豫中馬鈴薯早疫病病原菌的分離鑒定及防治藥劑篩選

魯進恒 東瑩瑩 袁 謙 范志業 張中州 吳 浩 王秋嶺

（1.漯河市農業科學院 河南漯河 462000；2.河南省修武縣農業技術推廣中心 河南修武 454350）

馬鈴薯是一種重要的糧菜兼用農作物， 因其營養全面，產品開發鏈長，有著巨大的市場需求。 隨著我國農業產業結構調整和馬鈴薯主糧化加速，其種植區分布逐漸趨于合理[1]，產品也實現了周年化供給[2]，整個產業呈現穩步向好的局面。

早疫病是馬鈴薯生產上僅次于晚疫病的第2 大病害，近年來，國內的發病狀況呈逐漸加重的趨勢[3]。該病可影響植株葉片、莖稈及塊莖的生長，顯著降低馬鈴薯的產量和品質，嚴重時減產可達39%[4]。 關于早疫病的研究，在各種植區皆有大量的報道，張建平等[5]研究了關于馬鈴薯早疫病孢子傳播方式、病害發生規律及其與氣象因子的關系，谷青等[6]報道了北方一作區馬鈴薯早疫病病菌不同地理群體的遺傳結構，吳志會等[7]篩選出了適合冀東地區防治馬鈴薯早疫病的藥劑，何凱等[8]明確了重慶地區的馬鈴薯早疫病致病菌種類及其生物學特性，趙雨佳等[9]篩選了適合重慶地區防治馬鈴薯早疫病的藥劑。

豫中地區作為國家重要的糧食和蔬菜生產基地，馬鈴薯的播種面積在逐年增加，早疫病幾乎連年發生。 但本地區關于早疫病的研究較少，致病菌種類尚未明確，缺乏有針對性的防治方法。 為此，本研究通過組織分離法對豫中5 地的馬鈴薯早疫病的病原菌進行分離純化， 采用形態學的方法進行了菌株鑒定，并用室內毒力測定法篩選出了防治藥劑，為有針對性地開展馬鈴薯早疫病的防治提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料：于2022 年4-6 月，采集漯河、南陽、開封、周口、駐馬店豫中5 地市的馬鈴薯患病葉片。

供試藥劑：75%百菌清可濕性粉劑，由先正達（蘇州） 作物保護有限公司生產， 商品名稱為好迪施；500 g/L 氟啶胺懸浮劑， 由日本石原產業株式會社生產，商品名稱為福帥得；70%丙森鋅可濕性粉劑，由拜耳作物科學（中國）有限公司生產，商品名稱為安泰生；50%啶酰菌胺可濕性粉劑，由巴斯夫（中國）有限公司生產， 商品名稱凱澤；250 g/L 嘧菌酯懸浮劑，由先正達（南通）作物保護有限公司生產，商品名稱為阿米西達。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌的分離與純化 采用組織分離法對病葉進行病原菌分離。 用無菌水反復沖洗病葉，剪取葉片病健交界處2～3 mm2組織塊，75%乙醇溶液處理3～4 s，0.1%氯化汞消毒15～20 s， 取出后用無菌水反復沖洗3～5 遍，晾干置于PDA 平板上，在26℃的培養箱中黑暗培養，48 h 后挑取菌落邊緣的菌絲進行純化， 在26℃下培養5 d 后對純化菌落再次進行單孢純化[10]，獲得純化菌株后保存于PDA 斜面上，置于4℃冰箱保存備用。

1.2.2 致病性測定 采用菌絲塊接種法進行致病性測定[11]。 取葉齡大小一致的離體健康馬鈴薯葉片，用無菌水沖洗1～2 遍，用75%乙醇表面消毒1 min 后，用無菌水沖洗2～3 遍，置于培養皿中備用，皿底鋪無菌紗布保濕。先將已分離菌株在PDA 上活化，后用直徑為5 mm 的打孔器在菌落邊緣打取菌餅，并用滅菌后的接種針對葉片作刺傷處理， 將菌餅接種到傷口處。 以無菌PDA 塊作為對照，置于26℃光照培養箱培養（光周期12L∶12D），每24 h 觀察1 次。 待發病后再次從病斑處分離病原菌， 并與首次分離的病原菌作對比。

1.2.3 形態學鑒定 將純化后的病原菌菌株在PDA培養基上26℃光照培養7 d，觀察并描述菌落形態及顏色、 培養基質顏色和分生孢子形態， 作為鑒定的主要依據。參照張天宇[12]的真菌鑒定方法進行形態學鑒定。

1.2.4 殺菌劑室內毒力測定 采用菌絲生長速率法測定5 種殺菌劑對病原菌菌絲生長的抑制效果[13]。用無菌水將殺菌劑配制成母液， 每種殺菌劑按有效成分稀釋成5 個濃度梯度， 將不同濃度的殺菌劑加入PDA 中制成含藥平板， 以不加殺菌劑的PDA 為對照，每個濃度設4 次重復（表1）。 先將儲存的病原菌接種到PDA 上進行活化，在26℃的培養箱中黑暗培養5 d 后， 用5 mm 打孔器在菌落邊緣打取菌餅，并分別接到制備好的含藥PDA 平板和對照PDA 平板上，在26℃下黑暗培養7 d，用十字交叉法測量菌落直徑。

表1 5 種殺菌劑的濃度梯度

計算殺菌劑對菌絲生長的相對抑制率，抑制率=［對照菌落直徑-處理菌落直徑/（對照菌落直徑-0.5）］×100%。 將抑菌率換算成生物統計概率值（y），殺菌劑濃度換算成以10 為底的對數（x），根據濃度對數與概率值回歸法，做毒力回歸方程，計算5 種殺菌劑的抑制中濃度（EC50）及95%置信區間。利用DPS軟件進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 病原菌分離結果

通過對5 地采集的32 份患病葉片的組織分離，剔除雜菌，單孢純化后共得到93 份純化菌株。 其中培養基呈褐色的共64 株，培養基呈黃色或紅褐色共29 株，二者大致比例為7∶3。 在顯微鏡下觀察，64 株褐色菌株的菌絲形態基本一致，判定為同一種菌株，標記為A；29 株黃色菌株的菌絲和孢子形態也基本一致，判定為同一種致病菌，標記為B（圖1）。

圖1 病原菌菌落形態和孢子形態

2.2 致病性鑒定

將分離純化的2 種菌株活化培養5 d 后，分別取菌落邊緣的菌絲塊接種在健康的刺傷馬鈴薯葉片上，在光周期12 L∶12D 下26℃保濕培養4 d 發現，接種葉片與田間患病葉片癥狀基本相同， 應為兩者復合感染， 其中B 菌株接種后的葉片具有黑色較小的輪紋狀病斑，而A 則以褐色干枯為主（圖2）。 將接種發病的病斑分別進行再次分離， 獲得的病原菌與田間分離的病原菌一致。 依據柯赫氏法則，確定分離獲得的2 種菌株均為早疫病致病菌。

圖2 馬鈴薯早疫病田間癥狀及回接后的發病癥狀

2.3 病原菌的形態學鑒定

將2 種菌株分別接種在PDA 平板上，置于26℃下黑暗培養7 d，可形成圓形或近圓形菌落。 A 菌株的菌落為圓形（圖1A 菌落），菌絲初期為白色或灰白色，后轉為暗褐色，氣生菌絲發達。 后期培養基為黑褐色，說明菌絲可產生黑色色素。 分生孢子頂生，形態差異較大，有橢球形、倒棒狀或手雷形（圖1A 孢子），大小為（15～43）μm×（8～9）μm，有短喙，多數有隔膜，橫膈1～7 個，縱膈0～4 個。 B 菌株的菌落呈圓形或不規則橢圓形（圖1B 菌落）菌絲早期為白色，后轉為褐色，氣生菌絲不發達，能產生黃褐色色素，后期培養基呈黃色或磚紅色。孢子為倒棒狀（圖1B 孢子），量少，大小為（70～150）μm×（6～18）μm，有長喙，喙與孢身等長或略長，孢子有橫膈8～15 個，縱膈4～7 個。根據《中國真菌志》的記述，結合致病性鑒定，判定A 為鏈格孢、B 為茄鏈格孢。

2.4 殺菌劑室內毒力測定

由表2 可知，5 種藥劑對2 種菌株均有一定的抑制作用。 其中5 種藥劑對鏈格孢的EC50在3.262 7～13.457 4 mg/L； 啶酰菌胺的抑制效果最好，EC50為3.262 7 mg/L；嘧菌酯效果次之，EC50為3.480 2 mg/L，百菌清效果最差，EC50為13.457 4 mg/L。 5 種藥劑對茄鏈格孢的EC50在1.155 3～9.507 0 mg/L；嘧菌酯的抑制效果最好，EC50為1.155 3 mg/L；啶酰菌胺次之，EC50為1.951 2 mg/L，居于末位的依然是百菌清，EC50為9.507 0 mg/L。

表2 5 種殺菌劑對2 種病原菌的抑制作（單位：mg/L）

3 討論與結論

早疫病是馬鈴薯生產上的主要病害， 可在葉片上引起黑色輪紋狀病斑， 嚴重時導致大量葉片過早枯萎，此病害在豫中地區幾乎連年發生，嚴重制約馬鈴薯產業的健康發展。 本研究通過形態學的方法，將該地馬鈴薯早疫病致病菌確定為鏈格孢和茄鏈格孢，并明確了二者的比例為7∶3。

鏈格孢可致馬鈴薯早疫病的報道最早見于1984 年[14]，其 后Boiteux L S 等[15]對 其 致 病性 進 行 了更深入的闡述。 據Lourenco V 等報道茄鏈格孢為早疫病致病菌的優勢菌株[16]，而Kapsa J[17]和張福光[18]則分別比較了A. solani和A. alternata的致病性， 結果表明二者都可單獨致病。 但本試驗表明，在豫中地區馬鈴薯田A. alternata和A. solani的比例為7∶3，從數量上說，A. alternata為本地區的優勢菌株。

據已發表的報道來看， 除本試驗分離出的2 種致病菌外，尚有多種病原可致馬鈴薯早疫病。2009 年，Ardestani S T 報道在伊朗A. interrupta可導致馬鈴薯早疫病[19]， Rodrigues T T 報道了在巴西A. grandis也可導致馬鈴薯早疫病[20]， 2013 年鄭慧慧等總括報道了致馬鈴薯早疫病的病原菌可達8 種之多[21]。大量研究表明，在不同地域或生態條件下，馬鈴薯早疫病的致病菌存在著差異。 多種病原引起同一種病害，客觀上為早疫病的防治帶來了困難。

為了有針對性地防治豫中地區的馬鈴薯早疫病，本試驗選取了5 種常用殺菌劑，對分離出的2 種致病菌進行了毒力測定。 結果表明，對鏈格孢抑制效果最好的是啶酰菌胺，嘧菌酯次之；對茄鏈格孢抑制效果最好的是嘧菌酯，啶酰菌胺次之。 啶酰菌胺是一種線粒體呼吸鏈抑制劑，通過抑制線粒體琥珀酸酯脫氫酶活性，阻礙三羧酸循環，進而阻礙ATP 合成[22]，干擾能量傳遞，致菌體死亡；而嘧菌酯為一種內吸性殺菌劑，兼具保護和治療作用，其作用機制是通過阻止特定細胞色素， 導致線粒體電子傳遞受到抑制以干擾能量傳遞[23]，使細胞致死。 這2 種殺菌劑都具有廣譜、高效的特點，且都對人體安全，易于消解[24-26]，建議這2 種藥交替使用，以減緩病原抗藥性。