膀胱癌患者血清中腫瘤異常蛋白和細胞角蛋白19的表達及其臨床意義

邱忠凱，劉俊龍，丁全明，梁偉

（本溪市中心醫院泌尿外科，遼寧 本溪 117000）

膀胱癌是全球范圍內常見的癌癥類型之一［1］。 根據美國癌癥協會預測，2022年美國將有約81 180例膀胱癌新發病例和17 100例膀胱癌相關死亡病例［2］。男性膀胱癌發病率較高，發病年齡多為60歲以上，吸煙、老齡化和接觸化學工業產品等是膀胱癌的風險因素［3］。近年來，膀胱癌的臨床診斷和治療方式取得了一定進展，但膀胱癌的高轉移率一直是困擾臨床治療的難題［4］。因此，全面了解膀胱癌的發病機制、尋找有意義的臨床輔助診斷指標有助于改善患者的預后。近年研究［5］發現癌細胞在代謝過程中，釋放出復雜的異常糖蛋白和鈣阻蛋白，組成腫瘤異常蛋白 （tumor abnormal protein，TAP）。當腫瘤細胞產生的 TAP達到一定量時可在患者外周血或末梢血中檢出。研究［6］表明TAP在乳腺癌、結腸癌、胃癌等惡性腫瘤患者血清中表達上調。細胞角蛋白 （cytokeratin，CK） 是一類由CK基因編碼的水溶性聚合多肽。CK19是一種CK蛋白小分子，主要分布于上皮組織，是構成細胞骨架的中間微絲，廣泛表達于肺癌、結腸癌和乳腺癌等惡性腫瘤中［7］。TAP和CK19在膀胱癌患者血清中的表達水平研究鮮有報道。血清腫瘤標志物檢測具有便捷、快速的優點，近年來已獲得臨床認可［8］。因此，對早期惡性腫瘤進行血清學腫瘤標志物檢測具有重要參考價值。本研究探討膀胱癌患者血清中TAP及CK19的表達情況，分析兩者之間及與膀胱癌的臨床病理特征間的相關性，旨在為膀胱癌的診斷提供新的參考及依據。

1 材料與方法

1.1 臨床資料及分組

選取2020年1月至2021年1月我院收治的70例膀胱癌患者作為膀胱癌組。納入標準：（1） 病理學確診為膀胱癌且為初發；（2） 無其他惡性腫瘤；（3） 未接受放、化療等其他治療。排除標準：（1） 合并泌尿系統其他基礎疾病；（2） 數據不完整。其中男42例，女28例；年齡46～79歲，平均年齡 （64.60±9.05） 歲；肌層浸潤25例，非肌層浸潤45例；淋巴結轉移陽性16例，腫瘤直徑＜3 cm 44例。選取同期我院體檢的63例健康人群作為對照組，其中男34例，女29例；年齡48～78歲，平均年齡 （62.65±7.49） 歲。選取同期我院診治的泌尿系統良性疾病患者54例為良性組，其中男29例，女25 例；年齡45～77歲，平均年齡（61.57±8.14） 歲。本研究已獲得我院醫學倫理委員會批準，患者及家屬均知情同意并簽署知情同意書。3組年齡、性別比較差異均無統計學意義 （均P＞0.05）。

1.2 主要試劑及儀器

TAP檢測試劑盒 （20173401893） 及TAP分析系統儀 （產品型號RS2011-A） 購自浙江瑞生公司，CK19酶聯免疫吸附試驗 （enzyme limked immunosorbent assay，ELISA） 試劑盒購自武漢博士康生物工程有限公司，酶標儀購自美國Bio-Rad公司，熒光顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.3 檢測方法

抽取患者清晨空腹靜脈血 （約3 mL），EDTA抗凝，按照試劑盒說明書進行血清TAP及CK19指標檢測。每個標本重復3次并計算平均值。

1.3.1 凝集法檢測血清TAP水平：取約1 mL新鮮全血制備載玻片，均勻涂片后室溫下干燥15 min，載玻片中加入凝固劑，2 h后觀察測量形成的凝集粒子面積。凝聚物顆粒面積 ≥121 μm2時判定TAP高表達，否則為TAP低表達。

1.3.2 ELISA檢測血清CK19水平：全血離心后分離上層血清，設置標準品孔和樣本孔，標準品孔及樣本孔加入CK19抗體后按照說明書步驟加入終止液，隨后用酶標儀檢測各孔的吸光度 （optical density，OD） 值。根據樣本OD值計算對應的濃度值。CK19正常范圍為0～7 ng/mL，＞7 ng/mL為高表達，否則為低表達。

1.4 統計學分析

利用SPSS 23.0和GraphPad Prism 7.0軟件進行統計分析，正態分布的計量資料采用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析；不符合正態分布的計量資料采用M（P25～P75） 表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。計數資料組間比較采用χ2檢驗。采用Spearman線性相關分析TAP及CK19相關性。受試者操作特征 （receiver operating characteristic，ROC） 曲線分析及圖形繪制采用MedCalc 20.106 統計軟件。P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組血清中TAP及CK19表達水平比較

結果顯示，與對照組和良性組比較，膀胱癌組TAP及CK19表達水平顯著增高 （均P＜ 0.001），而對照組和良性組TAP及CK19表達水平比較無統計學差異 （均P＞ 0.05）。見圖1。

圖1 3組TAP和CK19表達水平比較Fig.1 Expression levels of TAP and CK19 in different groups

2.2 膀胱癌患者血清中TAP及CK19表達水平與各項臨床指標的相關性

結果顯示，TAP和CK19表達水平與腫瘤直徑明顯相關 （均P＜ 0.05）；TAP表達與腫瘤浸潤深度明顯相關 （P＜ 0.01）。腫瘤越大，TAP及CK19表達水平越高。而TAP表達水平與年齡、性別、淋巴結轉移均不相關 （均P＞ 0.05）；CK19表達與年齡、性別、淋巴結轉移和腫瘤腫瘤浸潤深度均不相關 （均P＞ 0.05）。見表1。

表1 膀胱癌患者血清中TAP和CK19的表達水平與各項臨床指標的相關性Tab.1 Correlation between TAP and CK19 expression and clinical data in patients with bladder cancer

2.3 膀胱癌患者血清中TAP及CK19水平的相關性

Spearman線性相關分析膀胱癌患者血清TAP及CK19水平的相關性。結果顯示，血清TAP和 CK19水平呈正相關 （r= 0.362 3，P= 0.002 1），見圖2。

圖2 膀胱癌患者血清中TAP和 CK19表達的相關分析Fig.2 Correlation between TAP and CK19 expression in the serum of bladder cancer patients

2.4 血清TAP和CK19單獨及聯合檢驗對膀胱癌的診斷價值

以TAP ≥ 121 μm2，CK19＞7 ng/mL為陽性診斷標準繪制ROC曲線，TAP、CK19和二者聯合檢測的曲線下面積 （area under curve，AUC） 分別為0.904、0.895、0.932，約登指數分別為0.606、0.627、0.692，靈敏度分別為0.971、0.786、0.914，特異度分別為0.635、0.841、0.778。聯合檢測的診斷價值明顯優于TAP及CK19單獨檢測見圖3、表2。

表2 TAP、CK19及聯合檢測對膀胱癌的診斷價值參數Tab.2 Diagnostic parameters of TAP，CK19 and the combination of TAP and CK19 for bladder cancer

圖3 TAP、CK19單獨及聯合檢測的ROC曲線Fig.3 ROC curve of TAP，CK19 and the combination of TAP and CK19

3 討論

目前，膀胱鏡下膀胱黏膜病理活檢以及輔助的尿脫落細胞學檢測被認為是膀胱癌診斷的金標準［9］。膀胱癌治療方式主要包括手術治療 （膀胱鏡下電切、膀胱全切、淋巴結清掃等） 和術后生物免疫治療 （膀胱內灌注化療藥物、卡介苗等）。已有研究［10］顯示約75%患者初步診斷時為非肌層浸潤性膀胱癌。非肌層浸潤性膀胱癌有復發或發展為肌層浸潤性的趨勢，因此定期膀胱鏡下評估是必需的［11］。然而膀胱鏡檢查是侵入性檢查，而且費用昂貴，因此尋找無創且經濟的早期診斷方法尤為重要。

近年來，越來越多的血清腫瘤標志物 （AFP、CEA、CA19-9等［12］） 被應用于臨床前診斷及篩查。研究［13］表明TAP的產生與腫瘤發生、發展、轉移及預后存在密切關系。TAP水平間接表明細胞癌變的數量和程度［5］。結直腸癌患者中TAP的檢測具有較高的靈敏度和特異度，此外，TAP也被作為一種新的預后獨立指標應用于結直腸癌患者化療和臨床監測中［14］。CK19作為上皮細胞分化的特異標志物，在肺癌、乳腺癌、結腸癌等惡性腫瘤中表達上調，與相關惡性腫瘤的發生、發展均有較明確的臨床意義［7］。研究［15］表明CK19上調與肝癌患者的預后不良有關。

本研究結果顯示，與膀胱良性疾病患者和健康人群相比，膀胱癌患者血清中TAP和CK19表達明顯上調，與以往研究［16-17］結果一致。本研究結果顯示良性組與對照組血清TAP和CK19表達水平無統計學差異 （均P＞ 0.05），說明TAP和CK19的表達主要來源于腫瘤細胞，提示二者可作為膀胱癌標志物用于早期診斷。診斷價值分析結果顯示，TAP與CK19聯合檢測的診斷價值高于單獨檢測，因此TAP與CK19聯合檢測有助于膀胱癌的早期診斷。

綜上所述，膀胱癌患者血清中TAP及CK19高表達，二者表達水平與腫瘤大小相關，TAP及CK19有望成為膀胱癌診斷的腫瘤標志物；TAP和CK19聯合檢測有助于提高膀胱癌的診斷價值。本研究的不足之處：（1） 樣本量較小，尚需大樣本、多中心研究完善檢測體系；（2） 入組膀胱癌患者術后未進行TAP和CK19表達水平的復檢和系統的病程隨訪，無法通過TAP及CK19的檢測水平評估患者預后情況，因此須進一步研究論證。