外源ALA 對番茄幼苗鹽脅迫的緩解效應

牛 鈺，王俊文，李瑞瑞，田 強，武 玥，郁繼華，2

（1.甘肅農業(yè)大學園藝學院 蘭州 730070；2.省部共建干旱生境作物學國家重點實驗室 蘭州 730070）

目前，生態(tài)環(huán)境保護已經成為全球重點關注的問題，土壤次生鹽漬化是生態(tài)環(huán)境逐漸惡化的結果之一。據(jù)統(tǒng)計，在全世界可耕種的土地面積中，鹽漬化面積占可耕種面積的10%，已經嚴重限制了農業(yè)、畜牧業(yè)以及林業(yè)的發(fā)展[1]。在高鹽土壤中，植株根系生長受到抑制，葉片明顯變黃，光合色素含量均顯著下降，抗氧化酶活性以及丙二醛和過氧化氫含量均顯著升高[2]。已有學者提出對當前品種的基因型或耐鹽性進行遺傳改良是解決鹽脅迫問題的有效方法[3]。因此，找到減輕土壤鹽漬化對作物栽培生產的不良影響的有效方式和途徑是一個亟待解決的問題。

5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinic acid，ALA）最初由David Shemin 等[4]于1953 年在禽類動物的血液中發(fā)現(xiàn)，被認為是原卟啉的合成前體。近年來，ALA 作為一種植物生長調節(jié)劑被許多研究證明能夠促進植物生長發(fā)育并對植物遭受的環(huán)境脅迫具有緩解作用。在干旱脅迫下，噴施外源ALA 使玉米幼苗的形態(tài)指標、葉綠素含量以及光合參數(shù)顯著提高，葉片中丙二醛、過氧化氫含量顯著下降，抗氧化酶活性以及抗氧化酶基因相對表達量進一步提高，從而提高了玉米幼苗的抗旱性[5]。在鹽脅迫下，外源ALA 可以促進酸棗幼苗葉綠素的合成，促進幼苗生長[6]。在低溫脅迫下，外源ALA 促進了枇杷葉片AsA-GSH 的有效循環(huán)，增強細胞的抗氧化性，提高枇杷幼苗的耐寒性，且存在濃度效應[7]。還有研究表明，番茄果實成熟過程中施用適宜質量濃度外源ALA（200 mg·L-1）不僅能夠改善果實的風味品質，還能夠提升果實的外觀品質，使果實的成熟期提前[8-10]。

利用植物生長調節(jié)劑緩解蔬菜作物逆境損傷是實際生產中一種重要的農藝措施，同時也是提高植物抗性研究的熱點方向。在前人研究中，已有外源植物生長調節(jié)劑（如2’4-表油菜素內酯、CO、H2S等）提高番茄耐鹽性的報道[11-13]，但有關外源ALA在番茄鹽脅迫條件下對抗氧化防御系統(tǒng)及滲透調節(jié)系統(tǒng)調控的研究較少。筆者以番茄幼苗為試材，采用100 mmol·L-1NaCl 模擬中度鹽脅迫，同時噴施不同濃度外源ALA，研究其對番茄幼苗氧化損傷及抗逆性的影響，以期為ALA 緩解蔬菜作物非生物脅迫的實際應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試番茄品種為以色列大紅寶，種子購自甘肅省農業(yè)科學院。該品種屬于矮秧自封大紅果，早熟性突出、花芽分化好、坐果集中、果實高圓形、大紅有光澤、無綠肩、皮厚耐貯運，抗裂果、抗病抗逆能力強。ALA 及其他化學藥品由甘肅源昕生物科技有限公司提供。

1.2 試驗設計

試驗于2021 年10—12 月在甘肅農業(yè)大學園藝學院人工氣候室內進行。在50 孔穴盤內育苗至4 葉1 心時移栽至高20 cm、直徑30 cm 栽培盆中，澆灌1/4 山崎營養(yǎng)液，培養(yǎng)過程中每12 h 進行1 次晝夜交替，設置光照度（20 000 lx/0 lx）和溫度（28 ℃/18 ℃），以晝夜交替為周期，相對濕度為75%，移栽1 周后進行處理。根據(jù)鄒志榮課題組Cao 等[14]已篩選的番茄幼苗中度鹽脅迫濃度，本試驗中每隔2 d 根部澆灌1 次100 mmol·L-1NaCl 溶液模擬鹽脅迫，12 h 后在黑暗條件下葉面噴施不同質量濃度ALA 溶液（0、25、50 mg·L-1），持續(xù)處理7 d 后進行相關指標的測定，每個處理3 次重復，每個重復40 株幼苗。采用隨機區(qū)組設計方法，試驗設以下處理：（1）CK：正常栽培條件；（2）NaCl：澆灌100 mmol ·L-1NaCl 溶 液；（3）25 A + N：澆 灌100 mmol·L-1NaCl 溶液，葉面噴施25 mg·L-1ALA溶液；（4）50 A+N：澆灌100 mmol·L-1NaCl 溶液，葉面噴施50 mg·L-1ALA 溶液。

1.3 指標測定方法

處理7 d 后進行以下指標的測定，每個指標3次重復，每個重復5 株幼苗。

1.3.1 植株形態(tài)及生長指標的測定 番茄根系用根系掃描儀（STD 4800，加拿大）掃描并用根系分析軟件Win RHIZO 5.0（Regent Instruments，Inc.，加拿大）對根系進行分析，進而獲得根系形態(tài)指標（根長、根表面積、根系直徑、根體積、根尖數(shù)、分根數(shù)）。植株總葉面積使用葉面積儀（YMJ-C，浙江托普有限公司，中國）進行測定。

1.3.2 植株生物量的測定 處理7 d 后，仔細沖洗植株根部，用濾紙擦干表面水分。分別稱取地上部和地下部鮮質量，之后放入烘箱中烘干至恒質量，分別稱取地上部和地下部干質量。

1.3.3 根系活力測定 采用2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）法測定根系活力[15]。稱取0.5 g 根，加入10 mL 0.4%TTC 和0.1 mol·L-1pH 7.5 的磷酸緩沖鹽溶液（PBS），37 ℃條件下保溫1 h，加入2 mL 1.0 mol·L-1H2SO4。取出根并擦干后加3～5 mL 乙酸乙酯和少量石英砂，研磨，過濾。在485 nm 下測定OD 值。根據(jù)以下公式計算根系活力：

1.3.4 丙二醛（MDA）含量的測定 采用硫代巴比妥酸比色法測定MDA 含量[16]。稱取0.8 g 新鮮葉片，加入少量10%三氯乙酸溶液（TCA）和石英砂研磨至勻漿，使用10%TCA 定容至10 mL，然后再離心。取2 mL 上清液轉入10 mL 離心管，加入2 mL含有0.6% TBA 的10% TCA 溶液，沸水水浴20 min，冷卻后離心，在450、532、600 nm 波長下測定OD 值。采用以下公式計算MDA 含量（b，后同）：

b（MDA）/（μmol·g-1）=

0.25×6.45×（OD532-OD600）-0.56×OD450。（2）

1.3.5 葉綠素含量的測定 參考鐘淮欽等[17]的方法，準確稱取0.1 g 新鮮葉片，放入25 mL 具塞試管中，加入10 mL 80%丙酮，黑暗下浸提48 h 至葉片呈白色，于663、645、440 nm 下測定OD 值。根據(jù)以下公式計算葉綠素含量（w，后同）：

1.3.6 抗氧化酶活性的測定 稱取0.5 g 新鮮葉片，加入0.1 g PVP 和少量石英砂，加1 mL 0.05 mol·L-1pH 7.8 的PBS 緩沖液冰浴研磨至勻漿，加入4 mL 0.05 mol·L-1pH 7.8 的PBS 緩沖液，搖勻后離心，上清液即為總酶液。超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）和抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性的測定參考李榮等[18]的方法。

1.3.7 滲透調節(jié)物質含量的測定 可溶性蛋白和脯氨酸含量的測定參考徐寧等[19]的方法。稱取0.8 g 新鮮葉片，加8 mL 3%磺基水楊酸溶液，沸水浴中浸提10 min。冷卻后，吸取上清液2 mL，加2 mL 冰醋酸和3 mL 酸性茚三酮顯色液，沸水浴40 min，冷卻后加5 mL 甲苯。靜置分層后吸取甲苯層在520 nm 波長下測定OD 值。根據(jù)以下公式計算脯氨酸含量：

稱取0.5 g 新鮮葉片，加入0.1 g PVP 和石英砂，加1 mL 0.05 mol·L-1pH 7.8 的PBS 緩沖液冰浴研磨，加4 mL 0.05 mol·L-1pH 7.8 的PBS 緩沖液，離心。取0.1 mL 上清液，加入0.9 mL 蒸餾水、5 mL考馬斯亮藍G-250 試劑，在595 nm 下測定OD值。根據(jù)以下公式計算可溶性蛋白含量：

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用Microsoft Excel 2019（Microsoft 公司，美國）分析數(shù)據(jù)和作圖，利用SPSS 22.0（SPSS Institute Inc.，美國）軟件LSD 和Duncan’s 檢驗法對數(shù)據(jù)進行多重比較，顯著性水平設為p＜0.05。

2 結果與分析

2.1 外源ALA 對鹽脅迫下番茄幼苗根系生長的影響

由表1 可知，與正常水平相比，鹽脅迫下番茄幼苗根系直徑增加了15.5%，根長、根表面積、根體積、根尖數(shù)、分根數(shù)和根系活力分別減少了36.8%、31.6%、33.9%、37.5%、42.7%和9.6%。鹽脅迫下番茄植株根系生長弱，側根稀疏（圖1-B），同時促進其根系的橫向生長。噴施25 mg·L-1ALA 后根長、根表面積、根體積、根尖數(shù)、分根數(shù)和根系活力分別比鹽脅迫提高了140.27%、133.03%、152.98%、65.19%、227.94%和28.86% ，根系直徑比鹽脅迫減小了5.32%。25 mg·L-1ALA 顯著逆轉了鹽脅迫造成的生長抑制，根系發(fā)達（圖1-C），緩解了鹽脅迫導致的根系橫向生長。

圖1 外源ALA 對鹽脅迫下番茄幼苗根系結構建成的影響Fig.1 Effect of exogenous ALA on root structure formation of tomato seedlings under salt stress

表1 外源ALA 對鹽脅迫下番茄幼苗根系形態(tài)參數(shù)的影響Table 1 Influence on of root morphological parameter of exogenous ALA on salt stress of tomato seedlings

2.2 外源ALA 對鹽脅迫下番茄幼苗葉片生長的影響

如圖2 所示，鹽脅迫下葉片表面積與CK 相比顯著降低了33.9%，噴施25 mg·L-1ALA 使葉片表面積比正常水平和鹽脅迫分別顯著提高了23.8%和87.2%，噴施50 mg·L-1ALA 時葉片表面積與正常水平無顯著差異。鹽脅迫下葉片少且局部有黃色斑點，頂部葉片展開異常并且形狀不規(guī)則（圖3-B），噴施ALA 后植株葉色綠，頂部葉片正常展開且葉片數(shù)多（圖3-C～D）。

圖2 外源ALA 對鹽脅迫下番茄幼苗葉片表面積的影響Fig.2 Effect of exogenous ALA on leave surface area of tomato seedlings under salt stress

圖3 外源ALA 對鹽脅迫下番茄幼苗葉片形態(tài)建成的影響Fig.3 Effect of exogenous ALA on leave morphological formation of tomato seedlings under salt stress

2.3 外源ALA對鹽脅迫下番茄幼苗生物量的影響

由表2 可知，與CK 相比，鹽脅迫使植株地上部鮮、干質量分別降低了24.9%、17.6%，對地下部生物量的抑制作用并不顯著。鹽脅迫下噴施25 mg·L-1ALA 使地上部干、鮮質量保持在正常水平，地下部鮮、干質量分別比CK 提高了85.7%、117.8%。鹽脅迫下噴施50 mg·L-1ALA 使地上和地下部鮮干質量均保持在正常水平。

表2 外源ALA 對鹽脅迫下番茄幼苗生物量的影響Table 2 Effect of exogenous ALA on biomass of tomato seedlings under salt stress

2.4 外源ALA 對鹽脅迫下番茄幼苗MDA 含量的影響

如圖4 所示，鹽脅迫處理后番茄幼苗MDA 含量比CK 植株顯著增加了28.1%，說明鹽脅迫導致番茄幼苗活性氧積累，加速了膜脂質過氧化。鹽脅迫下噴施外源ALA 使番茄幼苗MDA 含量顯著降低到正常生長水平；噴施25 mg·L-1ALA 和50 mg·L-1ALA 后，MDA 含量與鹽脅迫相比分別降低了20.4%、20.9%，ALA 能顯著緩解鹽脅迫對植株造成的氧化脅迫，抑制MDA 的生成。

圖4 外源ALA 對鹽脅迫下番茄幼苗丙二醛含量的影響Fig.4 Effect of exogenous ALA on MDA content of tomato seedlings under salt stress

2.5 外源ALA對鹽脅迫下番茄幼苗葉片葉綠素含量的影響

如圖5 所示，鹽脅迫使番茄幼苗葉綠素a（Chla）和葉綠素b（Chlb）含量顯著低于正常水平。噴施25 mg·L-1ALA 后植株Chla 含量和Chlb 含量達到最高，分別比正常水平顯著提高了13.9%和8.7%。然而，噴施50 mg·L-1ALA 后Chla 含量和Chlb 含量降低到正常水平。植株總葉綠素含量（ChlT）隨鹽脅迫和外源ALA 的變化趨勢同Chla 和Chlb。鹽脅迫顯著提高番茄幼苗類胡蘿卜素（Car）含量。鹽脅迫下噴施25 mg·L-1ALA 使植株Car 含量降低到CK 水平，噴施50 mg·L-1ALA 時Car 含量最低。說明鹽脅迫對番茄幼苗Car 含量影響顯著，而且高濃度的ALA 反而對Car 含量有顯著抑制作用。

圖5 外源ALA 對鹽脅迫下番茄幼苗葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素和類胡蘿卜素含量的影響Fig.5 Effect of exogenous ALA on chlorophyll a,chlorophyll b,total chlorophyll and carotenoid content of tomato seedlings under salt stress

2.6 外源ALA對鹽脅迫下番茄幼苗抗氧化酶活性的影響

由圖6 可知，番茄幼苗受到鹽脅迫后其體內的SOD 活性與正常水平相比提高了50.5%，鹽脅迫下噴施25 mg·L-1ALA 時SOD 活性與鹽脅迫相比無明顯差異，噴施50 mg·L-1ALA 后SOD 活性比正常水平和鹽脅迫分別降低了38.9%、59.4%，說明高濃度ALA 顯著抑制SOD 活性。鹽脅迫下番茄幼苗中POD 活性比正常水平顯著降低了29.9%，但噴施25 mg·L-1ALA 后，POD 活性與鹽脅迫下和正常水平相比分別顯著提高了64.1%、15.0%，噴施50 mg·L-1ALA 后，POD 活性降低到了正常水平。鹽脅迫下CAT 活性比正常水平顯著降低了75.5%，而外源不同濃度的ALA 也沒有提高其活性，始終保持在脅迫水平下的活性。鹽脅迫下APX 活性與正常水平相比顯著降低了44.4%，25 mg·L-1ALA 將APX 活性提高到正常水平，比鹽脅迫水平提高了80.6%，50 mg·L-1ALA 又降低了APX 活性。

圖6 外源ALA 對鹽脅迫下番茄幼苗SOD、POD、CAT和APX 活性的影響Fig.6 Effect of exogenous ALA on SOD,POD,CAT and APX activity of tomato seedlings under salt stress

2.7 外源ALA對鹽脅迫下番茄幼苗滲透調節(jié)物質含量的影響

由圖7 可知，鹽脅迫下番茄幼苗中可溶性蛋白和脯氨酸含量分別比CK 植株提高了12.9%和413.0%，噴施25 mg·L-1ALA 后可溶性蛋白和脯氨酸含量比脅迫條件下顯著降低了10.9%和54.1%，而脯氨酸含量比CK 顯著提高了135.6%。同時，與CK 相比，噴施50 mg·L-1ALA 使植株可溶性蛋白含量和脯氨酸含量顯著提高。

圖7 外源ALA 對鹽脅迫下番茄幼苗滲透調節(jié)物質含量的影響Fig.7 Effect of exogenous ALA on osmotic adjustment substances content of tomato seedlings under salt stress

3 討論與結論

根系是植物感應土壤鹽分的主要部分。已有研究表明，番茄幼苗在不同濃度鹽脅迫下植株的根系生長指標均顯著低于正常水平[20]，葉片生長受阻[21]，海濱雀稗根系投影面積和根表面積顯著降低、根系直徑增大[22]，黑云杉和油松植株粗根的百分比增加，細根的百分比減少[23]。本試驗結果表明，鹽脅迫下，番茄植株根系直徑增大，其余根系生長指標和葉片生長均受抑制，與上述研究結果一致。此外，不同脅迫（鉻脅迫、鹽脅迫和干旱脅迫）下較低質量濃度（5、25 mg·L-1）ALA 均能提高草地早熟禾根長等，而較高質量濃度（50、100 mg·L-1）的ALA起抑制作用[24]。前人研究與本試驗結果一致表明，外源ALA 有效緩解鹽脅迫導致的植株根系和葉片生長受阻，且表現(xiàn)為濃度效應。

根際鹽脅迫下植株體內細胞受到氧化脅迫而使植株生長緩慢或死亡[25]，許多研究報道[26-28]證實ALA 能提高環(huán)境脅迫下植株的干質量和根系活力。在本試驗中，中度鹽脅迫阻礙了植物的正常生長，使其地上部干鮮質量和根系活力降低，然而，25 mg·L-1的外源ALA 提高了植株根系活力和干物質積累量。有學者報道，ALA 處理顯著增強了鹽脅迫下的草莓植株根系SOS1、NHX1和HKT1基因的上調表達，促進了根系中Na+的固存，并減少了葉片中Na+積累[29-30]。此外，宋佳倩等[31]也已證明，鹽脅迫增強煙草幼苗Na+吸收和K+外排，外源麝香草酚可逆轉此現(xiàn)象。推測在本試驗中，外源ALA 通過提高鹽脅迫下番茄幼苗根系活力，進一步促進K+吸收，Na+外排，使地上部Na+含量降低，減輕鹽害，促進植株生長及干物質積累。

葉綠素是一種重要的光合色素[32]。鹽脅迫下葉綠素合成受到顯著抑制并促進其快速降解為類胡蘿卜素，從而影響植物的光合作用[33-34]。已有研究證明，鹽脅迫下葉綠素合成分支中編碼鎂螯合酶的基因（CHLH）轉錄水平下調，葉綠素合成受抑制[35]。在本試驗中，鹽脅迫下調了葉綠素含量，與此同時，Car 含量增加，這與前人研究結果一致。武玥[36]的研究表明，中度鹽脅迫導致的黃瓜幼苗葉綠素合成受到抑制，能夠被外源ALA 處理緩解。此外，鎘脅迫下施加2 mg·L-1ALA 使油菜下胚軸長度增加，但施加10 mg·L-1ALA 使下胚軸長度顯著降低[37]。這與筆者的研究結果一致，外源ALA 同樣表現(xiàn)出濃度效應，即在脅迫條件下，25 mg·L-1ALA 能夠逆轉中度鹽脅迫造成的生長抑制，而50 mg·L-1ALA 反而抑制了生長。這可能是由于較高劑量的ALA 加速了氧化損傷，破壞了膜的完整性，降低了光合作用[38]。有學者研究證明高濃度ALA 可以作為除草劑使用[39]。

脅迫下植株體內細胞的損傷程度可以用MDA含量來衡量[40]。外源ALA 是一種強效的抗氧化劑，可通過清除在不同環(huán)境脅迫下產生的活性氧（ROS）來減輕氧化損傷，如高鹽[41]、干旱[42]和重金屬[43]脅迫。在Youssef[44]的研究中證明，外源ALA 有效緩解了鹽脅迫造成的高粱植株MDA 大量積累。本研究結果與上述結果一致，番茄幼苗受到鹽脅迫后，其葉片中MDA 含量顯著升高，對細胞膜造成了嚴重的氧化損傷，然而，外源ALA 將MDA 含量降低到正常水平，有效緩解了鹽脅迫。

SOD、POD、CAT、APX 等組成的植物抗氧化系統(tǒng)可參與大量ROS 的清除，與植物的抗逆性密切相關[45-46]。SOD 通過催化超氧陰離子自由基歧化為過氧化氫和氧氣，進而解除其毒性，而POD、CAT、APX 負責清除解毒過程中所產生的過氧化氫[47]。在本試驗中，鹽脅迫下SOD 活性增強，POD、CAT、APX 活性降低，說明SOD 作為抗氧化的第一道屏障，將活性氧分子歧化生成H2O2，而歧化產物未能完全被消除，造成了更大程度上的氧化損傷。然而，25 mg·L-1ALA 可提高POD 和APX 的活性，逆轉脅迫造成的氧化損傷。Ali[48]的研究結果與此一致，玉米植株體內POD、CAT、APX 活性受鹽脅迫而顯著降低。此外，呂婷婷等[49]的研究結果表明，鹽脅迫下適宜質量濃度的ALA（16.7 mg·L-1）處理顯著提高了菘藍幼苗SOD 和POD 活性。前人和本試驗的研究結果一致表明，ALA 可通過提高抗氧化酶活性緩解鹽脅迫造成的氧化損傷，且有濃度效應。

滲透調節(jié)物質（如可溶性蛋白和脯氨酸）在逆境脅迫條件下對植物起保護作用[50]。鹽脅迫使花生葉片中積累了大量脯氨酸，10 mg·L-1ALA 可有效降低其積累量并將其含量維持在較低水平[51]。本試驗結果顯示，鹽脅迫使植株可溶性蛋白和脯氨酸含量大幅提高，25 mg·L-1ALA 處理后其含量與脅迫條件相比顯著下降，然而50 mg·L-1ALA 處理下可溶性蛋白含量又增加到鹽脅迫下的水平，說明番茄幼苗能夠通過可溶性蛋白和脯氨酸的積累進行鹽脅迫條件下的滲透調節(jié)，外源施用適宜質量濃度ALA（25 mg·L-1）可以有效緩解鹽脅迫，細胞內滲透脅迫減輕，植株內滲透調節(jié)物質積累量也隨之降低，噴施高質量濃度ALA（50 mg·L-1）反而增加可溶性蛋白含量，說明ALA 對植株作用存在濃度效應，高濃度會對植株造成損傷，其作用效果與環(huán)境脅迫相同。

綜上所述，以100 mmol·L-1NaCl 模擬中度鹽脅迫，研究不同濃度外源ALA 對番茄幼苗鹽脅迫的緩解效應。結果表明，25 mg·L-1ALA 促進植株生長及生物量增加，葉綠素含量提高，POD 活性提高，脯氨酸含量降低，APX 活性、可溶性蛋白和MDA 含量達到正常水平；50 mg·L-1ALA 緩解效應不佳甚至抑制植株生長，表現(xiàn)為濃度效應。綜上，25 mg·L-1ALA 可有效緩解番茄幼苗鹽脅迫的影響。