酶法制備低聚異麥芽糖的研究現狀

阮圣慧，姜彩霞，劉曉蘭 ，鄭喜群,,

（1.黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江大慶 163319；2.黑龍江八一農墾大學國家雜糧工程技術中心，黑龍江大慶 163319；3.糧食副產物加工與利用教育部工程研究中心，黑龍江大慶 163319；4.齊齊哈爾大學食品與生物工程學院，黑龍江齊齊哈爾 161006）

在全球范圍內，與飲食有關的非傳染性疾病已成為增加死亡率和發病率的主要原因，包括高血壓、糖尿病、肥胖和心血管疾病等，因此消費者越來越注重健康，并不斷尋求對健康有益的食品[1]。目前非消化性低聚糖如低聚果糖、低聚半乳糖、大豆低聚糖、異麥芽低聚糖、低聚木糖等可作為益生元，能有效促進體內有益菌的代謝和增殖，改善宿主健康[2-3]。其中低聚異麥芽糖（Isomaltooligosaccharides, IMOs）作為具有益生元活性的碳水化合物更加受到人們高度關注。

IMOs 是一種不易被人體消化的葡萄糖基通過不規則連接構成的短鏈低聚糖[4]。在食品體系中具有穩定性高，價格低，容易獲得等優點[5]。同時，IMOs 具有雙歧因子特性，有助于激活免疫系統，刺激腸道蠕動，改善排便，降低總膽固醇水平，改善脂質代謝[6-8]，且其具有相對較高的安全性。OKU 和NAKAMURA 團隊[9-10]證實人體對IMOs 具有良好的耐受性，無任何短暫的滲透性腹瀉或胃腸不適等不良癥狀出現。GRUBIC 等[11]研究結果表明服用IMOs 與等效劑量的葡萄糖安慰劑的受試者相比，在頭痛、頭暈、低血糖、疲勞或腹瀉方面的結果無明顯差異。

酶是一種可以高效控制特定化學反應的一種通用的生物催化劑[12]。目前商品化的IMOs，是先利用耐高溫α-淀粉酶將淀粉液化制備糊精，然后經β-淀粉酶和普魯蘭酶糖化得到麥芽糖，最后用α-葡萄糖苷酶的轉糖基化作用將麥芽糖轉化為IMOs[13]。然而單酶催化因存在成本高、操作穩定性差、酶的再利用困難[14]等缺點而限制其在工業生產IMOs 中的應用，而生物技術的應用是克服其限制因素的有效手段。本文對近年國內外IMOs 工業化生產相關酶修飾技術的研究進行了梳理，重點對酶法轉化、酶膜生物反應器、酶固定化，生物催化技術的應用研究進行了總結，通過整合和比較分析，剖析現有技術的不足，利用現代酶技術的相關理論知識，結合IMOs 特點對酶技術在該領域今后的研究趨勢進行了展望，以期最大限度地使酶能夠高效、循環多次地利用于IMOs的生產過程，從而降低食品工業制備IMOs 成本，降低能耗，同時提高功能性結構的低聚糖的占比，增加產品的附加值，為其在工業生產IMOs 的進一步應用研究提供參考。

1 低聚異麥芽糖的結構及類型

IMOs 是由α-D-（1,6）糖苷鍵、α-（1,4）糖苷鍵、少量的α-（1,3）鍵或α-（1,2）鍵連接的同源低聚糖[15]。聚合度（Degree of polymerization, DP）為2～10，其中DP≤2 為異麥芽糖，DP≥3 為潘糖、異潘糖、異麥芽三糖、黑曲霉糖、曲二糖、長鏈IMOs 和環狀IMOs[16-17]（如圖1）。天然的IMOs 存在于醬油、清酒、味噌、蜂蜜和發酵食品中，如泡菜和酵母面包[10]，商業化的IMOs 主要利用淀粉制備而得。IMOs 具有低熱值，促進腸道蠕動，改善便秘和脂質代謝等優點，多作為益生元、食品添加劑、飼料成分等被廣泛應用[18]。

圖1 IMOs 的通用名稱和化學結構Fig.1 IMOs common names and chemical structures

IMOs 有3 種類型，類型Ⅰ是由α-1,6 寡聚葡聚糖，通過α-1,4 糖苷鍵連接到葡萄糖基上的線性鏈，被稱為“6-O-α-異麥芽寡糖基-D-麥芽糖（IMOMs）”，即麥芽糖基-低聚異麥芽糖（MIMOs），主要包括異麥芽糖和潘糖，其中潘糖可作為三糖的代表，其同源物又被稱為PAN-型低聚糖；類型Ⅱ則由線性α-1,6 低聚糖組成，如異麥芽三糖（Isomaltotriose，IMT），通常被稱為IMT-型低聚糖；另外，還有以前兩種類型為主鏈，葡萄糖的支鏈有α-1,2、α-1,3 或α-1,4 連接的線性結構[19]，如曲二糖、黑曲霉糖。

2 低聚異麥芽糖的生產工藝

不同結構的IMOs 對其在功能性食品工業中的應用至關重要。需要選擇合適的生物催化劑，糖基受體與供體的比例，調節聚合程度和產品中α-（1,4）和α-（1,6）糖苷鍵的比例[20]。目前多以淀粉為原料，經酶法生產IMOs[21]。原料主要包括谷物淀粉（如玉米、大米、小麥等）和植物根部或塊莖（如紅薯、木薯、馬鈴薯等），以及從麥芽糖和葡聚糖中提取的淀粉水解物，因此生產IMOs 的原料大多具有來源廣泛且價格低廉的特點。

目前工業生產IMOs 的研究主要集中在酶法轉化和利用酶膜生物反應器、酶的固定化和生物催化[22]等生物技術手段來提高IMOs 的生產效率（如圖2）。

圖2 酶法生產低聚異麥芽糖的工藝流程[22]Fig.2 Enzymatic production scheme of isomaltooligosaccharides[22]

2.1 酶法轉化

轉移酶和水解酶家族的各種酶均可作用于不同底物生產IMOs。水解酶家族中的α-葡萄糖苷酶是工業生產IMOs 的關鍵酶之一，其可通過與糖基直接連接部分進行水解反應或將糖基殘基從活化供體轉移到受體上進行催化糖基化反應[23]。以淀粉為底物，通過來源于曲霉屬α-轉葡萄糖苷酶（EC 2.4.1.24）的轉苷作用，可大規模生產聚合度范圍在2～6 的IMOs產品[24]。表1 詳細介紹了利用不同底物生產不同聚合度的IMOs 產品所用的酶組合。

表1 生產不同聚合度低聚異麥芽糖用酶Table 1 Different enzyme combinations utilized in the production of short and long-chain isomaltooligosaccharides

PAN 等[25]利用α-轉葡萄糖苷酶和酵母菌生產出高純度IMOs，結果表明酵母發酵可消耗反應體系中生成的葡萄糖，提高IMOs 的含量。LEE 等[26]用來自嗜熱脂肪芽孢桿菌（BSMA）的淀粉酶和來自海棲熱袍菌的α-葡聚糖轉移酶（α-Gtase）同時使用較單酶能有效提高IMOs 的產量。但傳統酶法生產IMOs 的主要缺點是需要進行多步驟處理，例如糊化、液化和糖基化[15]。為進一步簡化工藝流程，目前已有同時進行糖化和轉糖基化或使用多種酶液生產IMOs[24-27]的相關研究。同時，工程融合酶（重組酶）的應用也能夠提升IMOs 的產量[28-29]。相關文獻報道表明，長鏈IMOs（DP≥10）才具有益生元活性，可由淀粉麥芽糖酶和α-轉葡糖苷酶復配獲得[17,30]。多酶復配的優點是其具有高效性，可減少酶負荷，生產出不同聚合度的IMOs 產品，并能夠運用在一步液化或糖化工藝中。此外，還需對酶促反應動力學進行研究，這樣不僅能夠科學利用酶法轉化技術，還利于深入剖析酶的調控機制。

2.2 酶膜生物反應器

酶膜反應器耦合了生物酶催化反應過程和膜分離過程，溶質可通過膜上外加電場、化學勢或壓力從反應混合物中進行滲透分離[37]。還可將生物催化，產物的分離、濃縮和酶的回收等操作同時進行。近年來，商品化的生物催化酶已經被廣泛地投入到低聚糖制備的工業生產中，而膜分離技術也在低聚糖的分離純化階段發揮著重要的作用。酶膜反應器在糖類制備中主要是用于制備淀粉糖，右旋糖酐酶膜反應器的出現實現了長鏈IMOs 的連續合成[38]。這項技術可通過10000 分子量截留單位的膜和改變酶與底物的比例對產品的分子量加以限制。GOULAS 等[29]使用可回收的超濾膜反應器，實現了IMOs 的連續生產，而ZHANG 等[6]則將α-葡萄糖苷酶添加在超濾膜之間，增加了IMOs 透膜速率，使IMOs 的產量提高到58.1%。

當前制備IMOs 的酶膜反應器中，所用酶主要以游離態形式存在。酶以游離態形式存在，其反應條件會受到很大的限制，雖然活性較高，但穩定性差，使酶膜體系不能夠長期穩定地運行[39]。相比于游離態的酶，固定化酶的活性雖有所降低，但其穩定性更有利于連續性操作，也更利于放大化生產IMOs。此外，酶膜反應體系中，膜僅靠孔徑篩分分離分子尺寸差異較大的分子。但在IMOs 的酶促反應中，異構糖之間并不能通過簡單的孔徑篩分進行有效分離[40]。為此可以利用手性分離膜原理將膜功能化，使其具備分離異構體的功能，同時作為固定化酶的載體，這不僅能夠緩解由產物抑制所導致的反應平衡，還可以直接得到產物。

2.3 酶的固定化

酶催化在生產IMOs 領域發揮著越來越重要的作用，然而在實際工業生產中因酶的成本問題以及其自身存在最適pH、最適溫度等約束條件而限制了酶的應用。酶固定化技術的運用則可提高酶的耐用性，擴大酶的適用范圍[41]。相比游離酶，固定化酶可以循環使用，易于從反應體系中分離[42]，另外，固定化酶的穩定性通常高于游離酶，有利于IMOs 的連續高效生產[43]。ZHANG 等[44]以麥芽糖為底物，將α-轉葡萄糖苷酶固定在海藻酸-殼聚糖-磷酸鈣雜化膠囊中。經過固定化的α-轉葡萄糖苷酶在循環使用15 次后，酶活仍能保留60%。BERTRAND 等[33]右旋糖苷酶固定在對流相互作用介質中。結果表明固定化酶在高溫下顯示出良好的穩定性，以及在使用78 d 后酶活仍能保留78%。重組酶的出現使IMOs 生產過程中葡萄糖的生成量減少，顯著提高了IMOs 的產量[17]。來源于海棲熱袍菌的麥芽糖轉葡糖基酶和來源于嗜熱脂肪芽孢桿菌的α-淀粉酶共同在大腸桿菌中表達，將IMOs 的含量提高到68%[24]，這與傳統的生產方法相比IMOs 的含量高出15%。但在固定化過程中可能存在一定的問題，如酶活損失，以及某些酶經固定化后底物特異性發生改變，這可能與底物結合口袋的變化有關[45-46]。為此，可以對不同種類酶的反應條件選擇合適的載體和固定化方法，調控優化固定化條件，這樣更有利于運用固定化技術來實現IMOs 的連續高效生產。

2.4 生物催化

生物催化是利用酶或者生物有機體（細胞、細胞器和組織等）作為催化劑進行化學轉化的反應過程[47]。全細胞催化作為生物催化技術的一個重要分支是在微生物細胞的作用下，將某種底物轉化成特定產物的過程，其實質是生物體系中酶的催化作用[48]。與傳統的提取酶催化相比細胞自身就是一個天然的酶催化系統，細胞內完整的多酶體系可以實現酶的級聯反應[49]，提高催化效率，減少傳統酶催化細胞裂解和蛋白質濃縮等步驟。不同于化學法和傳統酶催化法，全細胞催化法合成IMOs 無需額外補充昂貴的輔因子，也無需進行酶的純化和分離，可大大降低成本，具有底物來源廣、反應無污染、產物純度高的優點[50]。此外，酶在其原生細胞質中凍干處理后將酶封閉在其原始構象中使得整個細胞可以回收重復利用，具有較高的性價比[51]。OJHA 等[33]利用該技術將細胞與來自微小桿菌的 α-葡萄糖苷酶結合，將麥芽糖轉化為IMOs，其轉化效率可達58%。PAN 等[25]利用酶轉化與發酵的方法生產出低純度的IMOs，而在此期間OJHA 等[33]和 RUDEEKULTHAMRONG 等[17]則利用全細胞生物催化與復合酶技術作用于麥芽糖和麥芽三糖，提高了IMOs 的產量和純度，但所使用的產酶菌體則無法再次回收利用。而黑曲霉是一種絲狀真菌具有產酶能力強，菌體便于回收等特點，是用于全細胞轉化生產IMOs 的理想菌種[52-53]。因此，可選擇重復利用黑曲霉細胞生產IMOs 將有利于進一步提高商品IMOs 的純度和增加IMOs 的工業生產效率。

3 酶法制備低聚異麥芽糖現存問題

3.1 酶的特異性和底物選擇性差異

盡管現有的一些新型酶已經用于IMOs 的生產，但仍存在一些不足之處。如底物的轉化率低，轉糖基化階段所需時間長，以及酶的不合理使用[27]。而且從不同植物、哺乳動物、昆蟲、細菌和真菌中分離純化獲得的α-葡萄糖苷酶，具有不同的底物選擇性[54]。以及無論是野生型還是由細菌或霉菌通過基因改造等方式獲得的內切酶和外切酶作用不同底物產生IMOs的速率和產量均有不同[55]。根據對寡糖底物的水解方式可將葡萄糖苷酶分為外切（exo-）型與內切（endo-）型，根據底物特異性分為3 類，Ⅰ型偏好水解多種異質底物（如蔗糖和芳基-α-葡萄糖苷）；Ⅱ型在水解同質底物上更活躍（主要底物為麥芽糖、異麥芽糖），對異質底物的活性較低；Ⅲ型類似于Ⅱ型，但可水解長鏈底物（如多糖和淀粉）[56]。這些因素決定了所生產的IMOs 的特異性、聚合度、連接序列和連接類型的差異。因此，研究不同來源的酶的性質和酶促反應進程為工業生產IMOs 有著重要的意義。

3.2 酶膜反應器性能的提升

酶膜反應器作為一種生產低聚糖的新型技術[57]，其獨特的優點是在整個過程中反應可連續高效進行，產品中不含有酶，酶可回收再利用，對底物和產物的抑制性較小，生產成本低[58]。然而，在目前的應用狀態下也有一些亟待解決的問題，例如隨著反應時間的延長酶的活力逐漸下降，催化性能和膜的傳質性能也都會有所降低[59]，導致低聚糖的產量減少。目前，膜材料的不斷發展使膜的功能也不斷提高[60-61]，可以更好地解決酶活力損失、傳質速度下降等各種問題，還可運用更加精準的反應分離設計[62]、多酶協同催化[63]等技術來提高酶膜反應器的性能。為此，研究相關酶的性質以及提高酶膜反應器的性能成為了IMOs 產業化面臨的關鍵問題。

3.3 固定化酶技術的推廣

目前，固定化酶具有理想的化學和物理性質，也可回收再利用，在高溫下仍能保持良好的穩定性，反應pH 范圍廣，最終產品不含有酶。然而，固定化酶運用于IMOs的生產僅局限于實驗室層面，難以大量生產高純度的IMOs，也很難用于大規模的工業生產，其主要原因是生產成本較高。因此，研究簡便易操作和降低載體成本的固定化酶技術對工業生產IMOs 至關重要。

3.4 全細胞生物催化技術的應用

當前全細胞生物催化在IMOs 的生產中取得了一定的成效，但其存在的不足是轉化過程較為復雜，細胞的生長和底物的轉化是同時進行的。細胞內的各種反應會產生許多副產物。若酶未結合在細胞表面上，還需要用化學或物理方法對酶進行處理。還會由于細胞膜的傳質阻礙，使全細胞催化的效率降低。因此，提高細胞催化劑的高效性及循環利用性，以及保證細胞體系較高的傳質速率，對實現細胞催化從實驗室走向工業化生產IMOs 有著重要的意義。

4 總結與展望

隨著消費者對功能性食品的需求不斷增加，與其他具有益生元作用的低聚糖相比，IMOs 添加在不同食品中的潛在價值也更高。為了提高IMOs 的產量和生產效率，運用新的生物技術手段是必不可少的，使用這些生物技術方法來改進生產工藝，是將IMOs 的產量達到人們所預期的最大值的一個重要步驟。雖然現有的技術已有應用報道，但仍然存在許多因素限制了酶法制備IMOs 在食品工業中的應用。因此，需要進行更深入的研究來應對這些問題：a. 研究不同來源的酶的性質和酶促反應進程；b. 提高酶膜反應器的性能；c. 研究簡便易操作和降低載體成本的固定化酶技術；d. 提高細胞催化的高效性及循環利用性，以實現細胞催化從實驗室走向工業化。為此，一方面可在生物信息學和基因測序技術的幫助下，研究在自然界中不同來源的酶的性質。另一方面，還可對生產IMOs 的關鍵酶進行定向進化、合理設計以及計算機輔助對其更進一步的工程改造，以改變酶的活性、底物范圍、最適pH 等酶催化特性，從而獲得具有最佳兼容性的工程酶。此外，新型膜材料的使用，多酶協同催化有利于酶膜反應器在工業生產IMOs 的發展?？偟膩碚f，隨著酶工程的發展、酶催化機制的深入研究、新酶的探索及開發，酶技術在工業的應用潛力巨大，期望在未來的發展中，對于酶學方面做出更深入的研究，并結合生物技術、基因工程、蛋白質工程等將新技術的優勢運用到工業中，以此來更好地解決在規?；I生產IMOs 過程中所遇到的產量、時間、成本和資源等方面的問題。使用新型酶和利用酶膜生物反應器、酶的固定化和生物催化等生物技術手段將會在工業生產低聚糖領域取得更大的應用并發揮越來越重要的作用。