江浙地區菱品種遺傳多樣性的SLAF-seq分析

袁 曄,劉 睿,王凌云,沈 盟,葉雪蓮,權新華,王瑞森,姚祥坦,*

(1.嘉興市農業科學研究院,浙江 嘉興 314016; 2.浙江大學 蔬菜研究所,浙江 杭州 310058; 3.金華市農業科學研究院(浙江省農業機械研究院) 浙江省特色水生蔬菜育種與栽培重點實驗室,浙江 金華 321000)

菱屬(TrapaL.)為菱科(Trapaceae)一年生浮葉水生草本植物,生長于淺水湖泊、河灣、池塘和水田中,在我國分布廣泛,尤其是在黑龍江流域和長江中下游地區種類十分豐富[1-2]。菱屬植物是重要的水生蔬菜種類,其成熟果實淀粉含量高達80%,被聯合國糧農組織(FAO)列為重要的水生糧食作物,在中國和印度多年來被廣泛種植[3-4]。栽培菱品種具有產量高、品質優等特點,在我國長江中下游地區尤其是江蘇、浙江一帶作為特色水生蔬菜廣泛栽培[5]。

江浙地區菱的地方傳統品種資源豐富[6-7],依果實形態分為五角菱、兩角菱和四角菱3種類型,依果實顏色分為青菱和紅菱[8],其中無角菱品種少,南湖菱即是其中一個比較特殊的品種[9]。近年來,受種植效益等因素影響,菱的種植面積急速下降,種質資源面臨丟失風險。同時,品種間混雜現象越來越嚴重,例如,在南湖菱群體中,出現了有角的個體,地方品種的特色和優勢難以維持,因此亟須開展種質資源的保護,并加以合理利用。種質資源鑒定是保護和利用的前提,但目前對菱的相關研究甚少。丁炳楊等[10]曾根據菱屬植物花粉形態,將浙江省內的9個種菱屬植物分為野菱類、烏菱類和細果野菱類,并提出野菱類是較烏菱類原始的一個類群,南湖菱在菱屬植物中處在較高的進化水平,并認為南湖菱與四角菱親緣關系更近。胡仁勇等[11]用31個性狀將國內菱屬37個居群分為3大類,其中9個栽培居群分在一類中,說明栽培菱品種之間的親緣關系相對比較近;并將9個栽培品種分為3組,分別是四角菱一類,二角的烏菱和二角菱一類,無角的南湖菱單獨一類,指出南湖菱與四角菱的關系更近。最近,丁炳揚等[12]把中國菱屬分為細果野菱和歐菱2個種,并將歐菱劃分為6個變種,將二角菱、烏菱統稱為菱變種,將四角菱和南湖菱統稱為四角菱變種。但以上分類,均是基于形態學的鑒定和分類結果,分子生物學的相關證據不足。

董晶萊等[13]利用DNA條形碼技術對江浙不同產地的5份菱屬植物進行了分子鑒定,發現菱栽培種間具有較高的穩定性。保曙琳等[14]利用rDNA ITS片段分析技術對長江中下游地區10個菱屬居群進行DNA分子鑒別,表明菱屬各居群間rDNA ITS的差異百分率較小,其親緣關系較近,雖然根據ITS序列的特征可以較好地鑒定野生菱和栽培菱,但在栽培菱品種之間的親緣關系及遺傳距離仍未涉及。由于缺乏充分的基因組相關信息,目前對于菱屬植物的遺傳多樣性尤其是栽培菱品種之間的遺傳多樣性的認識還是十分有限的,從而也限制了生產商對菱種質資源的開發和利用。利用現代分子生物學相關理論和技術明確栽培菱品種之間的親緣關系,確定角的個數等形態學性狀在親緣關系遠近的決定及菱的分類中的貢獻,對于菱種質資源的保護、種質創新利用等均具有十分重要的意義。

單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism,SNP)是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態性,它是可遺傳的變異中最常見的一種,由于其具有密度高、分布廣、富有代表性,易實現自動化分析等特點,在遺傳學分析中得到廣泛應用。SNP分子標記技術,也以其高通量的特征,在分子遺傳圖譜構建、遺傳多樣性與種質鑒定、重要性狀相關基因的定位和分子標記輔助選擇等領域發揮出巨大的優勢。其中,簡化基因組測序SLAF-seq(specific-locus amplified fragment sequencing)是特異性位點擴增片段測序技術的簡稱,該技術降低了基因組的復雜度,并且不依賴參考基因組序列,成本低,成為SNP標記開發的首選[15]。通過SLAF-seq,在玉米[16]、沙冬青[17]、葡萄[18]、蘋果屬植物[19]、山西省地方梨的品種[20],以及高粱[21]等植物中,均已開發獲得大量特異性SNP位點,并以SNP進行遺傳分析,獲得了種質資源遺傳多樣性的相關信息,明確了不同種質資源之間的親緣關系。

本研究通過SLAF-seq技術,對江浙地區17份主要的菱栽培品種以及1份野生菱材料進行高通量測序,鑒定SNP,并利用獲得的SNP數據進行群體多樣性分析,包括進化樹分析、群體結構分析及群體特異SNP標記的開發,并與其主要植物學性狀分類進行相互驗證,以期明確不同類型菱栽培品種之間的親緣關系,為菱種質資源的鑒定保護和菱新品種的選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

18份菱材料均為嘉興市農業科學研究院收集保存(表1)。于2020年上半年采用育苗移栽的方式種植,于3月初每個材料挑選10個健康菱種,進行點播,株距20 cm,每個材料播種一行。將面積為48 m2的水泥池用漁網分隔成4個面積12 m2的小區,于5月初每個材料選2株,分單株各種植2個小區。于8月下旬,菱結果期進行取樣。

表1 供試菱資源及原產地明細Table 1 Resources and origin of Trapa L. in this study

1.2 主要農藝性狀調查

菱生物學性狀以菱初花期進行調查,菱果性狀于盛產期進行調查。葉片于初花隨機取15個菱盤,于每個菱盤中選最大葉進行測量,菱果數據為菱盛產期每種隨機取15個菱果進行測定。測量數據采用DPS軟件進行分析。

1.3 基因組DNA的制備

采用CTAB法提取菱樣品的DNA,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量,Nanodrop檢測DNA濃度,樣品純度D260/D280分布在1.8～2.0,所提取的樣品DNA滿足建庫要求。

1.4 Illumina HiSeq測序及產出數據的質量分析

1.4.1 設計酶切方案

根據菱基因組大小及 GC 含量等信息,使用Hae Ⅲ+HinC Ⅱ酶切,酶切片段長度在364～464的序列定義為SLAF標簽。

1.4.2 酶切片段測序分析

對得到的每一個樣本基因組的酶切片段(SLAF標簽)進行3簽端加A處理、連接Dual-index測序接頭[22]、PCR擴增、純化、混樣、切膠選取目的片段,文庫質檢合格后用Illumina平臺IlluminaCasava 1.8進行測序。

1.5 SLAF 標簽和SNP標記的開發

利用Dual-index對測序得到的原始數據進行識別,得到各個樣品的reads。過濾測序reads的接頭后,進行測序質量和數據量的評估。測序產生的reads來源于同一限制性內切酶對不同樣品作用產生的長度相同的酶切片段,根據序列相似性將各樣品的reads進行聚類,聚類到一起的reads來源于一個SLAF片段(SLAF標簽)。同一SLAF標簽在不同樣品間的序列相似度遠高于不同SLAF標簽間的相似度;一個SLAF標簽在不同樣品間序列有差異(即有多態性),即可定義為多態性SLAF標簽。

SNP標記的開發是以每個SLAF標簽中深度最高的序列類型作為參考序列,利用BWA[23]將測序reads比對到參考基因組上,并使用GATK[24]和Samtools[25]兩種方法開發SNP,以兩種方法得到的SNP標記交集作為最終可靠的SNP標記數據集。

1.6 群體遺傳分析

針對篩選的SNP對測序樣本主要進行系統發育樹以及群體遺傳多樣性分析,使用MEGA X[26]和Admixture軟件[27]軟件,對群體進行系統發育樹和遺傳結構分析。

2 結果與分析

2.1 測序數據統計與評估

本實驗中HaeⅢ+HinC Ⅱ對菱基因組的酶切效率為90.59%。為保證分析質量,采用讀長126×2作為后續的數據評估和分析數據。共獲得菱reads數54.34 Mb,測序平均Q30為91.68%,平均GC含量為41.32%。所測序列的Q30數據較高,說明堿基出錯率很低,測序結果可靠(表2)。

表2 菱各材料測序數據統計表Table 2 Reads statistics of Trapa L.

2.2 SLAF標簽與SNP標記的鑒定

本研究在18個菱材料中共開發獲得445 594個SLAF標簽,標簽的平均測序深度為14.10×,鑒定到多態性SLAF標簽有95 931個(表3)。以每個SLAF標簽中深度最高的序列類型作為參考序列進行SNP標記的開發,得到的SNP標記交集作為最終可靠的SNP標記數據集,共獲得269 338個SNP標記(表4)。

表3 菱各材料的SLAF標簽統計Table 3 SLAF label statistics of Trapa L.

表4 菱各材料的SNP信息統計Table 4 SNP statistics of Trapa L.

2.3 遺傳進化分析

基于過濾后得到的269 338個SNP,運用統計學方法,對18份菱完成系統進化樹、群體結構,從基因組水平揭示不同個體菱的遺傳分化關系。

2.3.1 系統發育分析

從系統發育樹中可以看出(圖1),18種菱可以劃分為3個大類群:其中邵伯菱、南湖紅菱、無角青菱、南湖菱和南湖菱提純在大類群1;環菱1、環菱2、環菱3、野菱、蘇州青菱、兩角紅菱、兩角青菱、水果紅菱在大類群2;金華青菱、紹興水紅菱2、駝背白菱、嘉興水紅菱、紹興水紅菱1 在大類群3;同一大類群的菱品種之間有更近的親緣關系。在大類群1中,南湖紅菱、無角青菱在遺傳發育樹上的距離更短,親緣關系更近;南湖菱和南湖菱提純親緣關系更近。在大類群2中,環菱1、環菱3和環菱2的親緣關系更近,環菱2與環菱3的親緣關系又近于環菱1;野菱、蘇州青菱、兩角紅菱、兩角青菱、水果紅菱的親緣關系更近。在大類群3中,紹興水紅菱2 與駝背白菱的親緣關系更近,嘉興水紅菱和紹興水紅菱1 的親緣關系更近。以蘇州青菱與野菱的親緣關系最近,而南湖菱、南湖紅菱、無角青菱、水紅菱、駝背白菱等與野菱親緣關系最遠。因此,認為蘇州青菱在進化上比較原始,而南湖菱等無角菱、水紅菱等大果類型的四角菱進化程度更高。

圖1 十八個菱材料系統進化樹Fig.1 Evolutionary tree of 18 Trapa L. samples

2.3.2 遺傳結構分析

基于篩選的有效SNP,通過Admixture軟件[27],分析樣品的群體結構,分別假設樣品的分群數(K值)為1～9,進行聚類。并對聚類結果進行交叉驗證,根據交叉驗證錯誤率的谷值(最低值)確定最優分群數。K值為1～9的聚類情況及各個K值對應的交叉驗證錯誤率見圖2。由圖2-A可知,K=7時,交叉驗證錯誤率最小,因此將18個樣品分為7組。根據K=7時的結構圖,同一類群用同種顏色表示,同一樣本若具有不同顏色,則歸到占比顏色最多的一組,詳細見圖2-B。

A, Admixture各個K值交叉驗證錯誤率;B, Admixture各個K值對應的樣品聚類結果。紅框中為K=7的聚類結果圖。A, Admixture of each K value cross validation error rate; B, Admixture of each K value corresponding sample clustering results. The red box is the clustering result graph with K=7.圖2 十八個菱材料的遺傳結構分析結果Fig.2 Genetic structure analysis of Trapa L. samples

交叉遺傳錯誤率最低值出現在K=7時,因此可以將18份材料按照表5分為Q1～Q7一共7個組,理論上同一組的樣本有共同祖先。Q1:蘇州青菱、兩角紅菱;Q2:南湖菱、南湖菱提純、邵伯菱;Q3:兩角青菱、水果紅菱;Q4:金華青菱、紹興水紅菱1、嘉興水紅菱、駝背白菱、紹興水紅菱2 ;Q5:環菱1、環菱2、環菱3;Q6:無角青菱、南湖紅菱;Q7:野菱。

表5 菱材料遺傳結構分群表Table 5 The table of the groups of Trapa L. samples classified by genetic structure

2.3.3 遺傳多樣性分析

遺傳多樣性分析結果顯示,次要等位基因頻率為0.354 9,期望等位基因數為1.805 9,與觀測等位基因數(2.000 0)較為接近,表明等位基因在群體當中分布均勻;多樣性指數為0.455,多態標記數為6 368,觀測等位基因數為2;期望雜合度(0.441 5)高于觀測雜合度(0.134 5),說明雜合個體較少,群體雜合度較低;多態性信息含量近0.342 7,香農維納指數小于3,僅有0.632 4,說明本試驗中的18個菱材料,其群體遺傳變異不豐富。

3 討論

水生蔬菜是江浙一帶重要的特色經濟作物,素有“水八仙”之稱,而菱是其中最有特色的一個種類,在江浙一帶有著廣泛的分布和栽培。作為重要的蔬菜作物,菱在各個地方通過長期的演化形成了一些極具地方特色的栽培品種[6-7],比如嘉興的南湖菱[9]、揚州的邵伯菱、太湖的水紅菱、紹興的駝背白菱,形成了當地著名的特色農產品。但近年來,菱栽培面積特別是傳統外河湖蕩種植面積大幅度下降,品種混雜退化嚴重,例如,南湖菱這種無角的、特異性狀明顯的菱品種,出現了不同程度的長角現象[28],另有一些地方品種如駝背白菱存在著消失的風險,地方特色菱種質資源的保護已刻不容緩。種質資源保護的前提是對種質資源進行鑒定,目前菱不同品種之間親緣關系遠近及遺傳多樣性仍不明確,并且可能存在品種間的混雜現象。本研究通過SLAF-seq技術對江浙地區主要的菱栽培品種進行簡化基因組測序,基于過濾后得到的269 338個 SNP,運用統計學方法,對18份菱完成系統進化樹、群體結構分析,從基因組水平首次揭示了不同菱的遺傳關系,為了解菱的栽培演化提供了參考,也為菱品種的甄別及種質資源的鑒定保護提供了依據。

基于利用SLAF-seq技術獲得的SNP進行遺傳進化樹及遺傳結構分析來看,本試驗中的18個菱品種,其群體遺傳變異不豐富,說明本試驗用樣品雖然來源不同,但其之間親緣關系較近,這與保曙琳等[14]的研究結果一致。本研究可以較好地將大部分無角菱、四角菱、二角菱區分開來,也能將菱栽培種與野菱區分開來,但遺傳進化樹中將四個無角菱類型品種與四角的邵伯菱分在一起,而將野菱與四角的蘇州青菱與幾個二角菱品種和烏菱分在一類,這與胡仁勇等[11]研究中9個栽培居群以菱果角的個數分成3大類有明顯不同,這說明單純的以形態學性狀為依據進行菱栽培種的分類和親緣關系認定存在著一定的局限性。同時遺傳進化樹顯示,南湖菱以及以南湖菱為親本選育的無角類型品種與四角的邵伯菱親緣關系最近,進一步佐證了丁炳揚等[10,12]、胡仁勇等[11]提出的南湖菱與四角菱關系更加密切的觀點。

綜上,本論文從基因組的角度揭示了菱主要栽培品種之間的親緣關系均較近,品種間親緣關系與菱果的形狀、顏色等果實性狀無顯著相關,南湖菱等無角菱品種與四角菱栽培種之間的親緣關系更加密切。同時,從基因組信息角度驗證了菱栽培種的演化可能是從四角野生菱資源同時向二角類型和大果型四角菱演化的過程,而無角菱栽培種是直接由四角菱演化而來。本實驗結果為后續研究菱主要栽培品種的演化過程以及開展地方特色菱種質資源保護利用提供了理論依據。