川貝母真偽鑒別方法的研究進展

郭冰雪,林鵬程,吳 疆,周黨衛

1.青海民族大學藥學院,西寧 810007;2.青海省青藏高原植物化學重點實驗室,西寧 810007;3.青海省藥物分析重點實驗室,西寧 810007

川貝母入藥部位為百合科植物卷葉貝母(FritillariacirrhosaD.Don)、暗紫貝母(FritillariaunibracteataHsiao et K.C.Hsia)、甘肅貝母(FritillariaprzewalskiiMaxim)、梭砂貝母(FritillariadelavayiFranch)、太白貝母(FritillariataipaiensisP.Y.Li)或瓦布貝母[FritillariaunibracteataHsiao et K.C.Hsiavar.wabuensis (S.Y.Tang et S.C.Yue).Z.D.Liu,S.Wang et S.C.Chen]的干燥鱗莖[1-3]。2020年版《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)一部中對川貝母記載:川貝母味苦、甘,性微寒;歸肺、心經,可清熱潤肺、化痰止咳,浙貝母可清熱化痰、解毒散結。《本草綱目拾遺》將川貝與浙貝分開,謂川貝味甘而補肺,不若用象貝治風火痰嗽為佳。若虛寒咳嗽以川貝為宜[4]。中醫學認為川貝母有清熱潤肺、化痰止咳、散結消癰等功效。川貝母臨床用量大多數為3～30 g,醫治不同疾病時的用量范圍也存在差異[5]。川貝母是國家三級保護植物,且價格高昂,因此市場上出現了大批偽品,這些偽品有光慈菇、草貝母、東貝母、浙貝母等,這些偽品與川貝母形態相似,單從形態學難以區分,而且藥效與川貝母不同,濫用不僅不能治病,還會延誤病情[6-8]。目前2020年版《中國藥典》一部中收錄的對川貝母的鑒別方法有微觀粉末特征鑒別、薄層色譜法鑒別、聚合酶鏈式反應——限制性內切酶長度多態性方法,為進一步規范川貝母的市場,保障用藥安全,近年來對川貝母真偽的研究越來越多,本文對近10年川貝母的真偽鑒別方法進行了總結并分析了各種方法的特點,為以后川貝母的真偽鑒別提供參考[1]。

1 性狀鑒定

利用人的感官從藥材的質地、色澤、外觀形態等辨別川貝母真偽,其結果是否正確主要取決于鑒定者的經驗,有一定的主觀性。對于川貝母這種近緣物種較多的藥材,用此種鑒別方法有一定的難度。根據性狀不同,川貝母可分為松貝母、青貝母和爐貝母。爐貝母一般比松貝母和青貝母大。李娜[9]研究發現,川貝母和平貝母的兩鱗片存在區別,川貝母的兩鱗片抱合較平貝母緊密;川貝母底部較平,平貝母底部較凸。湖北貝母呈扁圓球形,外層鱗葉略呈腎形, 大瓣緊抱小瓣,內有鱗葉幾片和干縮的殘莖,基部內凹;伊貝母外層鱗葉呈月牙形,基部圓鈍, 內有較大的鱗片和殘莖、心芽;伊犁貝母較大, 表面稍粗糙,外層鱗葉呈心臟形,基部稍微凹陷;浙貝母質硬而脆[10];東貝母呈卵圓形或長圓形,基部較尖,味極苦[11]。

2 顯微鑒別

利用顯微鏡觀察川貝母內部組織結構(例如淀粉粒、表皮細胞、氣孔、導管等)的特征辨別真偽,但該方法的缺陷是一般需要破壞川貝母,而且難以顯示近源物種之間的關系[12]。松貝、青貝粉末呈白色,淀粉粒多, 有的邊緣呈分枝狀,臍點呈點狀、短縫狀, 少數呈人字狀或馬蹄形;表皮細胞呈類長方形,偶見不定式氣孔, 類圓形, 副衛細胞,螺紋導管。爐貝粉末呈白色,臍點呈人字狀、星狀或點狀, 層紋明顯, 氣孔呈長圓形;螺紋及網紋導管較松貝、青貝長。平貝粉末呈類白色,淀粉粒單粒,臍點呈裂縫狀、點狀或人字狀,氣孔呈類圓形,副衛細胞4～6個,螺紋導管直徑40～48 mm。伊貝母粉末呈類白色或淡黃白色,淀粉粒單粒,呈廣卵形、卵形或貝殼形,直徑5～60 mm;臍點點狀、人字狀,氣孔呈不定式。湖北貝母粉末呈淡棕黃色,淀粉粒特別多,呈廣卵形或長橢圓形,直徑7～54 mm,偶見復粒;臍點明顯,呈點狀、人字形或裂縫狀;層紋明顯而細密;氣孔呈扁圓形,副衛細胞4～5個;表皮細胞垂周壁呈連珠狀增厚,草酸鈣結晶棱方形、顆粒狀或簇狀,直徑達50 mm。浙貝母粉末呈類白色至淡黃白色,淀粉粒多為單粒,多呈廣卵圓形或橢圓形,直徑6～56 mm,臍點多數呈點狀或裂縫狀,有較大的淀粉粒;層紋明顯,呈偏心形,導管多為螺紋狀細小導管[13]。

3 理化鑒別

除《中國藥典》(2020年版)規定的鑒別方法外,對川貝母的理化鑒別方法有以下幾種。

3.1 木尖電噴霧電離質譜分析和多元統計分析結合

木尖電噴霧電離質譜分析法無需復雜樣品預處理步驟,可直接分析樣品中的生物堿成分[14-15]。XIN G Z等[16]采用木尖電噴霧電離質譜分析和多元統計分析相結合的方法鑒定出貝母的初級代謝物(氨基酸、檸檬酸、糖類等)和次生代謝物(生物堿、黃酮、皂苷等),實現了對川貝母、暗紫貝母、甘肅貝母、梭砂貝母、太白貝母和瓦布貝母的快速鑒別。

3.2 色譜鑒別

薄層色譜法(thin layer chromatography, TLC)是評價川貝母真偽的簡便有效方法之一。在2020年版《中國藥典》中川貝母的薄層鑒別法中用貝母素乙作為對照品。于國強等[17]采用TLC鑒別法,以西貝母堿斑點作為鑒別依據,在浙貝母、湖北貝母及平貝母薄層色譜圖中未見西貝母堿斑點,而川貝母TLC圖中可見西貝母堿斑點,此法可用來區分出川貝母與浙貝母、湖北貝母及平貝母。翟映紅等[18]優化了藥典上的TLC法,按照優化后的TLC實驗發現,平貝母比川貝母薄層色譜圖多2個斑點,這個特點可用來判斷川貝母中是否摻雜平貝母。

生物堿是川貝母的特征性成分,甾體生物堿是川貝母的主要活性成分,通過含量測定方法也可實現對川貝母真偽品的鑒別[19]。周琪等[20]按照2015年版《中國藥典》方法對川貝母基源藥材進行了含量測定,結果表明,松貝的總生物堿含量平均值為0.046%,青貝的總生物堿含量平均值為0.072%,所以松貝和青貝不僅存在性狀上的區別,總生物堿含量也存在差異。LUO D等[21]將超高效液相色譜-蒸發光散射檢測器法結合化學計量學方法包括相似度分析(similarity analysis,SA)、系統聚類分析(hierarchical clustering analysis,HCA)和主成分分析(principal component analysis,PCA)建立了一種特異、實用、有效的指紋圖譜分析方法,用于川貝母藥材及其混偽品的品種鑒別和質量評價。閔會等[22]采用高效液相色譜-蒸發光散射檢測器建立了指紋圖譜,此法可用于鑒別并區分浙貝母、平貝母、川貝母藥材。

3.3 光譜鑒別

紅外光譜是對復雜基質進行定性和定量分析的一種基本方法,產生的信息歸因于特征基團的存在,如醇類、酮類、烯類等,獲得的光譜代表了每個測試樣品的化學指紋。劉晶晶等[23]采用傅里葉變換紅外光譜(fourier transform infrared spectroscopy,FTIR) 結合二階導數紅外光譜和二維相關紅外光譜分析方法,通過比較峰數、峰形和峰的強度能夠辨別出松貝、青貝、爐貝和太白貝母。王月[24]采用FTIR和反射光纖探針,對不同種類的貝母進行檢測,并通過主成分分析和聚類分析,利用軟獨立建模分類法(soft independent modeling of class analogies,SIMCA算法)的監督模式識別出摻假的川貝母粉末。范林宏等[25]利用便攜式近紅外光譜儀采集川貝母真偽品近紅外光譜數據,利用線性判別分析(linear discriminant analysis,LDA)及偏最小二乘法(partial least squares,PLS)分別建立川貝母-摻偽品、不同類別摻偽品定性校正模型及不同類別摻偽品摻偽量定量校正模型,其中運用的2種模型預測的準確率分別為83.33%、90.91%。便攜式近紅外光譜儀雖然模型參數不夠完善,可能沒有臺式設備精確,但有較強的實時檢測功能,可用于大批量川貝母的無損鑒別,為川貝母采收和交易環節的質量評價提供一定的參考[25]。此外,王文娜等[26]采用激光拉曼光譜技術測定了川貝母及其偽品表面的拉曼光譜,利用拉曼光譜可快速、無損地鑒別川貝母真偽品。

4 分子生物學方法鑒別

4.1 堿裂法

堿裂法是利用染色體脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid, DNA)與質粒DNA變性復性的差異來分離染色體DNA與質粒DNA[27]。堿裂法是使質粒DNA和染色體DNA在高pH下變性,同時沉淀蛋白質,再將pH值調至中性,由于質粒DNA相比染色體DNA較小,容易復性成雙鏈,而染色體DNA較大,易纏結成網狀不溶物質,可通過離心除去[27]。陳玉秀等[27]研究表明,含有200 mmol·L-1氯化鈉(NaCl)溶液,5 mmol·L-1氯化鎂(MgCl2)溶液,體積分數1%聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100),體積分數1%聚乙烯吡咯烷酮(PVP),2 mmol·L-1乙二胺四乙酸(EDTA),10 g·L-1十二烷基硫酸鈉(SDS),0.1 mmol·L-1三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)的堿裂解液有最佳的DNA提取效果,這種方法成本較低,可用于快速鑒別川貝母的真偽。

4.2 聚合酶鏈式反應法(polymerase chain reaction,PCR法)

PCR法是一種DNA體外快速擴增技術,微量和常量樣品都可以使用這種技術。熒光定量PCR法可分為探針法和染料法,其中探針法的特異性、靈敏度和重復性都明顯優于染料法,同時有定性和定量的作用,可用于鑒別川貝母摻偽情況[28]。楊健等[29-30]采用了實時熒光定量PCR法,利用川貝母內轉錄間隔區1(internal transcribed spacer1,ITS1)序列的特點,設計了真、偽川貝母鑒別引物,真川貝母鑒別引物以川貝母ITS1區第75位堿基“C”為3′末端,偽川貝母鑒別引物以“T”為3′末端,該方法可以檢測川貝母粉末的摻偽程度。劉艷艷等[31]建立了多重熒光實時定量法鑒別川貝母真偽品。劉香香等[32]也分析了川貝母ITS1序列特點,設計了1對川貝母特異性擴增引物(CBM-SP引物),建立了PCR法用來快速鑒別川貝母真偽品,鑒別結果與藥典收錄的限制性片段長度多態性聚合酶鏈反應技術(cleaved amplification polymorphism sequence-tagged sites,PCR-RFLP)一致。陳慕媛等[33]設計了川貝母DNA特異性引物,結果表明,川貝母溶解曲線是尖銳的峰形,退火溫度是80.98 ℃,利用這種特異的熔解曲線峰形和退火溫度可區別出川貝母真偽品。潘杰等[34]根據川貝母和伊貝母ITS1片段的一個特異性位點設計了雙雜交探針,因為該探針與PCR擴增片段雜交程度不同,所以儀器在不同退火溫度下檢測的熒光峰值存在差異,由此來區別出川貝母和伊貝母,這種方法可用于鑒別川貝母中是否摻雜伊貝母。

4.3 PCR-RFLP法

川貝母內轉錄間隔區(internal transcribed spacer,ITS)含有CCCGGG序列,它的第75位堿基為C,是限制性內切酶(SmaI)酶切位點,而其他貝母ITS區是CTCGGG序列,第75位堿基為T,不是SmaI酶切位點[35-38]。PCR-RFLP法基于此特點可以實現從分子水平上鑒別川貝母[39]。趙仲麟等[36]對《中國藥典》已經有的PCR-RFLP方法進行了改進,設計了7個底物濃度梯度,進行比較后選擇了最合適的酶切反應底物濃度,優化了《中國藥典》中的酶切體系。這種方法可以檢測出川貝母藥材的真偽,還可以相對定量檢測出川貝母中摻假的量。鮑方名等[40]也優化了《中國藥典》上已經有的PCR-RFLP方法,調整了聚合酶鏈式反應模板和引物的比率,提高退火溫度至61 ℃,采用乙醇沉淀法純化PCR反應液,優化后的方法酶切結果與藥典上的原方法酶切結果比較更加清晰,此法也可用于川貝母的真偽品鑒別。孫麗媛等[35]研制了川貝母DNA檢測試劑盒,利用該試劑盒提取出川貝母DNA,然后進行PCR反應和RFLP鑒定,使用該試劑盒按照藥典的PCR-RFLP法鑒別川貝母真偽操作比較簡單,結果差別不大。

4.4 DNA條形碼

DNA條形碼是利用DNA區域片段進行物種鑒定的技術。對于貝母來說,它的通用條形碼鑒別貝母物種真偽的能力較差。HUANG J等[41-42]研究利用葉綠體全基因組序列作為超級條形碼,對貝母及其偽品的植物源進行了鑒定,比較了DNA條形碼、超級DNA條形碼、特異DNA條形碼鑒別貝母真偽品的能力,發現超級DNA條形碼有較強的鑒別貝母真偽品的能力。雖然超級條形碼有很多優點,但在DNA提取困難的情況下,不適合用于植物種類鑒定。對于干燥、煮熟或煎煮的藥材,DNA降解嚴重的情況下,可能提取不到足夠的DNA片段[43]。而且與單位點條形碼相比,超級條形碼的成本更高,并且使用Windows軟件進行數據分析也很復雜。當傳統的DNA條形碼局限于某些親緣關系較近的物種的植物鑒定時,超級條形碼就能顯示出它的優勢。

4.5 DNA條形碼和高效液相指紋圖譜相結合的方法

羅焜等[44-45]研究發現,川貝母及其混偽品的內轉錄間隔區2(internal transcribed spacer 2, ITS2)二級結構都存在4個螺旋區域,各螺旋上的莖環以及彼此間的夾角存在明顯的不同,說明ITS2二級結構有助于更直觀地鑒定物種。WU L等[46-48]利用DNA條形碼數據的ITS和ITS2成功地鑒定了5種貝母鱗莖,并區分出了這些貝母鱗莖的物種起源。此外,還利用高效液相指紋圖譜和分級聚類分析的方法對貝母進行了分類。朱海蘭等[49-50]根據川貝母及其偽品的ITS1序列設計了多重連接探針擴增(multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA)探針對,經MLPA-高分辨率熔解曲線法(high resolution melting analysis,HRM) (MLPA-HRM)實驗變性、雜交、連接、實時熒光擴增及熔解過程,利用HRM圖鑒別川貝母真偽品,該探針特異性良好,靈敏度高,重復性好,混合樣品分析表明,在一次MLPA-HRM反應中,可以檢測到摻10%偽品的川貝母。

4.6 熒光-環狀等溫擴增技術

環狀等溫擴增技術是一種核酸序列擴增技術,它通過識別靶DNA上特定區域的引物和聚合酶,在恒溫條件下高效擴增靶標序列。蘭青闊等[51]利用熒光-環狀等溫擴增技術設計了5套川貝母引物,篩選出川貝母環狀等溫擴增鑒別引物,用這種引物建立了川貝母環狀等溫擴增技術鑒別真偽的方法,經驗證此方法特異性和靈敏度均較好,可用于川貝母真偽品的快速篩查。

4.7 單核苷酸多態性位點鑒別技術

基因組DNA序列中由單個核苷酸(A, T, C和G)的突變而引起的多態性即為單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism,SNP)[52]。蘭青闊等[53]搜集了川貝母的葉綠體基因組序列,并將這些序列中的單核苷酸多態性位點與其他貝母屬植物的葉綠體基因組序列中的單核苷酸多態性位點進行比較,結果發現,可用于鑒別川貝母真偽的單核苷酸多態性位點71個,篩選出雙等位基因型單核苷酸多態性位點50個,可用于川貝母摻偽的定量分析。

5 計算機輔助鑒別

WANG Z等[54-55]結合了質譜技術和最小乘回歸分析的方法來鑒別川貝母真偽品。胡科[12]建立了松貝母、青貝母、平貝母的圖像標準數據集,這些圖像數據集由4個不同視角拍攝的圖片組成,并利用傳統的機器學習算法支持向量機作為貝母圖像分類器對貝母圖像進行鑒別和分類。吳沖等[56]通過建立川貝母的圖像數據庫,獲取川貝母的外在視覺特征,利用計算機視覺技術和深度學習算法實現了對川貝母的鑒別。這種深度學習算法技術存在的問題是對于視覺特征差異比較小的川貝母真偽品,可能出現鑒別錯誤,如果重點關注真偽品特征性的差別,將有利于提高鑒別的準確度。郭鳳柳等[57]利用氣相色譜離子遷移譜(gas chromatography-ion mobility spectroscopy,GC-IMS)技術得到川貝母、平貝母、伊貝母的指紋圖譜,計算出揮發性物質含量,采用主成分分析(principal component analysis, PCA)對不同貝母所含揮發性物質的量進行比較,結果發現,松貝、爐貝和青貝這3個品種樣品中都含有較多相似的揮發性物質,但這些揮發性成分在平貝母和伊貝母樣品中含量很低或者沒有,此法可用于區分出川貝母和平貝母、伊貝母。

此外,張慧杰等[58]采用電子舌技術提取川貝母味覺信息值,結合化學計量學建立辨識模式,鑒別川貝母飲片真偽,此方法鑒別速度比藥典快,但鑒別準確率較傳統經驗低。楊詩龍[59]采用了電子舌和電子鼻技術對川貝母真偽品粉末進行了鑒別,發現效果較好。劉瑞新等[60]采用了電子眼技術對川貝母飲片真偽品進行了鑒別,該方法鑒別結果比藥典更快速、準確。

6 小結與展望

川貝母源自多種貝母,這些物種由于形態存在相似性及復雜的變異很容易混淆,單從形態上區分并不容易,因此,采用快速、準確的方法鑒別很重要。目前市場對川貝母的需求越來越大,市場上仍然存在一些川貝母的摻假現象。如今已有許多研究集中在不同貝母物種的鑒別上,但鑒定含川貝母產品原料藥的方法很少。未來應改進已有的一些鑒別分析技術,提高鑒別川貝母的準確性和有效性。此外,還要考慮新的鑒別方法,如紅外和拉曼光譜等,這些方法耗時較少,對環境友好,鑒別結果準確性高。