馬鈴薯脫毒與快繁技術

楊 霞 唐偉杰 俞慧勝 王麗莉 潘子涵 吳 莉 劉 麟 袁玉濤 褚玉婷

（1.培黎職業學院 甘肅張掖 734100； 2.甘肅天潤薯業有限責任公司 甘肅張掖 734100）

馬鈴薯屬茄科茄屬的一年生草本植物， 原產于南美秘魯,明末清初時傳入我國。其具有喜冷涼、適應性廣、生育期較短、產量高、營養價值高、用途廣等特點, 被譽為 “地下的蘋果”, 是我國第四大糧食作物,也是重要的糧菜兼用和工業原料作物。 自我國實施馬鈴薯主糧化戰略以來, 馬鈴薯的市場需求量越來越高，在農業生產中的地位日益凸顯[1]。 馬鈴薯為利用塊莖進行無性繁殖的作物， 在種薯繁育和生長期間易受病毒侵染導致產量和品質下降,經繼代積累造成種性退化,進而喪失利用的價值。 利用植物組織培養技術進行莖尖脫毒生產脫毒苗、 鑒定合格的脫毒苗繼代擴繁、溫網室定植繁育原原種、原原種繁育原種，建立良種繁育體系生產優良種薯, 成為保證馬鈴薯高產、優質的有效措施[2]。

1 脫毒苗的制取

1.1 外植體（脫毒材料）的選取

在馬鈴薯生長期間， 田間選擇具有原品種優良特性（包括株型、葉型、花色、成熟期等性狀），生長健壯，無明顯病毒性、類病毒性、真菌性、細菌性病害癥狀的馬鈴薯植株作為目標植株，做好標記，加強日常觀測管理，防止病蟲害侵染。 成熟時提前單獨收獲并進行再次挑選，選擇結薯率、單株產量和大薯率高、薯塊無病斑、蟲蛀和機械損傷的材料（植株），收獲其塊莖，帶到實驗室備用。 為了提高脫毒成功率，馬鈴薯脫毒材料的選擇盡可能的在原種繁育田及原原種繁育溫室或網室中選擇[3]。 由于馬鈴薯紡綞塊莖病是由類病毒（PSTV）引起的，目前用植物莖尖分生組織方法難以脫除， 因此在進行脫毒前要對入選的塊莖進行PSTV 檢測，淘汰帶有PSTV 的塊莖[4]。

1.2 外植體處理

1.2.1 打破休眠 種薯收獲后， 可自然通過休眠期或采取人工打破休眠期。 若人工打破休眠， 可將塊莖放入35℃恒溫培養箱中， 每天光照16 h， 光照度2 000 1x，放置30 d 左右后，用赤霉素溶液(濃度10%～20%）浸泡20～30 min，做催芽處理。

1.2.2 外植體滅菌 馬鈴薯選取芽作為外植體，由于外植體取自于田間， 材料含微生物， 不能直接培養，必須表面滅菌才能培養。

（1）預處理：把入選的馬鈴薯塊莖進行打破休眠和催芽處理后，當薯塊頂芽生長至1 cm 時，轉入光照培養箱內，以每天12 h、光照度3 000 lx、37℃的高溫處理6～8 周。

（2）滅菌：剪取經過熱處理后發芽塊莖上2～3 cm長的芽若干個，放入玻璃燒杯內，先用淡淡的加酶洗衣粉浸泡1～2 min，同時不停振蕩，沖刷芽上的塵土，然后在燒杯口扎塊紗布，放在水龍頭下，采用小水流沖洗，持續沖洗2～3 h，最后用濾紙吸干芽表面水分后放入超凈工作臺進行嚴格消毒。 在超凈工作臺內首先用75%酒精浸泡30～45 s，并不斷震動，使75%酒精作用到芽的每個部位， 其次用無菌水沖洗3～4 遍，然后根據不同的品種和芽尖的大小，用0.1%升汞（HgCl2）浸泡并不斷晃動5～10 min，或在5%漂白粉［Ca（C1O）2］溶液中浸泡5～10 min，最后用無菌水清洗3～4 次， 處理完后將芽放在濾紙上吸干水分待用（濾紙需提前用高壓蒸汽鍋滅菌）。

1.3 莖尖剝離及組織培養

1.3.1 莖尖剝離 把消毒好的芽放在40 倍的解剖鏡下，剝去頂芽和腋芽上較大的幼葉，逐層剝離直到露出圓滑的生長點，小心切取大小0.3～0.5 mm、含有1～2 個葉原基的莖尖組織，立即接種到帶有培養基的試管中，每支試管接種1 個莖尖。

1.3.2 莖尖培養 ①培養基的選取：馬鈴薯莖尖培養較理想的培養基為MS+NAA 0.5 mg/L+6-BA 0.1 mg/L或MS+KT 0.4 mg/L+GA30.2 mg/L+NAA 0.1 mg/L，加入GA3對莖尖成苗有促進作用， 培養基pH 5.8～6.0。②培養條件：白天溫度24℃左右，晚上18℃，上下浮動不超過1℃。 光照度1 500～2 000 lx， 光照時間以14 h/d 為宜。30～40 d 莖尖可明顯伸長，4 個月左右發育成3～4 片葉的小苗。 這時在無菌條件下進行單節切段， 并接種于帶有培養基的培養瓶中繼續培養。25 d 左右又可進行單節切段擴繁。

2 脫毒苗的鑒定

莖尖培養獲得的試管苗， 經嚴格檢測后才能確認為脫毒苗。馬鈴薯脫毒苗需檢測的病害有馬鈴薯X病毒（PVX）、馬鈴薯Y 病毒（PVY）、馬鈴薯S 病毒（PVS）、 馬 鈴 薯M 病毒 （PVM）、 苜 蓿 花 葉 病 毒（AMV）、 馬鈴薯卷葉病毒 （PLRV）、 馬鈴薯A 病毒（PVA）、馬鈴薯帚頂病毒（PMTV）、馬鈴薯紡錘塊莖類病毒（PSTV）、細菌性青枯病、細菌性環腐病、細菌性軟腐病和細菌性黑脛病[5]。 通常采用雙抗體酶聯免疫吸附法檢測馬鈴薯病毒病， 用往復聚丙烯氨酰胺凝膠電泳檢測技術檢測馬鈴薯紡錘塊莖類病毒。

3 馬鈴薯組培苗快繁

3.1 快繁前的準備

3.1.1 滅菌 ①環境滅菌： 組培中心定期進行熏蒸消毒（一般間隔時間為15 d），通常可使用高錳酸鉀和甲醛以1∶2 的比例熏蒸（熏蒸24 h，然后通風換氣）。接種室每天早晨先用75%酒精噴霧降塵， 再打開室內和超凈工作臺的紫光燈滅菌，30 min 后關閉紫光燈，打開超凈工作臺風機至最大檔通風30 min。 每晚室內用84 消毒液噴灑地面，打開室內紫光燈滅菌1 h。②工具滅菌: 接種所用的工具在前一天用報紙包好，放入高壓蒸汽滅菌鍋中121℃、0.15Mpa、滅菌1～2 h。具體消毒滅菌流程見圖1。

圖1 接種前消毒滅菌流程

3.1.2 培養基制備 ①培養瓶的準備： 培養瓶需先在0.3%的高錳酸鉀溶液中浸泡10 min， 然后用清潔熱水加入適量洗衣粉， 人工或用組培專用洗瓶機洗干凈， 最后換水沖洗干凈倒置在盤中待水珠晾干后備用。 ②培養基的制備：馬鈴薯組培苗快繁通常采用MS 培養基。 配制培養基是日常必做的工作之一，各成分可以按配方要求一一加入，但很不方便，也很難達到準確和精確。 為簡便起見，通常先配制成一系列母液， 配方詳見表1。 母液要放在2～4℃的冰箱中保存，存放時間不宜過長。

表1 MS 培養基配方

馬鈴薯快繁培養基可使用卡拉膠（5.4 g/L）或瓊脂（7 g/L）作為凝固劑；用30 g/L 白糖調節滲透壓，有些特殊的品種可增加0.5%～1.0%的白糖。 培養基pH調至5.8，通常偏酸的情況較多，可用1 mol/L NaOH溶液調節。 制作好的培養基應在24 h 內用高壓蒸汽鍋滅菌。 配制流程詳見圖2。

圖2 培養基配置流程

3.2 馬鈴薯組培苗快繁

經嚴格檢測，確定為不含病毒的組培苗，即可大量繁殖。馬鈴薯快繁一般采用單節切段轉接方法。具體操作流程見圖3。

圖3 組培苗快繁流程

馬鈴薯快繁過程中，應注意以下幾點：①接種工具每次使用前用酒精燈或高溫滅菌器滅菌， 防止交叉污染；②消毒器、裝有75%酒精的消毒瓶、冷卻架、酒精棉瓶、噴壺等工具置于臺面慣用手側，培養基、母苗瓶等其他物品置于相對一側，無菌培養皿、酒精燈放于人員正前方，酒精燈朝內；③操作應在酒精燈火焰的有效范圍內進行； ④接種工具灼燒后充分冷卻，防止燙傷組培苗；⑤接種時夾取組培苗用力要適當， 組培苗和手指不能觸及瓶口； ⑥手臂勿在培養基、接種器上方經過；⑦無菌操作時不要講話，雙手不要超出超凈工作臺邊緣。

4 馬鈴薯組培苗培養

4.1 溫度

馬鈴薯屬喜涼作物， 組培苗的生長溫度在17～25℃之間均能生長良好。 通常白天溫度設置為23℃，晚間溫度為17℃，日累積溫度在40℃比較合適，上下浮動不超過1℃。 組培苗在有溫差的條件下生長，莖粗葉大，不易倒伏，便于繼代繁殖和移栽。

4.2 濕度

組培室最佳濕度控制在60%左右， 不宜超過65%，若濕度過高需開啟除濕機除濕，并及時排清除濕機的水。 在陰雨季節需一天檢查2 次，及時清理除濕機，防止雜菌滋生。

4.3 光照

馬鈴薯組培苗的光照時間一般為16 h， 大部分馬鈴薯的組培苗需要的光照度為3 000 lx（需2 支28W T5 燈管），高溫季節繁苗溫度過高，無法將組培室控制在適宜的溫度，尤其夜間溫度過高，日累積溫度超出40℃時可以將光照時間縮短至15 h/d， 但不能低于14 h/d。

5 馬鈴薯組培苗快繁中常見問題

5.1 污染問題及預防措施

5.1.1 污染問題 馬鈴薯組培苗生產過程中污染是最常見和首要解決的問題。 污染是由于培養基和培養材料滋生雜菌，造成培養材料不能生長發育，導致培養失敗的現象。 引起馬鈴薯組培苗污染的污染源主要有真菌和細菌兩大類， 細菌性污染通常在接種后1～2 d 即表現出來，癥狀是菌落呈黏液狀，顏色多為白色，與培養基表面界限清楚；真菌污染一般在接種3 d 以后才表現出來，真菌污染癥狀是新形成的菌落多為黑色、綠色、白色的絨毛狀、棉絮狀，與培養基和培養物的界限不清。

造成污染主要有以下幾個原因： ①培養基滅菌不徹底；②材料帶菌，也就是對選取的外植體消毒不徹底； ③操作人員在操作過程中未嚴格遵循無菌操作的原則；④無菌室和培養室環境不清潔；⑤操作設備及使用工具消毒不徹底[6]。 培養基滅菌不徹底或材料帶菌會造成成批接種材料被細菌污染， 操作人員不嚴格遵守操作規程也是造成細菌污染的主要原因，培養環境不清潔、超凈工作臺的過濾器失效、培養容器的口徑過大等是引起真菌污染的主要原因[7]。

5.1.2 預防污染的措施 在實際生產中要明辨馬鈴薯組培苗污染的類型和引起污染的原因， 以便有針對性地采取防治措施，從而提高組培效率和質量。 通常從以下幾方面控制污染的發生： ①要減少或防止材料帶菌， 做到選取的材料植株具有品種的典型特征、健壯、無病蟲害，選取的塊莖具有品種代表性、無病斑、無機械創傷，選取的芽要健壯；②外植體的滅菌要徹底。 馬鈴薯組培選擇芽作為外植體，對芽滅菌時先在流水中沖洗30 min 左右， 然后用75%的酒精浸泡10～30 s，無菌水漂洗3～4 次，再用0.1%的升汞浸泡5～10 min，無菌水漂洗3～4 次；③培養基及各類器皿應嚴格滅菌。 培養基和接種器械通常使用高壓滅菌鍋滅菌，要求在121℃下滅菌20～30 min，要保證滅菌時間和滅菌溫度， 在使用過程中使用的器械要經常蘸取酒精后在酒精燈上灼燒或用高溫滅菌器滅菌；④嚴格無菌操作，防止操作中帶菌。 接種人員要注意個人衛生，洗手后進入接種室，接種過程經常用75%酒精擦手，在酒精燈有效范圍內操作。接種時，雙手不能離開臺面，如果離開工作臺，必須用酒精擦手后再接種，接種時開瓶和封口的動作要輕、要快，盡量避免在接種用具和培養皿、 揭開的培養瓶上方移動，操作區不要一次放入過多的空培養基；⑤保持環境清潔。 培養室和接種室定期滅菌，應定期使用高錳酸鉀和甲醛進行熏蒸消毒，通常一年熏蒸2～3 次，平時每天可通過75%酒精或84 消毒液噴霧消毒并結合紫外線照射消毒，也可使用臭氧消毒機。 及時揀出被污染的組培苗，定期清洗或更換超凈臺過濾器，經常用擦拭或噴霧方法清潔超凈工作臺， 嚴格控制人員出入培養室。

5.2 玻璃化問題及預防措施

5.2.1 玻璃化問題 馬鈴薯脫毒苗在多次繼代培養中，還會發生馬鈴薯試管苗的莖、葉變成半透明水浸狀，繁殖系數明顯下降，難以誘導生根，即使誘導生根，其根系質量差，移栽成活率極低的玻璃化現象，玻璃化是植物組織培養過程中所特有的一種生理失調或生理病變[8]。

引起玻璃化的原因有以下幾點：①光照。 如果光照時間大于16 h，容易發生玻璃化現象；②溫度。 馬鈴薯是喜涼作物，組培苗的生長溫度在17～25℃之間均能生長良好，但當溫度過低時容易形成玻璃化苗；③繼代培養代數多。 一般組織培養過程中繼代培養代數越多，玻璃化現象越嚴重；④培養基成分和激素濃度。 培養基中無機離子的種類、濃度及其比例不適宜該品種組培苗則玻璃化苗的比例增大， 培養基中含氮量過高也會導致試管苗玻璃化，6-BA 濃度越高玻璃化產生的比例越大； ⑤培養瓶內濕度和通氣情況。 試管苗生長期間，要求氣體交換充分、良好，如果培養瓶口密封過嚴瓶內外氣體交換不暢， 造成瓶內空氣濕度和培養基含水量過高，容易誘發玻璃化苗。

5.2.2 預防玻璃化的措施 預防玻璃化的措施：①適當增加培養基中無機鹽的含量， 降低培養基中銨態氮濃度提高硝態氮濃度；②增加自然光照，延長光照時間，自然光中的紫外線能促進試管苗成熟，加快木質化；③加入其他物質，如活性炭、多效唑、矮壯素等。

5.3 褐變問題及預防措施

5.3.1 褐變問題 褐變是指外植體在培養過程中，自身組織從表面向培養基釋放出褐色物質， 導致培養基逐漸變成褐色， 外植體也隨之進一步變褐而死亡的現象[9]。 發生的原因是植株體內的多酚氧化酶被激活， 使細胞里的酚類物質氧化成棕褐色的醌類物質，當擴散到培養基后會抑制其他酶的活性，從而影響所接種外植體的培養[7]。

影響褐變的因素極其復雜，隨著植物的種類、基因型、 外植體的生理狀態和取材季節、 外植體的部位、培養基成分、培養條件、外植體大小、受傷程度及材料轉移時間等差異而不同。

5.3.2 預防褐變的措施 針對褐變發生的原因，通常采用以下措施來防治褐變的發生， ①選擇適宜的外植體和最佳培養基； ②對容易褐變的材料可連續繼代（轉移）培養；③加入抗氧化劑，如半胱氨酸、抗壞血酸、PVP 等。

5.4 彎鉤組培苗

在產業化生產、組培苗大量擴繁中，為了避開用電高峰或節約用電， 將組培室白天給光照改為夜間給光照或16 h 的給光時間變成間歇給光照， 中間關閉光照，間隔2 h 或3 h 再供給光照，同時組培室日累積溫度偏高， 就會造成組培苗生長點彎鉤、 不開葉。 這時，若將光照與溫度同步，晝夜有溫差、夜間黑暗、白天有光照，組培苗會逐步恢復正常。

5.5 爛頭苗

有一類組培苗， 培養基上和根系上沒有明顯的雜菌感染， 但是組培苗的生長點或苗的上半部有萎蔫的現象。 此時，打開瓶蓋能聞到細菌感染葉片的酸味， 這種細菌感染是由于封口膜或瓶蓋有細小的縫隙，培養溫度落差過大，瓶內充滿水汽，細菌進入組培瓶感染了組培苗；或無菌接種室環境消毒不徹底，空氣中有細菌落在植株葉片上，慢慢滋生了細菌。

5.6 組培苗葉片發黃

馬鈴薯組培苗培養中， 通常會出現2 種不同情況的黃葉。 第一種是組培苗的底葉發黃，最后枯落，這種情況是由于母苗在生長中光照不夠，葉薄、干物質累積比較少，當繼代擴繁后，莖段的養分供給發根和新葉腋的生長，造成底部葉片養分不足而發黃；第二種黃葉是整個植株從上到下都出現葉肉發黃，主要是由于MS 培養基配制時，螯合鐵液變成棕紅色鐵沉淀造成植株缺鐵所致。

5.7 組培苗基部長氣生薯

出現這種現象通常是由于苗齡時間太長、 培養溫度偏低、光照時間太短，造成腋芽處形成小薯或底部結薯。

5.8 組培苗內生菌感染

在生產淡季，按照操作規程分苗，工作量小，組培苗內生菌感染概率相對小或不發生。 但產業化生產旺季，組培苗均會受到內生菌的感染，這是分苗速度與分苗質量的矛盾點，計件制薪酬，會使工人速度加快， 相對忽略了操作規程， 增加了內生菌的感染率。 內生菌最大的危害是隨著組培苗的擴繁，內生菌不斷增多，表現為組培苗不長根、易爛苗、不能繼代擴繁，嚴重時使組培苗全部淘汰。 若移栽到大棚生根會比健康苗慢，還容易死苗。 因此在感染早期就需加以識別和剔除，做到“一看二聞三觀察”。 從挑母苗起，一看瓶底組培苗根部是否有內生細菌污染；二打開瓶蓋聞， 有內生菌感染的瓶苗會聞到細菌侵染的酸味；三觀察，內生菌初期感染用肉眼不易確認，需仔細觀察植株根部是否有牛奶狀的乳白色液體小點，若發現需及時挑出，不能再作為母苗繼代繁殖[10]。