野燕麥病原真菌的分離及鑒定

黃啟超,顧瓊楠,李儒海*,孫正祥

(1.長江大學農學院,湖北 荊州 434025;2.湖北省農業(yè)科學院植保土肥研究所,農業(yè)農村部華中作物有害生物綜合治理重點實驗室,農作物重大病蟲草害防控湖北省重點實驗室,湖北 武漢 430064)

野燕麥(Avenafatua)屬禾本科燕麥屬草本植物,原產于歐洲南部及地中海地區(qū),隨小麥進口傳入中國;由于其分蘗較多、繁殖率高,是當前我國小麥田主要的惡性雜草之一,也是油菜、玉米和高粱等作物田中的重要雜草[1]。目前,對野燕麥的防除主要還是依靠化學防治,而野燕麥與小麥同屬禾本科植物,形態(tài)與小麥相似,防治較為困難[2],藥劑使用不當還會對小麥造成一定藥害;同時,化學藥劑的長期使用,還會逐漸導致野燕麥抗藥性的增加,從而降低除草劑的使用效果。

利用植物病原真菌開發(fā)生物除草劑是近年來防除雜草的重要手段。目前,已有學者在野燕麥病樣中分離出鏈格孢屬(Alternaria)、彎孢屬(Curvularia)、平臍蠕孢屬(Bipolaris)和凸臍蠕孢屬(Exserohilum)等病原真菌[3],但湖北省目前尚未有關野燕麥病原真菌的報道。本研究旨在通過對野燕麥病原真菌的分離及鑒定,明確湖北省小麥田野燕麥病原真菌種類,為其生防菌篩選及生物除草劑研發(fā)提供基礎信息。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

于2023年4-5月采集湖北省小麥田自然發(fā)病野燕麥植株,記錄采集地點信息,對植株發(fā)病部位進行現(xiàn)場拍照和保存,并用吸水紙對病樣植株進行壓制保存。采集地點為荊州市荊州區(qū)、沙市區(qū)、江陵縣、松滋市、公安縣、武漢市江夏區(qū)、漢南區(qū)、襄陽市襄州區(qū)、孝感漢川市、鄂州市華容區(qū)、咸寧市咸安區(qū)。

1.2 病原真菌分離及純化

將采集的新鮮病樣植株用dd H2O清洗干凈后,在野燕麥上剪取4 mm×4 mm病健交接部位的病葉組織,用75%乙醇浸泡消毒30 s,再用0.1%的氯化汞浸泡消毒2 min,然后用無菌dd H2O浸泡清洗3遍后,置于無菌濾紙上晾干水分,最后將病葉組織移至PDA培養(yǎng)基上,置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng);待長出菌絲后,用無菌針切取菌落邊緣部位菌絲塊,移至新的PDA培養(yǎng)基中,25℃恒溫培養(yǎng)5 d后,保存在4℃冰箱中備用。

將分離菌株25℃恒溫培養(yǎng)5 d后,加入5 mL無菌dd H2O至培養(yǎng)皿中,用無菌接種環(huán)刮下菌絲,并用4層無菌紗布進行過濾,以無菌dd H2O梯度稀釋濾液至普通光學顯微鏡40倍鏡檢到1～2個分生孢子為止。取200 μL孢子懸浮液均勻涂抹在PDA平板上,25℃恒溫倒置培養(yǎng)24 h后,將單菌落移至PDA斜面培養(yǎng),待菌落長至斜面50%時,置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 致病性測定

1.3.1 供試植物準備

采用離體葉片接種法,將野燕麥種子經0.01%赤霉酸浸泡24 h后,均勻播種在9 cm×9 cm的塑料方盒中,于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至5葉期,剪取大小一致葉片,用70%酒精消毒1 min,然后將葉片貼于直徑9 cm的濾紙片上,置于直徑9 cm的培養(yǎng)皿中,并加入3 mL無菌dd H2O保濕備用。

1.3.2 菌絲塊接種

用直徑6 mm打菌器打取在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d的分離菌絲塊,用無菌針將菌絲面貼于野燕麥葉片上,以接種PDA培養(yǎng)基的葉片作為對照,每個菌株接種3個葉片,每個葉片接種3個菌絲塊,封口后于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),2 d后移除菌絲塊繼續(xù)培養(yǎng)3 d,觀察記錄發(fā)病情況。

1.3.3 病原真菌再分離

剪取4 mm×4 mm接種后發(fā)病的葉片病健交接處組織,采用常規(guī)組織分離法再次對病原菌進行分離和培養(yǎng),然后觀察菌落形態(tài)、菌絲及孢子特征等,確定再侵染后分離出的菌株是否與原接種菌株一致,完成柯赫氏法則驗證。

1.4 病原真菌鑒定

1.4.1 形態(tài)學觀察

將接種后發(fā)病的菌株接種在PDA培養(yǎng)基上,于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7 d,記錄觀察菌落形態(tài)特征以及孢子形態(tài)和產孢結構,測量孢子和孢子梗大小。部分菌株在PDA培養(yǎng)基上不易產孢,可以接種在水瓊脂培養(yǎng)基上,培養(yǎng)14 d后,通過光學顯微鏡觀察。

1.4.2 rDNA-ITS序列分析

PDA平板提前鋪一層玻璃紙,將菌株接種到PDA平板上,待菌落快長滿平板時刮取菌絲體,采用CTAB法提取各菌株總DNA。以提取的DNA為模板,用ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)為引物,對菌株rDNA的ITS區(qū)域進行PCR擴增。建立總體積為25 μL的PCR反應體系,其中GreenTaqMix(南京諾唯贊)12.5 μL,模板DNA 1 μL,引物ITS1和ITS4(25 μmol/L)各1 μL,無菌dd H2O 9.5 μL,通過C 1 000 Touch Thermal Cycler PCR(美國伯樂)擴增。擴增條件:95℃預變性3 min,94℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸1 min,35個循環(huán);最后72℃延伸5 min,12℃保存。PCR產物經凝膠電泳檢測片段大小后,送至武漢擎科生物技術有限公司進行序列測定,并在GenBank序列進行BLAST比對分析。

2 結果與分析

采集的12份病害樣品中共分離出35個菌株,其在野燕麥上的病狀主要為條狀和不規(guī)則褐色葉斑。經對菌落、菌絲及孢子形態(tài)觀察及rDNA-ITS序列比對,分離出的菌株主要為核腔菌屬(Pyrenophora)、炭疽菌屬(Colletotrichum)和附球菌屬(Epicoccum)等。其中,核腔菌屬占比最高,達82.86%;其次是附球菌屬,占11.43%。將各菌株接種到在PDA培養(yǎng)基上,25℃培養(yǎng)7 d后,附球菌屬的菌落直徑為52～59 mm,邊緣不規(guī)則,氣生菌絲絨毛狀,扁平,白色、淺黃色或紅色,菌落背面中央暗紅色,邊緣紅色至淺黃色;核腔菌屬菌落直徑80 mm左右,菌落圓形,邊緣規(guī)則完整,氣生菌絲初期白色,后期灰色,菌落背面中央黑色,邊緣灰色或淺黃色至白色;炭疽菌屬菌落75 mm左右,圓形,邊緣規(guī)則,絨狀,菌落初期白色,后期灰色,氣生菌絲較多(圖1)。

圖1 野燕麥田間病樣和部分菌株的菌落形態(tài)

3 討論

目前國內有關野燕麥病原真菌的研究報道較少。本次分離出的核腔菌屬、炭疽菌屬和附球菌屬在以往的燕麥相關研究中均有報道,其中附球菌(E.layuense)和核腔菌(P.avenicola)是引起燕麥葉斑病的病原菌[4],炭疽菌屬中的禾谷炭疽菌(C.cereale)是燕麥葉枯病的病原菌[5],在野燕麥自然發(fā)病植株中還分離出黑附球菌(E.nigrum)[3]。微生物除草劑的研發(fā)需要菌株對目標雜草高度選擇,對環(huán)境的負效應較小,同時對作物安全性高[6]。因此,未來還需要進一步明確這3個菌屬的寄主范圍和致病性,從而為評價該菌屬是否具有開發(fā)成微生物除草劑的潛力和意義提供依據(jù)。