夠通過降低TNF-α的表達(dá)，抑制細(xì)胞內(nèi)炎癥反應(yīng)［12］。因此，CA可能具有廣泛的抗炎作用。然而，CA能否通過降低神經(jīng)炎癥反應(yīng)減少Aβ生成和沉積數(shù)量，進(jìn)而延緩AD的病理進(jìn)程，尚未見報(bào)道。因此，本研究通過給予AD小鼠CA，研究CA對(duì)AD的影響，并探索其是否可以通過核因子κB （nuclear factor-κB，NF-κB） 抑制小鼠大腦皮層免疫炎癥反應(yīng)，從而改善AD小鼠的認(rèn)知功能障礙，最終延緩AD的發(fā)病進(jìn)程。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品和試劑盒：CA，購自中國MedChemExpress公司；NLRP3、TNF-α、IL-6、IL-1β、NF-κB、p-NF-κB、Aβ抗體、β-actin、二抗、Alexa Fluor 555標(biāo)記的熒光二抗，購自美國Cell Signaling Technology公司。IL-1β、IL-6和TNF-α的ELISA試劑盒，購自美國Abcam公司。

1.1.2 儀器：Morris水迷宮，購自中國安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司；激光共聚焦顯微鏡，購自日本尼康公司；酶標(biāo)儀，購自美國伯騰儀器有限公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組：5月齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠（AD模型） 18只，購自北京華阜康生物科技有限公司，體質(zhì)量25～28 g。將18只小鼠分為對(duì)照組和CA組，每組9只。CA組：腹腔注射CA （20 mg·kg-1·d-1），連續(xù)注射2個(gè)月；對(duì)照組：腹腔注射相同體積的生理鹽水，連續(xù)注射2個(gè)月。

1.2 方法

1.2.1 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)分為3個(gè)時(shí)期。訓(xùn)練期為2 d，3次/d，每次間隔1 h；可視平臺(tái)期為5 d，3次/d，每次間隔1 h；第8天為隱蔽平臺(tái)期，移走平臺(tái)，記錄小鼠穿越原來平臺(tái)位置的次數(shù)。每只小鼠進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 組織取材：10%水合氯醛 （10 g/3 μL） 麻醉小鼠，待小鼠進(jìn)入深度麻醉狀態(tài) （手術(shù)鑷子夾小鼠四肢未見反應(yīng)即可），立刻將小鼠固定于解剖臺(tái)上。剖開胸腔并剪去橫膈膜，暴露心臟，在左心室左下角開一個(gè)小口，將灌流針由左心室插入主動(dòng)脈，并用止血鉗固定住針頭，剪開右心耳，立即用0.9% NaCl灌流，灌流4～6 min，至肝臟邊緣無血絲為止。迅速斷頭，剖取小鼠大腦，于冰上一分為二。一部分放入4%多聚甲醛中固定保存，用于免疫組織化學(xué)中的形態(tài)學(xué)檢測(cè)；另一部分放入-80 ℃冰箱保存，用于蛋白提取、Western blotting等分子生物學(xué)檢測(cè)。

1.2.3 Western blotting：前額皮層組織稱重，加入RIPA裂解液 （內(nèi)含蛋白酶抑制和磷酸酶抑制劑） 后進(jìn)行超聲破碎。破碎后，放置冰上裂解3～4 h，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，吸取上清，進(jìn)行蛋白質(zhì)定量后深度低溫保存，用于Western blotting檢測(cè)。10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離膠，轉(zhuǎn)膜完成后，PVDF膜用2%脫脂牛奶封閉，抗體4 ℃孵育過夜。第2天二抗室溫孵育45 min，洗膜，ECL發(fā)光并顯影。

1.2.4 免疫熒光染色：切片水化后，用羊血清封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜。熒光二抗室溫孵育2 h，PBS漂洗后，防熒光淬滅劑封片，顯微鏡下采集圖像。

1.2.5 ELISA檢測(cè)：按照試劑盒操作，測(cè)定小鼠皮層中炎性細(xì)胞因子NLRP3、TNF-α、IL-6、IL-1β的含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Prism7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)用±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CA對(duì)AD小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的調(diào)控

水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠和CA組小鼠尋找可視平臺(tái)的時(shí)間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （P＞ 0.05），說明2組小鼠的運(yùn)動(dòng)能力和視力無顯著差異。隱蔽平臺(tái)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，CA組小鼠逃避潛伏期明顯縮短 （P＜ 0.05），說明CA可提高小鼠的記憶能力，且可明顯緩解AD小鼠的空間記憶損傷 （P＜0.05）。見圖1。

圖1 CA對(duì)AD小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響Fig.1 Effects of carnosic acid on spatial learning and memory abilities of AD mice

2.2 CA對(duì)AD小鼠大腦皮層中Aβ沉積數(shù)量和膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響

免疫熒光雙標(biāo)記染色結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠的大腦皮層出現(xiàn)大量Aβ老年斑沉積，并且其周圍的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞明顯增多。與對(duì)照組相比，CA組小鼠大腦皮層中Aβ老年斑數(shù)量明顯減少，星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞明顯減少。說明CA可能通過抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的活化減少Aβ的生成，進(jìn)而延緩AD的發(fā)病進(jìn)程。見圖2、3。

圖2 皮層中Aβ老年斑沉積和星形膠質(zhì)細(xì)胞的共定位情況Fig.2 The co-localization of Aβ senile plaques and astrocytes in the cortical area

圖3 皮層中Aβ老年斑沉積和小膠質(zhì)細(xì)胞的共定位情況Fig.3 The co-localization of Aβ senile plaques and microglia in the cortical area

2.3 CA對(duì)AD小鼠大腦皮層中炎性細(xì)胞因子的影響

ELISA結(jié)果 （圖4） 顯示，與對(duì)照組相比，CA組小鼠TNF-α、IL-6和IL-1β蛋白表達(dá)水平明顯降低 （P＜0.05）。Western blotting結(jié)果 （圖5） 進(jìn)一步證實(shí)，與對(duì)照組相比，CA組小鼠NLRP3、TNF-α、IL-6和IL-1β的表達(dá)水平明顯降低 （P＜ 0.05），CA抑制NLRP3、TNF-α、IL-6和IL-1β的表達(dá)。說明CA可明顯抑制AD小鼠腦內(nèi)炎癥反應(yīng)。

圖4 ELISA檢測(cè)CA對(duì)AD小鼠腦內(nèi)炎性細(xì)胞因子的影響Fig.4 Effects of carnosic acid on inflammatory factors in the brains of AD mice，as detected by ELISA

圖5 Western blotting檢測(cè)CA對(duì)AD小鼠腦內(nèi)炎性細(xì)胞因子的影響Fig.5 Effects of carnosic acid on inflammatory factors in the brains of AD mice，as detected by Western blotting

2.4 CA通過NF-κB信號(hào)通路抑制AD小鼠腦內(nèi)炎性細(xì)胞因子表達(dá)

與對(duì)照組相比，CA組p-NF-κB的表達(dá)明顯降低（P＜ 0.05）。說明CA可能通過NF-κB信號(hào)通路抑制AD小鼠免疫炎癥反應(yīng)，進(jìn)而改善小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。見圖6。

圖6 CA對(duì)AD小鼠腦內(nèi)NF-κB信號(hào)通路的影響Fig.6 Effects of carnosic acid on NF-κB signaling in the brains of AD mice

3 討論

Aβ形成過程中伴隨著神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞活化，產(chǎn)生大量的炎性細(xì)胞因子，包括TNF-α、IL-6和IL-1β等。而小膠質(zhì)細(xì)胞持續(xù)激活削弱了其結(jié)合和吞噬Aβ的能力，并降低Aβ的降解，進(jìn)一步增加Aβ的沉積數(shù)量，加快AD的發(fā)病進(jìn)程。

NF-κB在神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)元損傷的細(xì)胞反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。NF-κB通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子和免疫應(yīng)答基因的轉(zhuǎn)錄來調(diào)節(jié)免疫。在刺激作用下，NF-κB從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核，誘導(dǎo)靶基因轉(zhuǎn)錄［13］。重要的是，AD患者死后腦退化細(xì)胞中可見明顯的NF-κB活化。在膠質(zhì)增生過程中，Aβ神經(jīng)毒性依賴于NF-κB［14］。相反，阻斷NF-κB可減輕IL-1β誘導(dǎo)的變性［15］。NF-κB抑制被認(rèn)為是減少神經(jīng)炎癥損傷，從而延緩AD發(fā)病進(jìn)程的潛在靶點(diǎn)。

CA是一種天然化合物，是從迷迭香中分離得到的一種酚類二萜，因其藥理作用而受到越來越多的關(guān)注。研究［9］證實(shí)，CA可逆轉(zhuǎn)Aβ引起的海馬神經(jīng)元損傷，進(jìn)而起到保護(hù)神經(jīng)元的作用。此外，CA可通過抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的炎性細(xì)胞因子，改善AD小鼠的認(rèn)知功能障礙。

本研究檢測(cè)了炎性細(xì)胞因子NLRP3、TNF-α、IL-6和IL-1β的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，CA組NLRP3、TNF-α、IL-6和IL-1β蛋白表達(dá)明顯降低，p-NF-κB表達(dá)明顯降低，提示CA可能通過NF-κB信號(hào)通路抑制炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，進(jìn)而抑制AD小鼠腦內(nèi)的免疫炎癥反應(yīng)，最終延緩AD的病理進(jìn)程。免疫熒光雙標(biāo)記染色結(jié)果進(jìn)一步揭示，CA可抑制AD小鼠腦內(nèi)Aβ的生成以及減少Aβ的沉積數(shù)量，抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的活化。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，CA改善AD小鼠的認(rèn)知功能障礙，為今后在臨床上CA防治AD提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，CA可通過抑制APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)免疫炎癥反應(yīng)，進(jìn)而減少AD小鼠腦內(nèi)的Aβ沉積數(shù)量，最終改善AD的認(rèn)知功能障礙。本研究為CA今后用于防治AD提供了有力的理論依據(jù)。