阿維鏈霉菌中ECF-Sig16對阿維菌素合成的影響

羅帥， 問亞琴， 朱華， 張蓉， 王曉雯， 劉麗麗， 朱建亞*

（1.北京電子科技職業學院生物工程學院，北京 100176； 2.北京市農林科學院水產科學研究所，北京 100068）

鏈霉菌屬是一類高G+C 含量的革蘭氏陽性絲狀細菌，屬于放線菌目。該屬不僅廣泛分布于有機質豐富、含水量適中的中性或偏堿性土壤中[1],還存在于海水等環境中[2]。鏈霉菌生活周期比較復雜，生長時感應到營養匱乏信號后能發生明顯形態分化，而鏈霉菌的次級代謝往往與生長分化相偶聯，推測這2 種生理過程可能受到相同的蛋白調控。次級代謝物的合成通常受到簇內調控蛋白和多效調控蛋白的調控，對這些調控蛋白進行遺傳操作可以顯著提高一些重要次級代謝產物的產量。

ECF (extracytoplasmin function)-Sigma 蛋白主要被細胞膜外信號激活，也可響應胞內信號。ECF-Sigma 蛋白調控的生理功能非常廣泛，在細菌抵抗環境變化帶來的脅迫以適應生存中發揮重要作用。在珊瑚小雙孢菌中，ECF-SigMibX 控制臥孔菌素合成[3]。在谷氨酸棒狀桿菌中，ECFSigH 響應溫度脅迫[4]、巰基氧化脅迫[4]和酸脅迫[5]。在結核分枝桿菌中，ECF-SigE 在維持細胞表面完整性方面發揮重要作用[6]。鏈霉菌的代謝和生存環境比較復雜，基因組上含有的ECF-Sigma 基因多達幾十個[7]。天藍色鏈霉菌中有約50 個ECFSigma 調控蛋白，但是只有幾個ECF 因子得到深入研究。其中SigR 響應巰基氧化脅迫[8]和抗生素脅迫[9]；SigT 負調控氣生菌絲形成[10]，還能響應氮脅迫信號調控放線紫紅素合成[11]；SigE 在調控細胞表面壓力脅迫中發揮關鍵作用[12]；SCO4417 正調控放線紫紅素、鈣依賴型抗生素、氣生菌絲和孢子產生[13]。在其他鏈霉菌中，有關ECF-Sigma 調控蛋白的功能研究較少。在白色鏈霉菌中，antA是抑菌霉素合成基因簇內的ECF-Sigma 基因，SigAntA 通過控制抑菌霉素前體供應調控抑菌霉素生成[14]；SigW 負調控鹽霉素生成及促進細胞生長[15]。在筑波鏈霉菌中，SigG1 調控形態分化[16]。在鏈霉菌KCCM 11116P 中，過表達ECF-Sigma 調控蛋白基因FujE能提高抗生素FK506產量[17]。

阿維菌素是由阿維鏈霉菌產生的較主要的代謝產物之一，具有廣譜、高效、低毒的殺蟲特性[18?19]，在農業與醫藥領域擁有良好的應用市場。隨著阿維鏈霉菌全基因組測序完成和阿維菌素生物合成途徑的闡明，通過基因工程手段提高阿維菌素的產量取得了一些進展。aveR 是阿維菌素合成基因簇內正調控基因[20]。阿維鏈霉菌中SAV151[21]和SAV576[22]、SAV577[22]3個TetR 家族的調控蛋白（TetR-family regulator, TFR）均抑制阿維菌素的合成。AvaR2負調控阿維菌素合成和阿維鏈霉菌生長，但不影響形態分化[23]。AraC 家族的轉錄調控因子SAV742 抑制阿維菌素合成[24]。BldD 通過直接調控結構基因aveR 與aveA1、aveD、aveA4、aveF、aveBVⅢ促進阿維菌素合成[25]。ROK家族調節子ROK7B7 通過直接調控aveA1 抑制阿維菌素合成[26]。持家Sigma調控蛋白HrdB 能結合aveR 啟動子，突變的hrdB 基因導入阿維鏈霉菌高產菌能使阿維菌素B1a 產量提高約50%[27]。阿維鏈霉菌基因組預測有60 個Sigma 基因，其中47 個屬于ECF-Sigma 基因，目前僅有關于ECF-Sig6、ECF-Sig25、ECF-Sig5 調控蛋白功能研究的報道。這3 種ECF-Sigma 因子都能間接地負調控阿維菌素的合成，且不影響菌株的生長與形態分化[28-30]，表明ECF-Sigma 蛋白可以參與阿維菌素生物合成調控。sig16 基因是阿維鏈霉菌高表達基因中唯一的ECF-Sigma 基因[31]，暗示其在阿維鏈霉菌生長發育中可能發揮重要作用，但其如何影響阿維菌素產生以及菌株分化尚缺乏深入研究，因此本研究通過構建sig16 缺失和過表達菌株，來考察Sig16對阿維菌素生物合成的影響和調控機制。

1 材料與方法

1.1 菌株、質粒和引物

本研究所用的菌株和質粒詳見表1，引物詳見表2。

表1 試驗菌株和質粒Table 1 Plasmids and strains used in the study

表2 試驗用引物Table 2 Primer sequences in this study

1.2 培養基

采用LB (luria bertani)培養基進行大腸桿菌常規培養，MM 培養基用于形態觀察[35]，YMS 培養基用于固體產孢培養與觀察[36]，可溶的發酵培養基FM-Ⅱ用于測定菌株的產量曲線與生長曲線[37], 種子培養基和不可溶發酵培養基FM-Ⅰ用于發酵[20]。

1.3 sig16缺失、過表達及回補菌株的構建

以野生型（wild type，WT）菌株總DNA 為模板，通過PCR擴增sig16基因的同源臂后連接到質粒pKC1139, 隨后轉化入大腸桿菌JM109。通過驗證得到用于缺失sig16 基因的載體pDsig16，并將其轉化至大腸桿菌ET12567 中進行去甲基化，再轉入野生型阿維鏈霉菌獲得突變株。通過PCR方法，以WT和突變株的DNA為模板進行驗證，最終獲得sig16缺失菌株。

以WT 菌株總DNA 為模板，PCR 擴增含有sig16 基因的DNA 片段，將其連接到pJL117 質粒中的紅霉素抗性基因啟動子ermEp*下游。將帶有啟動子的sig16 整合片段與質粒pSET152 連接，獲得重組質粒pSET152-ermp-sig16。去甲基化后的重組質粒分別轉入sig16 缺失菌株和WT 菌株中，得到sig16回補菌株和sig16過表達菌株。

1.4 阿維菌素的發酵

將孢子懸液進行梯度稀釋后涂布平板分離出產孢良好的單菌落。再將單菌落孢子轉接于YMS 上，28 ℃倒置培養7~10 d，待長出豐富孢子后接種于500 mL 三角瓶中 (YMS 培養基裝量為20%), 28 ℃、230 r·min-1搖床培養24 h 后,按5%的接種量轉接至250 mL 三角瓶中(發酵培養基裝量為20%), 28 ℃、250 r·min-1搖床培養。

1.5 阿維菌素的產量測定

先取1.0 mL 發酵液，溶解于4.0 mL 甲醇中，浸泡30 min 以上，每隔10 min 用渦旋振蕩器振蕩1 次，共3 次。6 000 r·min-1離心10 min，取上清液經過有機膜過濾后用高效液相色譜（high performance liquid chromatography, HPLC）測定阿維菌素產量。HPLC 分析條件:流動相為甲醇與水的混合溶液，體積比9∶1；流速1.0 mL·min-1;檢測波長246 nm。阿維菌素B1 標準品購自齊魯制藥廠,由質量分數為97%的阿維菌素B1a 和3%的阿維菌素B1b 組成,將該標準品用甲醇溶解配制成200 μg·mL-1的溶液作為對照。

1.6 阿維鏈霉菌生物量測定

將在可溶發酵培養基FM-Ⅱ中培養的發酵液吸取1 mL用于產量測定，其余發酵液6 000 r·min-1離心10 min 收集菌絲體于80 ℃烘干,待菌體質量基本不變時稱量細胞干重。

1.7 Sig16蛋白的大量表達及純化

PCR 擴增sig16基因片段，與pET-28a(+)質粒相連得到蛋白表達載體pET28-sig16。將重組質粒轉化至大腸桿菌BL21 (DE3)中，經異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β -D thiogalactoside,IPTG）誘導后進行超聲破碎，變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamid gel electrophoresis, SDS-PAGE）檢測結果顯示His6-Sig16 蛋白大部分存在于在上清液中。用鎳離親和層析介質（Ni-nitrilotriacetic acid, Ni-NTA）進行蛋白純化，定量分裝后置于-80 ℃保存。

1.8 凝膠阻滯試驗

凝膠阻滯試驗(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)按照Roche 公司試劑盒（DIG Gel Shift Kit，2nd Generation）的說明書進行操作。PCR 擴增DNA 后在3’端用地高辛標記得到探針。按照說明書要求配置25 μL 樣品體系，在5%的非變性聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳，蛋白-DNA復合物和游離的DNA 由于遷移率不同從而得到分離。電泳后通過電轉印法將探針轉移至尼龍膜上,用堿性磷酸酶發光底物進行檢測，暗室壓X 光片后顯影定影。

2 結果與分析

2.1 sig16及其附近基因的功能預測

sig16全長1 191 bp，編碼一個由396 個氨基酸殘基組成的ECF-Sigma 調控蛋白，其C-端含有1 個介導蛋白互作的三四氨基酸重復基序（tetratricopeptide repeat，TPR）（圖1A）。 上游SAV1196基因編碼未知功能蛋白。SAV1196與sig16間有1 bp 重疊，暗示這2 個基因共轉錄。從間隔區的距離和基因功能推測，sig16下游基因SAV1190~1194是共轉錄的,它們組成了1 個支鏈氨基酸ABC 轉運系統操縱子。其中，SAV1190基因編碼底物結合蛋白，SAV1191編碼通透酶，SAV1192編碼通透酶，SAV1193編碼ATP 結合蛋白，SAV1194編碼ATP 結合蛋白。SAV1189是SAV1190的上游基因，編碼乙酰胺酶調節蛋白；SAV1188編碼MarR 家族的轉錄調控蛋白（圖1B）。

圖1 Sig16的保守結構域及sig16在野生型阿維鏈霉菌基因組中的位置Fig. 1 Conservative domain of Sig16 and organization of sig16 and its adjacent genes

2.2 Sig16對阿維菌素合成的影響

為研究阿維鏈霉菌中ECF-Sig16 的功能，以WT 菌株作為對照，將sig16基因的缺失菌株和回補菌株在可溶發酵培養基FM-I 中搖瓶發酵10 d。經HPLC 檢測后發現，Dsig16 中阿維菌素的產量上升至野生型菌株的1.49 倍；回補株的產量與野生型相比無明顯差別；sig16過表達菌株的產量則顯著降低61%（圖2）。由此表明，Sig16 抑制阿維菌素的合成。

圖2 WT與sig16突變株中的阿維菌素產量Fig. 2 Avermectin production in WT and sig16 mutant strains

為明確ECF-Sig16 是否通過影響生物量抑制阿維菌素合成，將WT 菌株、sig16缺失菌株和回補菌株搖瓶發酵10 d，測定并繪制產量曲線和生長曲線。結果（圖3）顯示，在液體發酵期間，各菌株細胞干重無明顯差別，Sig16 不影響阿維鏈霉菌的菌體生長。sig16缺失菌株的阿維菌素產量較野生型明顯提高，說明Sig16 對阿維菌素合成的抑制作用并非通過刺激菌體生長實現。

圖3 WT和sig16突變株的阿維菌素產量曲線和生長曲線Fig. 3 Avermectin yield curve and growth curve of WT and sig16 mutant strains

2.3 Sig16與SAV1190啟動子區結合

ECF-Sigma 調控蛋白的功能是在接受信號后起始靶基因的轉錄，所以推測Sig16對阿維菌素合成基因簇基因的轉錄抑制作用是間接的。為此，首先用重組His6-Sig16 蛋白與aveR和aveA1啟動子區探針進行了EMSA 試驗，結果如圖4A 所示。可以看出，His6-Sig16 不能與探針發生特異性結合，證實Sig16 對aveR和aveA1的轉錄負調控作用是間接的。

圖4 His6-Sig16與探針aveRp、aveA1p、SAV1188p、SAV1190p和SAV1196p的體外EMSA試驗Fig. 4 EMSA assays of His6-Sig16 with probes aveRp， aveA1p， SAV1188p， SAV1190p and SAV1196p

ECF-Sigma調控蛋白通常能夠結合自身基因啟動子從而起始轉錄[38]，因此利用EMSA 檢測了Sig16 與自身啟動子的結合情況。sig16和上游SAV1196基因有1 bp重疊，推測二者共用啟動子。SAV1196和SAV1197轉錄方向相反，推測這2 個基因的啟動子應位于基因間隔區內。PCR 擴增該間隔區片段并標記為探針SAV1196，結果顯示，His6-Sig16 蛋白不能使探針發生滯留，表明Sig16不能結合該啟動子起始轉錄（圖4）。

推測在SAV1188基因上游區域可能含有自身基因啟動子。在SAV1189~SAV1190基因間隔區，可能包含有支鏈氨基酸ABC轉運系統操縱子的啟動子。因此利用PCR 擴增并標記DNA 片段，命名為探針SAV1188p與探針SAV1190p。EMSA結果顯示，His6-Sig16蛋白不能與探針SAV1188p結合形成滯留條帶，但能夠與探針SAV1190p特異性結合形成滯留條帶（圖4B），暗示Sig16 可以結合在SAV1190基因啟動子區起始SAV1190操縱子中基因的轉錄。

2.4 Sig16對阿維鏈霉菌形態分化的影響

為研究Sig16 是否影響阿維鏈霉菌的形態分化，在YMS和MM固體培養基上培養，觀察野生型菌株、sig16缺失菌株和回補菌株的生長及形態分化，結果如圖5所示。在產孢培養基YMS上，各菌株進行正常形態分化，產孢能力無明顯差別。在營養物質貧乏的基本培養基MM 上，菌株維持較慢生長狀態，且各菌株間生長情況也無明顯差別。由此表明，Sig16在上述培養條件下不影響阿維鏈霉菌的生長和形態分化。

圖5 sig16突變株在YMS和MM固體培養基上的形態觀察Fig. 5 Morphologic observation of sig16 mutant strains incubated on YMS and MM solid medium

3 討論

通過對sig16基因突變株進行搖瓶發酵和生長曲線的分析，表明Sig16能夠抑制阿維菌素的合成，但不影響阿維鏈霉菌生長。EMSA 結果顯示Sig16 不能直接結合在aveA1和aveR啟動子區，暗示Sig16 對阿維菌素合成基因簇中的轉錄抑制作用是間接的，推測Sig16的靶基因可能直接或間接地負調控aveR和aveA1的表達。在糖多孢紅霉菌中，支鏈氨基酸是紅霉素合成的前體物質，對支鏈氨基酸ABC 轉運系統進行遺傳操作能提高紅霉素的產量[39]。Sig16 能特異性地結合在支鏈氨基酸ABC 轉運系統操縱子的啟動子，暗示Sig16 能直接調控支鏈氨基酸的轉運。支鏈氨基酸包含亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸，它們不但是蛋白質的合成單元，異亮氨酸和纈氨酸還是阿維菌素a 組分和b 組分合成起始單元的前體物質[40]，推測Sig16能通過控制胞內支鏈氨基酸的含量抑制阿維菌素合成。目前對SAV1190~SAV1194的研究還未見報道，它們是否影響阿維菌素合成還需進一步研究。

ECF-Sigma 調控蛋白通常是一種多效調控蛋白，其直接作用的靶基因廣泛分布于基因組中，有些靶基因與ECF-sigma 基因相距較遠。在阿維鏈霉菌中，雖然ECF-Sig6、ECF-Sig25、ECF-Sig5 能影響阿維菌素的合成，但具體機制仍不清楚。目前也沒有研究發現能夠起始aveR轉錄的ECF-Sigma調控蛋白。深入了解阿維鏈霉菌中包含ECFSigma 蛋白調控系統在內的阿維菌素合成調控機制有助于改善菌株的基因工程改造效果，選育更加高產的阿維菌素工業生產菌株。在今后試驗中還可嘗試通過ChIP-seq尋找Sig16的直接靶基因，進而揭示Sig16調控阿維菌素合成的機制。