氣相色譜法測定2,6-二甲基苯胺中的10種相關雜質

郄一奇,韓靜,湯金春,鐘毓靈,張皓閱,蘇夢翔,3,4*

(1.中國藥科大學 藥學院藥物分析系,江蘇 南京 210009;2.常州康普藥業有限公司,江蘇 常州 225600;3.藥物質量與安全預警教育部重點實驗室(中國藥科大學),江蘇 南京 210009;4.國家藥品監督管理局藥物制劑及輔料研究與評價重點實驗室,江蘇 南京 210009)

2,6-二甲基苯胺(2,6-Dimethylaniline,2,6-DMA)是苯環上2-,6-位置的氫原子被甲基取代后形成的芳香伯胺,是制備利多卡因、吡咯卡因、布比卡因等酰苯胺類局部麻醉藥的關鍵起始物料之一[1],也常被用于農藥、染料、抗氧化劑、香料、合成樹脂等的制造[2]。此外,該化合物是利多卡因、賽拉嗪等藥物的關鍵代謝物[3-4],也是一種可能的人類致癌物(2B類致癌物)[5]。

2,6-DMA可由原料間二甲苯經硝化還原制得[6]。基于其生產工藝,原料間二甲苯、中間體2,4-二甲基硝基苯和2,6-二甲基硝基苯、副產物2,4-二甲基苯胺均屬于關鍵雜質需進行質量控制。此外,間二甲苯由混合二甲苯分離制得[7]。間二甲苯中可能含有的鄰二甲苯、對二甲苯、甲苯等雜質,也會在后續反應中生成其他二甲基苯胺異構體雜質和甲苯胺異構體雜質。這些異構體雜質結構相似,可能具有相似或者更為嚴重的毒性[8]。因此,嚴格控制2,6-DMA中的有關物質和異構體雜質,以盡量減少后續步驟中類似異構體雜質的形成,對于開發更安全、更有效的藥物至關重要。2,6-DMA及其相關雜質的化學信息如表1所示。

表1 2,6-DMA及其雜質的化學信息表

目前,已報道的分析方法主要集中于2,6-DMA異構體的分離,多采用衍生化或新型固定相氣相色譜法[9-13],操作繁瑣,容易產生副產物,適用性不高。Marrisetti等人開發了超高效液相色譜法對6個2,6-DMA異構體和2個降解雜質鄰甲苯胺、對甲苯胺進行定量分析[14],但該方法依賴于高性能儀器,且未涵蓋原料間二甲苯和中間體2,4-二甲基硝基苯、2,6-二甲基硝基苯等關鍵雜質。

本研究使用市售毛細管色譜柱對2,6-DMA中的10種雜質(原料、中間體、副產物、異構體雜質、降解雜質)進行直接分離,采用氣相色譜外標法進行定量分析,較已有方法操作更加簡單、涵蓋雜質種類更多、適用性更強。方法已成功運用于鹽酸利多卡因起始物料2,6-DMA的質量控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Thermo Trace 1310氣相色譜儀,含氫火焰離子化檢測器、AI 1310自動進樣器和Chromeleon 7.2 SR5數據工作站,美國Thermo公司;MSE125P十萬分之一電子天平,瑞士Sartorius公司。

1.2 藥品與試劑

間二甲苯(純度99.2%,批號05-Jan-LX41-9-06)、2,4-二甲基硝基苯(純度98.6%,批號13-Nov-LT18-4-05)、2,3-二甲基苯胺(純度100%,批號30-Dec-LD98-7-03)、2,4-二甲基苯胺(純度99.1%,批號11-Jan-LD17-2-05)、2,5-二甲基苯胺(純度100%,批號27-Sep-LD98-5-03)、3,4-二甲基苯胺(純度98.7%,批號06-Mar-LD98-8-04)、3,5-二甲基苯胺(純度100%,批號24-Sep-LD98-6-03)、鄰甲苯胺(純度98.9%,批號04-Mar-LT83-2-02)、對甲苯胺(純度99.3%,批號06-Mar-LT83-4-02)均購于美國Lovan Research Chemicals公司;2,6-二甲基硝基苯(純度99.8%,批號21100052)、2,6-二甲基苯胺(純度99.5%,批號21040820)均購于中國壇墨質檢科技股份有限公司;2,6-二甲基苯胺樣品(批號20210120、20210310、20210625)均購于常州市如立化工有限公司;甲醇為色譜純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱DB-FFAP型毛細管柱(30 m × 0.25 mm × 0.25 μm);程序升溫,起始溫度為60 ℃,維持10 min,以15 ℃/min的速率升溫至110 ℃,維持56 min,再以25 ℃/min的速率升溫至200 ℃,維持10 min;進樣口溫度230 ℃;氫火焰離子化檢測器溫度235 ℃;載氣氮氣;流速1.0 mL/min;分流比10∶1;進樣量1 μL。

2.2 溶液配制

對照品儲備液:取各雜質對照品50 mg,精密稱定,分別置5 mL棕色量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,制成每1 mL中含10 mg的各雜質對照品儲備液。

對照品混合儲備液:分別精密量取各雜質對照品儲備液500 μL,置10 mL棕色量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,制成每1 mL中含500 μg的雜質對照品混合儲備液。

對照品溶液:精密量取對照品混合儲備液1 mL,置10 mL棕色量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,制成每1 mL中含50 μg的對照品溶液。

供試品溶液:取供試品500 mg,精密稱定,置10 mL棕色量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,制成每1 mL中含50 mg的供試品溶液。

系統適用性溶液:取供試品500 mg,精密稱定,置10 mL棕色量瓶中,加適量甲醇溶解,加入雜質對照品混合儲備液1 mL,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,制成系統適用性溶液。

2.3 方法學驗證

2.3.1 專屬性試驗

取空白溶劑(甲醇)、各雜質對照品定位溶液和系統適用性溶液,按“2.1”項下色譜條件進樣測定并記錄色譜圖。結果如圖1所示,相鄰色譜峰分離良好,2,4-二甲基硝基苯&2,5-DMA,2,3-DMA&3,5-DMA,3,4-DMA&未知雜質之間的分離度可達1.98,1.95和1.73。表明該方法專屬性好。

時間/mina.空白溶劑;b.間二甲苯;c.2,4-二甲基硝基苯;d.2,6-二甲基硝基苯;e.2,3-DMA;f.2,4-DMA;g.2,5-DMA;h.3,4-DMA;i.3,5-DMA;j.鄰甲苯胺;k.對甲苯胺;l.系統適用性溶液。圖1 專屬性試驗的典型色譜圖

2.3.2 檢測限與定量限

取雜質對照品混合儲備液,用甲醇逐級稀釋,按“2.1”項下色譜條件進樣測定并記錄色譜圖,分別以信噪比(S/N)為3和10時的溶液濃度作為檢測限和定量限。結果如表2所示,各雜質的檢測限在2.39～14.94 μg/mL范圍內,間二甲苯、2,4-二甲基硝基苯、2,6-二甲基硝基苯、2,4-DMA,2,5-DMA,鄰甲苯胺、對甲苯胺的定量限為5 μg/mL;2,3-DMA和3,5-DMA的定量限為10 μg/mL;3,4-DMA的定量限為30 μg/mL。

表2 檢測限和定量限、線性的試驗結果

2.3.3 線性與范圍

取雜質對照品混合儲備液適量,用甲醇稀釋成濃度在各雜質定量限～200 μg/mL范圍內的系列濃度溶液,按“2.1”項下色譜條件進樣測定并記錄色譜圖。以濃度為橫坐標,峰面積為縱坐標,進行線性回歸分析。結果如表2所示,各雜質的相關系數(r)均大于0.990,表明各雜質在相應濃度范圍內線性關系良好。

2.3.4 準確度

取9份供試品各500 mg,精密稱定,分別置10 mL棕色量瓶中,加入雜質對照品混合儲備液適量,分別配制成低、中、高三個不同雜質濃度水平的溶液,一式三份。按“2.1”項下色譜條件進樣測定并記錄色譜圖。結果如表3所示,各雜質的平均回收率(n=9)在88.17%～108.17%范圍內,相對標準偏差(RSD)均<10%,表明該方法準確度良好。

表3 準確度、精密度和穩定性的試驗結果

2.3.5 精密度

按“2.2”項下系統適用性溶液配制方法制備1份進樣精密度溶液,按“2.1”項下色譜條件連續進樣6次并記錄色譜圖。結果如表3所示,各雜質峰面積的RSD均<5%,表明該方法進樣精密度良好。

由兩人分別在不同天按“2.2”項下系統適用性溶液配制方法平行配制6份溶液,按“2.1”項下色譜條件進樣測定并記錄色譜圖。結果如表3所示,6份重復性溶液中各雜質含量的RSD均<5%,12份中間精密度溶液中各雜質含量的RSD均<5%,表明該方法重復性和中間精密度良好。

2.3.6 穩定性

按“2.2”項下配制1份對照品溶液和系統適用性溶液,室溫放置。以4.4 h為間隔,按“2.1”項下色譜條件進樣測定并記錄色譜圖。結果如表3所示,在44 h內,主成分和各雜質峰面積的RSD均<10%,表明對照品溶液和系統適用性溶液室溫放置44 h內穩定。

2.3.7 耐用性

按“2.2”項下配制1份對照品溶液和系統適用性溶液,分別在不同初始柱溫(60±5)℃、不同流速(1.0±0.1)mL/min、不同進樣口溫度(230±5)℃、不同檢測器溫度(235±5)℃條件下進樣測定并記錄色譜圖。結果顯示,不同條件下,系統適用性溶液中各雜質與相鄰峰之間的分離度均>1.5,各雜質含量的RSD均<10%,表明該方法耐用性良好。

2.4 樣品測定

取3批次的2,6-DMA樣品,按“2.2”項下供試品溶液配制方法配制供試品溶液,一式兩份。按“2.1”項下色譜條件進樣測定并記錄色譜圖。測定結果見表4。

3 討論

3.1 溶劑的選擇

在溶劑方面,考察了常見溶劑二甲基亞砜、N,N-二甲基甲酰胺和甲醇作為潛在溶劑。結果顯示二甲基亞砜和N,N-二甲基甲酰胺溶劑中含有較多雜質峰。由于待測物種類較多,且異構體之間分離難度較大,為了避免溶劑雜質對待測物出峰產生更多的干擾,最終選擇使用甲醇作為溶劑。

3.2 色譜柱的選擇

在色譜柱的選擇中,測試了不同極性固定相的毛細管柱,如Agilent J&W HP-1(30 m × 0.53 mm × 3 μm)、HP-5(30 m × 0.53 mm × 5 μm)、DB-624(30 m × 0.53 mm × 3 μm)、DB-FFAP(30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)。結果顯示,在強極性色譜柱上,各異構體雜質之間均能得到良好分離,故選擇了DB-FFAP型毛細管柱作為試驗用色譜柱。

3.3 柱溫、流速的優化

由于待測物種類較多,沸點差異較大,考慮采用程序升溫色譜法。試驗發現,2,4-二甲基硝基苯&2,5-DMA、2,3-DMA&3,5-DMA、3,4-DMA&未知雜質是較難分離的關鍵雜質對。在其他雜質得到良好分離的情況下,試驗進一步探討了不同初始溫度和升溫速率對三對關鍵雜質分離效果的影響。隨著上述因素的合理變化,分離效果不顯著。最終,通過優化柱流速和第二平臺期柱溫,在柱溫110 ℃、流速1.0 mL/min時,各組分之間實現了良好分離。

4 小結

本研究建立了氣相色譜法對2,6-DMA樣品中可能存在的10種雜質進行了定量分析,并完成了完整的方法學驗證及測樣。方法學結果表明提出的方法專屬性良好、精密度、準確度高。此方法的優勢是對包括合成原料、中間體、異構體雜質等在內的10種雜質進行了分離和定量測定,且無需衍生化等前處理手段。方法簡便、可靠,可用于經間二甲苯硝化還原制得的2,6-DMA的質量控制。