濃香型白酒釀造過程中酒醅微生物區系變化特征分析

陳 進，陳 萍，譚光迅，楊 博，龔大春，4

（1.湖北省生物酵素工程技術研究中心(三峽大學)，湖北宜昌 430072；2.湖北稻花香酒業股份有限公司，湖北宜昌 443112；3.三峽大學生物與制藥學院，湖北宜昌 443002；4.中國輕工業功能酵母重點實驗室(三峽大學)，湖北宜昌 430072）

中國白酒作為世界六大蒸餾酒之一，廣受世界人民的喜愛。根據主體香型的不同，中國白酒大體上可分為三大類：濃香型、醬香型和清香型。濃香型白酒以其“窖香濃郁、綿甜爽凈、香味協調、余味悠長”的特點深受消費者喜愛[1]。濃香型白酒的生產以泥窖窖池為基礎，發酵過程是棲息在窖池糟醅、窖泥中的龐大微生物區系在糟醅固、液、氣三相界面的復雜的物質能量代謝過程[2]，以富含淀粉的糧谷類為原料，以酒曲為糖化劑，采用續糟拌和、混蒸混燒、涼醅下曲、分層分批入窖、固態發酵、蒸餾出酒、精心勾兌等工藝進行生產[3]。濃香型白酒的釀造過程是傳統的封閉式固態發酵，復雜的微生物群落除了受到環境微生物、原料、環境溫度、環境濕度等外源因素的影響，還受到群落自身演替、代謝產物變化、生物熱變化、含水量變化等內源發酵條件的影響。目前國內主要對濃香型白酒的酒曲、窖泥以及短期發酵過程的微生物菌群進行了跟蹤研究，對于長期的窖池發酵以及空間上菌群的結構差異研究不足。

對發酵過程中窖池內微生物區系變化特征的研究就是對在窖池環境下微生物生態學的研究。微生物生態學的研究內容包括確定微生物的數量、群體結構和活性，對于保護和改善生態環境、構建人工生態系統、提高廢水生物處理的效率有著重要的科學意義和實用價值[4]。傳統的微生物鑒定方法操作簡單，可以直接獲取目標微生物，一直沿用至今。自然界中超過99%的微生物都是不可直接培養的，絕大多數微生物不能通過純培養的方式獲得。傳統分離培養的方法工作量大，不能完整反映微生物復雜的群落組成[5]。施安輝[6]采用稀釋平板涂布的方法，發現了酒醅中的細菌、酵母菌和霉菌的數量變化特征；吳衍庸等[7]考查了窖池中不同位置窖泥中六大類厭氧菌（甲烷菌、梭狀芽孢桿菌屬、乳酸菌、硫酸鹽還原菌、硝酸鹽還原菌及厭氧異氧菌）的差異性；岳元媛等[8]采用厭氧培養方法對窖泥中的細菌進行篩選分離，共篩選到8 個屬的細菌，絕大多數為兼性厭氧細菌，梭菌屬細菌僅占1%左右，這與采用未培養技術得到的結果大相徑庭，采用傳統培養技術對環境微生態的研究不足以全面準確的發現微生物的菌群結構和演替特征。隨著科學的進步，分子生物學手段逐漸進入了生態學研究的視野并成為生態學研究的重要技術，“高通量測序技術（High-Throughput Sequencing）”以其測序量大、靈敏、高速、高信息量、低成本等特點成為微生態學研究中應用的熱門技術[9]。高通量測序技術是對第一代測序技術的一次技術革新，可以同時對千萬條DNA 序列進行測序，所以高通量測序技術也被稱為“第二代測序技術”“下一代測序技術（Next Generation Sequencing，NGS）”和“深度測序”[10]。高通量測序為研究人員和科學家提供了一種革命性的工具，可以快速、經濟地獲取DNA 序列。與傳統的Sanger 測序相比，使用高通量測序獲得的每單位DNA 序列（即堿基對）顯著更具成本和時間效益。雷振河[11]應用高通量測序技術對清香型白酒釀造用大曲和酒醅中微生物構成進行了分析，發現大曲中優勢真核微生物主要包括曲霉菌屬、熱子囊菌屬、根霉菌屬、嗜熱真菌屬、假絲酵母，醋酸桿菌科和乳桿菌科是清香型發酵酒醅中優勢原核微生物，占原核微生物70%以上；鄧杰等[12]利用高通量測序技術研究濃香型白酒窖池窖泥微生物群落結構，發現Clostridiales Family XⅠ.Incertae Sedis 隨著窖齡的增加呈現減少的趨勢，Actinobacteria 類群和Synergistetes 類群隨著窖齡的增加呈現增加的趨勢，Haloplasmataceae 類群和Clostridiaceae類群只在30 年窖齡的窖池中有檢測出，Lactobacillaceae類群和Porphyromonadaceae類群只在30年窖齡的一口窖池中是優勢細菌類群；李欣等[13]通過高通量測序技術對醬香型白酒福矛窖酒發酵的不同時期酒醅微生物進行多樣性分析，發現堆積發酵酒醅的優勢微生物為乳球菌屬、醋酸桿菌屬、芽孢桿菌屬、梭形桿菌屬、假絲酵母屬、曲霉屬，窖內發酵酒醅的優勢微生物為乳桿菌屬、醋酸桿菌屬、青霉菌屬、畢赤酵母屬、曲霉屬、嗜熱子囊菌屬、假絲酵母屬；李斌等[14]基于Illumina Miseq 測序方法研究了濃香型白酒中高溫酒曲和芝麻香型白酒高溫酒曲的微生物菌群結構，結果表明濃香型白酒中高溫酒曲的優勢類群主要有9個屬，包括乳桿菌屬（Lactobacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）和片球菌屬（Pediococcus）等，芝麻香型白酒高溫酒曲的優勢類群主要有芽孢桿菌屬（Bacillus）和別樣芽孢桿菌屬（Allobacillus）；栗連會等[15]利用16S rRNA基因高通量測序技術比較了大曲、酒醅和窖泥中的乳酸菌群落結構，并解析了酒醅乳酸菌在發酵過程中的動態變化，結果表明，發酵過程酒醅中存在49 種乳酸菌，其中16 種來源于大曲，3 種來源于窖泥，酒醅乳酸菌群落結構在發酵的第一周出現劇烈變動，發酵2 d 后Lactobacillus acetotolerans取代Weissella confusa成為優勢微生物并保持至發酵結束。

本研究擬利用高通量測序技術，探究發酵過程中微生物結構以及主要的功能微生物，結合環境因子，分析其對濃香型白酒發酵過程微生態結構的影響。了解濃香型白酒釀造過程中微生物資源狀況，進一步認識其生態功能，加強對窖池微生物資源的利用。有利于改善白酒的生產工藝，為進一步提高濃香型白酒的品質、人工改造窖池微生物菌群等提供生物學依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑

樣品：取樣于湖北某酒廠生產一車間中的某一窖池，選取發酵1 d、3 d、9 d、15 d、30 d、70 d、90 d為發酵節點，采用四點取樣法對窖池四個角共取30 g左右樣品混合，分別取窖池每個節點的上層（距離窖頂40 cm）、中層（距離窖頂1 m）、底層（距離窖底40 cm）三層糟醅的樣品，共計21 個樣本（樣本編號見表1）。混合均勻后分成兩份樣品，一份-20 ℃保存并及時進行酒醅微生物基因組DNA 提取，另一份進行理化性質和有機酸含量檢測。

表1 糟醅樣品編號

試劑及耗材：葡萄糖、3,5-二硝基水楊酸、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、重蒸苯酚、亞硫酸鈉、四氫呋喃、乙酸乙酯、乙醇、乙酸、丁酸、己酸、乳酸（均為分析純），天津科密歐化學試劑有限公司；Fast DNATMSPIN Kit for Soil，美國MP Βiomedicals公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 酒醅相對酸度的測定

取5 g 酒醅，加入45 mL 蒸餾水，置于漩渦振蕩器上混合均勻。靜置5 min，測定上清液pH值。

1.2.2 酒醅還原糖的測定

采用3,5-二硝基水楊酸(簡稱DNS)—分光光度計法于540 nm 波長處測定。樣品預處理：取酒醅樣品1.0 g 于25 mL 比色管中，加入10 mL 蒸餾水100 ℃水浴20 min，冷卻后，取上清液1 mL 于1.5 mL EP管中8000 r/min離心10 min取上清液。

1.2.3 高通量測序與數據分析

高通量測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。高通量測序針對細菌16S rRNA 基因V3～V4 區域，擴增引物為338F(5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3')和806R (5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3') 。測序平臺為Illumina MiSeq。去掉Βarcode 序列和引物序列，得到有效的序列文件，在此基礎上對測序數據的質量進行控制，去掉測序質量不好的序列，保留測序長度大于400 bp 的序列，并去除嵌合體序列，得到合格的有效數據。使用Usearch 將序列按照97 %相似度聚類，進 行OTU(operational taxonomic units，操作分類單元) 劃分，提取代表序列，得到OTU 表。將細菌利用Mothur 方法與SILVA 的SSU rRNA 數據庫進行物種注釋分析。使用Mothur 軟件計算樣品的Chao1、Ace、Shannon、Simpson 和Goods-coverage指數。

1.2.4 數據分析

酒醅理化指標的試驗結果用平均值±標準差表示；利用R 語言（3.6.3 版本）進行物種多樣性聚類分析和相關性分析。

2 結果與分析

2.1 發酵過程中酒醅pH值、還原糖的變化規律

濃香型白酒發酵過程中pH 值、還原糖的變化如圖1 所示。三層糟醅的pH 值呈先上升后下降的趨勢，0～9 d，酒醅pH 值由4.80 下降至3.30 左右，中層下降幅度大；9～90 d，pH 值總體呈上升趨勢，上升幅度較小。三層糟醅還原糖含量總體呈下降趨勢，由發酵初始的100 mg/g 干糟醅下降到10 mg/g干糟醅。

圖1 糟醅理化指標(pH值及還原糖)發酵變化

2.2 酒醅細菌群落α-多樣性分析

本研究利用高通量測序技術對濃香型白酒發酵過程酒醅中細菌群落結構進行分析。21 個樣品測序深度為54428～84789 條，經過對測序獲得數據的拼接和過濾處理，21 個樣品平均每個樣品有54049 條有效序列，613 個OTU。每個樣品中有效序列數為148～91317，OTU 數量在26～1058 之間，每個樣品有效序列的覆蓋率為98.8 %～99.8 %，表明基于有效序列的α-及β-多樣性分析能較好地反映酒醅微生物群落信息。

通過α-多樣性分析可知，Chao1 指數在89.33～1618.53 之間，Ace 指數在155.69～2237.38，Shannon 指數在0.26～3.28 之間，Simpson 指數在0.09～0.93 之間。從原核微生物群落演替性來看（圖2），隨著發酵的進行，Chao1 和Ace 指數表征菌群的豐富度（richness），Chao1 和Ace 指數越大，菌群的豐富度越高。兩個指數總體上呈先上升后下降的趨勢，表明糟醅中的原核微生物豐富度先升高后降低，可能是窖泥和環境中的原核微生物菌群在糟醅中大量生長繁殖，后期因窖池環境惡化導致原核微生物菌群多樣性降低。底層糟醅在90 d 時原核微生物豐富度有明顯的下降，底層有機酸大量聚集，較上層和中層酸度和滲透壓更低。Shannon 及Simpson 指數表征物種的均勻度，Shannon 指數越高、Simpson指數越小，菌群的均勻度越高。這兩個指數的變化趨勢在時間上波動性較大，在空間上也有明顯的區別，表明菌群的均勻度變化較大。將這幾個指標與發酵時間做差異性分析，Chao1、Ace 和Shannon 指數與發酵時間的差異性指數為0.017、0.016、0.046、0.162，均小于0.05，表明不同發酵時間，菌群多樣性有顯著性差異。不同層糟醅指數的差異性均大于0.05，表明在空間上，不同層糟醅的多樣性不存在顯著差異。

圖2 糟醅發酵過程中CHAO1、ACE、SHANNON及SIMPSON多樣性指數分析

2.3 糟醅細菌群落組成

根據高通量測序分析結果，選取在屬分類水平上相對豐度排名前十的菌屬，生成物種相對豐度分布柱狀圖，見圖3。10 個優勢菌分別為乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、醋酸桿菌屬（Acetobacter）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、Sphingopyxis、Rummeliibacillus、魏斯氏菌屬（Weissella）、片球菌屬（Pediococcus）、根瘤菌（Rhizobium）。發酵初始菌群與其他發酵節點菌群有較大差異，主要有乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus），在三層糟醅中平均占比分別為19.11 %、17.16 %、12.84 %、9.95 %。發酵第3 天，醋酸桿菌屬（Acetobacter）占比較大，大約為52.74%，在1～3 d 大量增殖后豐度逐漸降低，發酵30 d 時豐度小于1%。醋酸桿菌是好氧菌，1～3 d 內窖池內存在一定量的溶解氧含量，豐度迅速升高，隨后溶解氧含量降低，其豐度逐漸下降。乳酸桿菌屬（Lactobacillus）在發酵1～30 d 豐度急劇升高，由19.11 %上升到96.42 %，70～90 d 乳酸桿菌屬（Lactobacillus）相對豐度有所下降，仍占較高優勢。乳酸桿菌是兼性厭氧菌，在氧氣含量較低時也能生長繁殖。醋酸桿菌的主要發酵產物是醋酸，是丁酸、己酸生成的前體物質，乳酸菌的主要發酵產物有乳酸、乙醇、乙酸等，是乳酸乙酯和乙酸乙酯生成的前體物質，乳酸菌的產酸特性能維持窖池內的低pH 值環境，抑制雜菌的生長。因此，醋酸桿菌和乳酸桿菌對白酒釀造過程有重要影響，是各種風味產物形成的基礎。

圖3 在屬水平濃香型白酒糟醅細菌群落組成

2.4 酒醅細菌群落聚類分析

每個樣品中含量≥0.5%的屬定義為優勢屬并將其用于β 多樣性分析，以R 語言vegan 包計算Βray-Curtis 指數，繪制聚類樹圖。從圖4 可看出，21 個樣品可以聚類為3 簇，第一簇包含了1 d 和3 d的樣品，第二簇包含了9 d和15 d的樣品，第三簇包含了30 d、70 d 和90 d 的樣品。表明糟醅樣品可按發酵時間分為三個階段，即發酵前期（1～3 d）、發酵中期（3～15 d）、發酵后期（15～70 d）。PCA分析圖與聚類樹圖的結果一致。另外，在窖池不同層面上，同一發酵時間三層酒醅能夠聚類在一起，表明空間上菌群的差異較小且弱于時間的差異，中層與底層的菌群相似度更高，與上層糟醅菌群存在一定差異。Adonis 多因素方差分析結果顯示，上述分組對樣品差異的解釋度為0.60184，P 值為0.001，組間差異性顯著。充分說明濃香型白酒發酵每個階段的細菌菌群組成發生了明顯的變化，且將發酵過程分為3個發酵階段是合理的。

圖4 不同發酵時間及深度糟醅樣品Β多樣性分析聚類樹圖及PCA圖

2.5 細菌群落演替與環境因素變化的相關性

采用RDA 分析濃香型白酒發酵過程中細菌群落結構與11 個理化因子之間的關系，結果發現（圖5），前2 個排序軸分別解釋群落結構與理化因子變化率的82.45%和15.22%。還原糖與pH 值之間夾角為銳角，二者呈正相關性，且均與其他理化指標呈負相關性。還原糖、乙醇、含水量、乳酸、乳酸乙酯、乙酸乙酯和丁酸乙酯是對菌群結構影響較大的理化因子。RDA 結果還揭示了主要的細菌類群與理化因子的關系，具體而言，Bacillus、Pseudomonas、Staphylococcus、Weissella與pH值呈正相關，Lactobacillus與乙醇、含水量、丁酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯、己酸乙酯和乳酸呈正相關。

圖5 糟醅細菌菌群與環境因子的RDA分析

3 結論

本研究以濃香型白酒發酵過程中糟醅為研究對象，通過高通量測序技術探究了濃香型白酒發酵過程中的細菌多樣性。假單胞菌屬（Pseudomonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、醋酸桿菌屬（Acetobacter）為發酵前期的主要菌屬，在發酵前期（1～9 d），群落物種豐富，隨著發酵繼續進行，細菌群落組成發生顯著改變，最終乳酸桿菌屬成為相對優勢菌屬。對濃香型白酒發酵過程中的理化特性變化情況進行了分析，總體而言，隨著發酵的進行，pH 值和還原糖含量降低。由RDA 分析可知，糟醅中微生物的種群結構與糟醅的理化指標存在明顯關聯，且還原糖含量與微生物物種分布相關程度最大，乳酸桿菌屬對糟醅理化指標的影響較大。本研究探究了濃香型白酒糟醅在不同發酵階段中細菌群落及理化特性的變化規律及相互關系，有助于構建關于濃香型白酒糟醅微生物多樣性的系統認識體系，后續可通過分析發酵過程中微生物具體代謝途徑和機理探究其對糟醅及濃香型白酒的風味和品質的作用，以期為濃香型白酒工業化發展提供理論基礎。