艾草等10種精油植物單萜合成酶生物信息學分析

景炳年　魏磊　謝曉陽　劉雨晴　周雍　王偉

摘要 ［目的］分析比較10種富含精油植物mono-TPS核苷酸和氨基酸序列。［方法］通過生物信息學相關軟件和網站比對和分析10種mono-TPS基因及蛋白序列，對其結構、理化性質、磷酸化位點、親/疏水性、跨膜結構域、亞細胞定位、二級結構、功能域、三級結構及進化關系進行預測和分析。［結果］10種精油植物mono-TPS氨基酸序列結構與理化性質基本一致，具有親水性，多不穩定，不含跨膜結構域；可能定位在質膜、線粒體內膜、細胞核或線粒體基質中；二級結構以α螺旋和無規則卷曲為主要構件，序列中包括底物結合區、鎂離子結合位點和天冬氨酸富集區，具有典型的植物萜類環化酶活性結構域，是Isoprenoid-Biosyn-C1超級家族成員之一，是一種類異戊二烯生物合成酶。通過進化樹分析單萜合成酶，艾草與玉米進化程度相似。［結論］該研究結果可為精油植物單萜化合物的研究提供理論基礎。

關鍵詞 精油植物；單萜合成酶；生物信息學分析

中圖分類號 Q 946文獻標識碼 A文章編號 0517-6611（2023）15-0088-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.15.021

Bioinformatics Analysis of Monoterpene Synthase in Ten Essential Oil Plants Including Artemisia argyi

JING Bing-nian，WEI Lei，XIE Xiao-yang et al

（Henan Plant Natural Products Development Engineering Technology Center，Henan Academy of Sciences，Zhengzhou，Henan 450002）

Abstract ［Objective］To compare and analyze the nucleotide and amino acid sequences of mono-TPSs from ten essential oil rich plants.［Method］The nucleotide and amino acid sequences of ten mono-TPS genes were analyzed using bioinformatic softwares and websites，and the physical and chemical properties，secondary/tertiary structures and functional domains were predicted．［Result］Results showed that the structure and chemical properties of mono-TPSs from the ten essential oil plants were basically consistent，which were hydrophilic，unstable and did not contain transmembrane domains.The ten mono-TPSs might be located in plasma membrane，mitochondrial inner membrane，nucleus or mitochondrial matrix.The α-helix and random coil were found the main component of all the mono-TPS secondary structure.The sequence included substrate binding region，magnesium ion binding site and aspartic acid enrichment region，and had a typical plant terpene cyclase activity domain，belonging to the isoprenoid-biosyn-c1 superfamily.The phylogenetic anylysis showed Artemisia argyi was similar with Zea mays in degree of evolution.［Conclusion］These analysis results can provide a theoretical basis for the study of monoterpenes in essential oil plants.

Key words Essential oil plants;Monoterpene synthase;Bioinformatics analysis

單萜類化合物在植物中廣泛存在，種類繁多，賦予植物特殊的香氣和生物活性，是植物精油主要的組成成分，廣泛應用于食品、化妝品和醫藥行業［1］。如艾草精油，以桉油精、龍腦、馬鞭草烯醇、α-蒎烯、莰烯、β-蒎烯、4-蒈烯、桉葉油醇、γ-松油烯、樟腦、甲酸異莰酯、4-萜烯醇（4.66%）等單萜類化合物最為豐富［2］，既是重要的香味物質，又具有良好的抗菌抗病毒效果。互葉白千層精油，主要成分為蒎烯、檸檬烯、1，8-桉葉素等單萜類化合物［3］，廣泛應用于化妝品和食品保鮮劑。傣藥紫色姜精油，包含α-側柏烯、β -側柏烯、α-異松油烯、檜烯、γ-松油烯等單萜類物質［4］，在治療多種真菌皮膚疾病及其皮膚保健護理方面頗具獨特療效。

單萜類化合物在植物體內的生物合成途徑較為復雜，由多種酶進行表達、催化及合成調控。其中，單萜合成酶（monoterpene synthase，mono-TPS）是重要的關鍵限速酶之一，調控2-C-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸途徑下游，將共同前體香葉基焦磷酸進行環化和異構化，生成多個立體化學構象不同的單萜類化合物［5-7］。生物信息學是一門結合現代生命與信息科學、數學、計算機科學等重要學科而形成的新興的交叉學科，它以計算機為工具對蛋白質及核酸序列等生物信息進行儲存、檢索和比對分析，從而預測其分子的結構與功能及兩者之間的相互作用關系［8］。生物信息學快速發展對生命科學影響深遠，并極大促進其他相關發展領域的進步。

筆者利用生物信息學方法對艾草、紫色姜等10種富含精油的藥用或食用植物的mono-TPS基因及編碼的氨基酸序列的一級結構（包括組成、理化性質、親-疏水性和亞細胞定位）、二級結構、功能結構域、三級結構和親緣進化關系等進行分析預測，以期為今后開展mono-TPS的表達、轉化及功能鑒定等深層次研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

艾草（Artemisia argyi）mono-TPS mRNA序列來自參考文獻［9］，紫色姜（Zingiber montanum）、互葉白千層（Melaleuca alternifolia）、檀香（Santalum album）、鐵觀音茶（Camellia sinensis）、合歡（Albizia julibrissin）、蓖麻（Ricinus communis）、小果咖啡（Coffea arabica）、中華獼猴桃（Actinidia chinensis）和玉米（Zea mays）mono-TPS mRNA序列來自National Center of Biotechnology Information （NCBI）基因序列數據庫，登錄號和cDNA長度見表1。

1.2 方法

10種精油植物核苷酸和氨基酸序列通過NCBI網站在線分析；相對分子質量、等電點、不穩定系數等理化性質通過Protparam進行在線分析；蛋白質磷酸化位點通過NetPhos 3.1 Server進行預測；跨膜結構域通過TMHMM Server v.2.0進行預測；親/疏水性通過ProtScale進行預測；亞細胞定位通過PSORT Prediction進行分析。二級結構通過SOPMA進行分析，功能域通過Conserved domains軟件進行預測；通過SWISS-MODEL完成mono-TPS蛋白高級結構同源建模；通過MEGA7.0.26軟件構建mono-TPS系統進化樹。具體網址見表2。

2 結果與分析

2.1 核苷酸及其氨基酸序列的結構和理化性質

10種精油植物mono-TPS序列的理化性質通過ProtParam在線網站進行分析預測（表3）。可知mono-TPS核苷酸序列起始密碼子都是ATG，終止密碼子是TAG、TGA或TAA；編碼氨基酸數在527～621，平均為584.7個；各蛋白相對分子質量在61 162.97～70 468.28 kD，平均為67 442.74 kD；理論等電點在5.42～6.01，平均為5.68，表明mono-TPS為酸性蛋白。從氨基酸組成上可知，酸性氨基酸殘基比例較堿性氨基酸殘基比例高，表明mono-TPS蛋白為酸性；10種植物mono-TPS蛋白中，亮氨酸（Leu）、天冬氨酸（Asp）、丙氨酸（Ala）、谷氨酸（Glu）、絲氨酸（Ser）和異亮氨酸（Ile）為含量最多的氨基酸殘基。總原子數范圍在8 549～9 838，平均為9 437，消光系數為1.298～1.741，平均為1.507。檀香和蓖麻的不穩定系數小于40，屬穩定蛋白，其余均不穩定。

2.2 磷酸化位點

磷酸化在蛋白質翻譯后修飾中最為普遍，通過對底物蛋白的蘇氨酸、絲氨酸和酪氨酸進行磷酸基團轉移而調節蛋白質活性和功能，從而調控各種細胞活動，因而磷酸化位點的確定非常關鍵，是認識蛋白質作用分子機理的基礎［10］。該研究中10種精油植物mono-TPS蛋白磷酸化位點通過NetPhos 3.1 Server進行分析預測，個數最小的是艾草（41個），最多的是玉米（63個）。以艾草為例，共有41個磷酸化位點（圖1），其中19個絲氨酸磷酸化位點，分別是S35、S39、S54、S78、S146、S163、S184、S189、S195、S224、S234、S268、S270、S336、S387、S435、S460、S490、S515；12個蘇氨酸磷酸化位點，分別是T19、T82、T95、T193、T196、T209、T210、T313、T405、T409、T450、T475；10個酪氨酸磷酸化位點，分別是Y84、Y97、Y190、Y340、Y343、Y380、Y414、Y448、Y452、Y522。

2.3 親-疏水性、跨膜結構域和亞細胞定位特征

2.3.1 蛋白親-疏水性的分析預測。

蛋白質親-疏水作用是其折疊的主要驅動力，對親-疏水性的分析和驗證對蛋白質的穩定性、構象和功能具有重要意義［11］。筆者采用 Protscale進行預測分析，以艾草為例，多肽鏈第47位氨基酸親水性分值最低（-2.644），第396位氨基酸疏水性分值最高（2.800），親水性和疏水性氨基酸占比分別為65.8%和34.2%，推測為親水性蛋白。其余9種mono-TPS肽鏈親水性氨基酸占比在鐵觀音茶的62.8%到紫色姜的71.5%，推測均為親水性蛋白。

2.3.2 跨膜結構域特征。

跨膜結構是蛋白質與膜內在蛋白的靜電相互作用和氫鍵鍵合相互作用與膜結合的一段氨基酸片段，一般由20個左右的疏水性氨基酸殘基組成，主要形成α螺旋，常由跨膜蛋白的效應區域所展現［12］。該研究中10種精油植物mono-TPS蛋白跨膜結構通過TMHMM Server v.2.0進行分析預測，結果表明（以艾草為例），10個mono-TPS蛋白均沒有跨膜結構域，說明mono-TPS蛋白不是膜蛋白（圖2）。

2.3.3 亞細胞定位特征。

大多數在細胞質中合成的蛋白質會被轉運到特定的亞細胞位置中發揮生物學功能，且只有位置正確時才能正確行使功能，因此對蛋白質亞細胞定位的分析預測能極大加速對其結構和功能的研究［13］。該研究中10種精油植物mono-TPS蛋白亞細胞定位通過PSORT Prediction進行分析預測。結果表明（表4），10種精油植物的亞細胞定位各不相同，其中艾草mono-TPS最有可能定位在質膜上，其肯定度為0.700；蓖麻mono-TPS最有可能定位在線粒體內膜上，其肯定度為0.570；合歡和小果咖啡最有可能定位在細胞核上，分別為0.760、0.674；互葉白千層則在線粒體基質中，為0.653。

2.4 10種精油植物mono-TPS蛋白二級結構預測

在生物信息學領域，很難從蛋白質一級結構預測其高級結構，因而蛋白質二級結構預測受到很多人重視。二級結構是多肽鏈局部空間結構，是構成蛋白質高級空間立體結構的基本要素，二級結構的預測分析對研究蛋白質的結構和功能有著極其深遠的意義［14］。通過SOPMA分析預測10種精油植物mono-TPS蛋白二級結構，可知10種精油植物mono-TPS中均有4種二級結構元件，包括α螺旋（所占比例最高）、無規則卷曲、β折疊和延伸鏈。以艾草mono-TPS為例，α螺旋占比72.30%、無規卷曲占比20.87%、β折疊占比3.80%和延伸鏈占比3.04%。其余9種mono-TPS蛋白4種結構元件組成與艾草mono-TPS相似（表5）。由于α螺旋占比大于45%，而且β折疊占比小于5%，因此10種精油植物mono-TPS蛋白均屬于全α型蛋白。

2.5 蛋白質功能結構域的分析預測

功能結構域通常是由50～400個氨基酸殘基構成的球狀實體，它在蛋白質中可以獨立穩定存在，并且與完成蛋白質功能有著密切的關系［15］。該研究以艾草mono-TPS為例，其保守區和功能域通過Conserved domains進行分析預測，結果如圖3所示。艾草mono-TPS蛋白保守區域為底物結合口袋、鎂離子結合位點和2個天冬氨酸富集區，具有典型的植物萜類環化酶活性結構域，能將無環的異戊二烯二磷酸進行環化，是Isoprenoid-Biosyn-C1超級家族成員之一。其余9種植物mono-TPS與艾草相似，均屬類異戊二烯生物合成酶。

2.6 10種精油植物mono-TPS蛋白三級結構的預測分析 蛋白質的三級結構是蛋白質分子處于天然折疊狀態的三維構象，是在二級結構的基礎上進一步盤繞、折疊形成的［16］，因此預測分析蛋白質三級結構對于認識其功能具有重要意義。筆者以艾草mono-TPS為例，其三級結構通過SWISS-MODEL進行分析預測，同源建模匹配到的模板蛋白為來自楊柳科楊屬植物銀灰楊（Populus canescens）的異戊二烯合成酶（ACCESSION：3n0f.1.A）。2個mono-TPS蛋白序列一致性為31.73%，GMQE值為0.75，因此分析預測結果較理想。艾草mono-TPS蛋白3D結構通過Swiss Pdb-Viewer工具進行顯示（圖4），表明其為單體蛋白結構。

2.7 10種精油植物mono-TPS蛋白的系統進化樹

進化樹是描述生物體形成或進化順序的拓撲樹結構，通常是二叉樹的形狀，一般由一系列節點分支組成，節點代表某個具體序列，節點之間的連線代表物種之間的親緣關系。進化樹可以分析不同物種之間的親緣關系遠近，有助于判斷生物體在進化過程中的地位及在遺傳本質上探究生物體多樣性的產生機制［17］。用MEGA 7.0.26軟件對10種精油植物mono-TPS蛋白構建系統進化樹。結果顯示，10個植物物種之間呈現明顯的親緣關系，其中紫色姜與合歡、互葉白千層與小果咖啡、艾草與玉米、檀香與中華獼猴桃這4組兩兩物種之間親緣關系最近，進化程度距離也最近（圖5）。

3 討論與結論

不同精油植物中單萜類化合物種類多、香氣特征明顯，其基本碳架由2個異戊二烯單位構成，結構最為簡單，其中具有花香和果香的精油或單萜化合物已經在食品、空氣清新劑和化妝品等行業得到廣泛應用，具有生物活性的精油或單萜類化合物也在醫藥產品和健康產品領域得到廣泛應用。植物中萜類化合物的多樣性主要由于萜類合成酶種類多樣造成的，在一種植物中可能存在多種萜類合成酶［18］，單萜合成酶是單萜生物合成的關鍵酶，決定了單萜結構的多樣性［19］。

單萜合成酶為親水性蛋白，多數不穩定，不存在跨膜結構域；亞細胞定位預測可能定位在質膜線粒體內膜、細胞核或線粒體基質中。10種精油植物的單萜合成酶的二級結構以α螺旋和無規則卷曲為主，均包括底物結合區、鎂離子結合位點和天冬氨酸富集區，具有典型的植物萜類環化酶活性結構域，是Isoprenoid-Biosyn-C1超級家族成員之一，是一種類異戊二烯生物合成酶。三級結構預測分析顯示，單萜合成酶為單體結構蛋白。通過系統進化樹分析單萜合成酶，結果表明，艾草和玉米進化程度相似，與中華獼猴桃、檀香、鐵觀音茶進化相距較遠。

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基金項目 河南省科技攻關項目（222102110219）；河南省科學院重大科研項目聚焦專項（210113003）。

作者簡介 景炳年（1980—），男，甘肅蘭州人，助理研究員，博士，從事植物保護研究。*通信作者，副研究員，博士，從事植物化學及分子生物學研究。

收稿日期 2022-08-29；修回日期 2022-09-21