綠豆黃酮超聲波輔助醇提及其在濃香型白酒中的感官特性研究

馮華芳，劉敏欣，舒邦金，楊 勇，劉青青，趙旭冬，劉小剛，溫 馨，蘭 余，李景明，曹曉念，2*

(1.瀘州老窖股份有限公司，四川瀘州 646000；2.國家固態釀造工程技術研究中心，四川瀘州 646000；3.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083)

綠豆（Vigna radiata(Linn.)Wilczek），又名青小豆，為豆科蝶花亞科豇豆屬一年生草本植物[1]，主要分布在熱帶、亞熱帶地區。綠豆是我國重要的糧食作物，在黃河流域、東北地區和長江中下游平原均有廣泛種植[2]。綠豆富含多種營養，具有清涼解毒、止瀉利尿、消腫下氣、消熱解暑等功效，是傳統的藥食同源原材料。相傳綠豆入酒始創于三國時期，最初是作為原料和其他谷物一同混合發酵，明代時出現以綠豆為香源物質的露酒[3]。整果直接浸泡有效成分溶出率低、且易帶來豆腥味，故對綠豆進行前處理，提取功能性成分后添加，可有效降低雜質帶來的不良風味。同時，對提取物的感官特性進行研究，以指導生產調配，提高綠豆在生產中的應用質效。

綠豆中含有豐富的營養物質和功能因子，以牡荊素和異牡荊素為代表的多酚類黃酮化合物被認為是主要的功能因子，具有抗氧化、抗炎、護肝等功能[4]。目前綠豆黃酮類化合物常見提取方法主要有熱浸提法[5]、溶劑萃取法[6]、加熱回流法、超聲輔助提取[7]等，超聲輔助提取因其耗時短、效率高、溫度低的優勢受到越來越多的關注。超聲輔助提取法利用超聲傳播時所產生的機械效應、空化效應和熱效應，可以縮短提取時間，降低操作難度并且增加提取率。目前超聲輔助提取已廣泛應用于多酚[8]、多糖[9-10]、多肽[11]等功能性成分的提取中，能較好的保留提取物功能性。本實驗選取超聲輔助提取方法對綠豆黃酮進行提取，具有技術可行性和安全性。

本試驗利用超聲輔助乙醇法提取，得到純度較高的綠豆黃酮提取物，并進一步將其應用到濃香型白酒酒基中，以探究其感官特征，明確其閾值、舒適閾和風味特性，對拓展綠豆黃酮在露酒中的添加和運用，具有較好的指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

材料：綠豆購買自贛州康瑞農產品有限公司；42 %vol 及52 %vol 濃香型白酒基酒由瀘州老窖養生酒業有限責任公司提供。

試劑及耗材：牡荊素標準品、異牡荊素標準品、乙酸（色譜級）、無水甲醇（色譜級），上海麥克林生化科技有限公司；食品級乙醇，河南鑫河陽酒精有限公司。

儀器設備：JCS-21 型分析天平（0.01 g），上海然浩電子有限公司；ME204E/02 型電子天平（0.0001 g），梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；KQ-500DE 型超聲清洗機，昆山市超聲儀器有限公司；ZX-S24 型數顯恒溫水浴鍋，上海知信實驗儀器技術有限公司；PTYC-1 型恒溫水浴震動搖床，常州普天儀器制造有限公司；R-100 型旋轉蒸發儀，瑞士步琦有限公司；CF16RXⅠⅠ型離心機；FD-1A-50型真空冷凍干燥機，北京博醫康實驗儀器有限公司；氣相色譜儀（Βruker GC456），德國布魯克公司；高效液相色譜儀（島津LC-20AT），島津企業管理（中國）有限公司；Venusil ASΒ C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm），天津博納艾杰爾科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 綠豆黃酮提取工藝

1.2.1.1 綠豆黃酮提取液的制備

工藝流程：整粒綠豆→去離子水浸泡10 h→超聲波輔助乙醇提取→取上清液→高效液相色譜法測定上清液中黃酮含量。

提取方法：準確稱取一定質量的綠豆，按照1∶6（g/mL）的料液比用去離子水浸泡10 h。準確稱量一定質量浸泡過的綠豆，按預設的料液比加入一定體積分數的乙醇溶液，充分混合后，進行超聲提取。提取結束后，取上清液，過0.22 μ m 的微孔濾膜，用高效液相色譜儀測定提取液中黃酮的含量（黃酮含量以牡荊素和異牡荊素的總和計）。

1.2.1.2 高效液相色譜法測定綠豆黃酮的含量

流動相：A-1 %乙酸水溶液，Β-甲醇；檢測波長：254 nm；洗脫條件：0～10 min，10～35 %Β；11～25 min，35～42 %Β；26～35 min，42～75%Β；36～40 min，75 %Β；41～45 min，75～10 %Β；46～50 min，10 %Β；進樣體積：10 μ L；流速：1 mL/min；柱溫：35 ℃。以牡荊素、異牡荊素標準品溶液進行綠豆黃酮組分鑒定，根據峰面積進行外標法定量[12]。

1.2.1.3 單因素實驗設計

分別以超聲功率（200 W、250 W、300 W、350 W、400 W、450 W、500 W）、超聲時間（10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min）、超聲溫度（30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃）、料液比（1∶4 g/mL、1∶6 g/mL、1∶8 g/mL、1∶10 g/mL、1∶12 g/mL、1∶14 g/mL、1∶16 g/mL）、乙醇體積分數（30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%）為影響因素，設置5個因素的不同水平，以確定相關因素對提取液中黃酮含量的影響。

1.2.1.4 響應面分析法對綠豆黃酮提取工藝的優化

在單因素試驗的基礎上，采用五因素三水平的中心組合試驗優化提取條件。試驗因素與水平設計見表1。

表1 中心組合試驗設計各因素的水平及編碼

1.2.1.5 綠豆黃酮提取液的純化

利用微濾和超濾對綠豆黃酮進行純化，濃縮凍干后得到綠豆黃酮提取物。

1.2.2 綠豆黃酮感官分析

1.2.2.1 感官品評員的訓練和篩選

通過發放電子調查問卷的方式初選60 名志愿者，年齡介于18～45 歲間，參照相關國家標準和感官培訓方法[13-15]，對志愿者味覺靈敏度進行測試，正確率小于80%的志愿者被淘汰。對合格的志愿者進行培訓，訓練內容包括差別檢驗、描述檢驗等，每次訓練時長為40 min，總時長不少于30 h。訓練結束后，考核候選人的味覺靈敏度和判別能力，根據最終考核結果和訓練時長對感官品評員進行篩選，共有30位評價員符合要求，組成感官品評小組。

1.2.2.2 綠豆黃酮提取物閾值與舒適范圍的測定

采用Scheffe 成對比較檢驗，測定綠豆黃酮提取物在水、42%vol濃香型白酒及52%vol濃香型白酒中的味覺閾值和舒適濃度范圍[16]。

1.2.2.3 綠豆提取物在白酒基中感官表現的測定

依據GΒ/T 33405—2016《白酒感官品評術語》[17]中的感官描述詞作為品評員參考術語，由專家品評小組對樣品感官特征描述詞進行篩選提煉，最終以澀感、苦味以及其他異味作為主要口感感官特征描述詞進行后續評價分析。

采用數字評估法[16，18]對感官強度進行評估，特征定量表達參考見表2。

表2 白酒感官強度定量評分標準

評價結果異常值判斷：按照三倍標準差法（3σ），計算多人品評結果的算術平均值（X）與標準差（s），品評結果中≥+3 s 或≤-3 s 的值視為異常值，予以刪除。

評價結果計算：將異常值予以刪除，正常值求平均值。

1.2.3 數據分析和繪圖

使用SPSS 23 進行顯著性差異分析，最低顯著水平p＜0.05；采用R4.1.2繪制圖片。

2 結果與分析

2.1 綠豆黃酮提取工藝

2.1.1 綠豆黃酮提取單因素實驗

以超聲功率、超聲時間、超聲溫度、料液比、乙醇體積分數為影響因素，探究各因素對提取液中黃酮含量的影響。

在200～350 W 范圍內，隨著超聲功率的增加，綠豆黃酮的提取量增加，超聲功率為350 W 時，綠豆黃酮的提取量最高，此時若繼續增加超聲功率，綠豆黃酮的提取效果下降。在350 W 條件下，提取液各分子動能增加，超聲波的空穴效應最強，使得黃酮的溶出速度加快，隨著超聲功率的繼續增大，黃酮提取量又有所下降，這可能是因為超聲功率過高，導致分子運動過于劇烈，加強了黃酮分子和其他成分之間的反應使黃酮遭到破壞，提取量下降[19]。故將350 W定為最佳超聲功率進行后續試驗。

圖1 各因素對綠豆黃酮提取量的影響

隨著超聲時間的延長，總黃酮的提取量呈現先升高后降低的趨勢，這體現了提取量隨時間延長的積累效應，過長時間的加熱提取也會使黃酮遭到破壞。在50 min時提取量最大，故將50 min作為最佳超聲時間。

隨著超聲溫度的逐步升高，提取液中黃酮含量逐漸增加，60 ℃時黃酮提取量最大，可能是隨著超聲溫度升高，分子動能增加、運動速度加快，滲透、擴散、溶解速度加快，使黃酮類化合物更易從細胞中轉移到溶劑中。當溫度繼續升高，黃酮提取量又開始下降，這可能與黃酮類化合物在高溫條件下被氧化破壞有關。因此，選擇超聲溫度為60 ℃進行后續試驗。

隨著料液比的增大，黃酮提取量不斷增加。但由于各組間結果并無顯著性差異，考慮到節約溶劑的原則，故選取1∶4（g/mL）為最佳料液比進行后續試驗。

當乙醇體積分數在30 %～80 %范圍時，各組對綠豆黃酮的提取量無顯著性差異，從節約溶劑的角度考慮，選取30 %體積分數的乙醇進行后續試驗。

2.1.2 響應面優化綠豆黃酮提取方法

運用Design-Expert 8.0.6 軟件，對綠豆總黃酮提取量的影響因素進行響應面分析，獲得綠豆總黃酮提取量（Y）對編碼自變量乙醇體積分數（A）、料液比（Β）、超聲功率（C）、超聲溫度（D）和超聲時間（E）的二次多項回歸方程：

對上述回歸模型方差分析結果如表3 所示，F檢驗顯示回歸模型具有較低的p 值（p＜0.05），說明模型較顯著。方程失擬項不顯著（P＞0.05），表明所建立的回歸二次模型可以用來分析和預測超聲波輔助乙醇提取綠豆黃酮的工藝條件。對回歸模型的系數評估及顯著性檢驗的結果表明一次項中Β 以及二次項對綠豆黃酮提取量具有顯著影響，但交互項均不顯著（P＜0.05）。

表3 多元回歸模型方差分析、回歸系數評估及其顯著性檢驗

根據所建立的模型進行參數最優化分析，得到綠豆黃酮超聲波輔助提取最佳工藝參數為：乙醇體積分數39.98%，料液比1∶3（g/mL），超聲功率300 W，超聲溫度70 ℃，超聲時間58.58 min，預測提取量為預測值1096.61 μ g/g。為方便實驗將參數修改為：乙醇體積分數40%，料液比1∶3（g/mL），超聲功率300 W，超聲溫度70 ℃，超聲時間59 min。按照上述條件進行超聲波輔助乙醇提取綠豆黃酮的驗證實驗，測得綠豆總黃酮提取量為1055.58 μ g/g，與預測值基本相符。表明該模型具有較好的預測性能，可用于指導生產實踐。

2.2 綠豆黃酮提取液的純化

利用微濾和超濾對綠豆黃酮進行純化，純化產物濃縮、凍干后作為綠豆黃酮提取物，純度為31.00%。

2.3 綠豆黃酮提取物在水中的閾值與舒適閾

采用Scheffe 成對比較檢驗并加以改進，測定綠豆黃酮提取物在水相中的覺察閾值和舒適度，結果如圖2所示。

圖2 水相中綠豆黃酮的感官特性

2.4 綠豆黃酮提取物在濃香型白酒中的閾值與舒適閾

采用Scheffe 成對比較檢驗并加以改進，測定綠豆黃酮提取物在42%vol 和52%vol 基酒中的覺察閾值和舒適度，結果如圖3所示。

圖3 綠豆黃酮在基酒中感官特性

由圖2 及圖3 可知，綠豆黃酮在水相、42 %vol濃香型白酒和52%vol濃香型白酒中的察覺閾值分別為25 mg/L、5 mg/L、2.5 mg/L。3 種基質中的可接受范圍分別＜100 mg/L、＜7.5 mg/L、＜5 mg/L。在低酒精（或無酒精）中，綠豆黃酮可接受的添加量更多、范圍更大。對葡萄酒等酒精飲料的研究表明，多酚類物質的苦味強度與其他物質的相互作用有關[20]，乙醇可增強多酚類物質苦味的強度和持續時間[21]。相關研究表明，低濃度（4 %～12 %）的乙醇可降低單寧與蛋白質的相互作用，但更高濃度的乙醇則會加劇原花青素和沒食子單寧的苦味[22]。大量感官實驗已證明，乙醇具有甜、苦、酸等多種味感，在高濃度下會伴隨灼燒、刺痛等三叉神經覺[23]。此外，酒精和黃酮類物質分別作用于不同苦味受體[24-26]，說明酒精對黃酮類物質苦味的增強作用可能既有味覺的疊加，又有受體的互作。同時，還有觀點認為黃酮的感官作用可能與其醇溶性有關[23]。關于乙醇和黃酮類物質的味覺互作機理還有待進一步開展研究。

2.5 綠豆黃酮提取物添加的感官特性分析

為了探究綠豆黃酮在白酒基質中的感官特性，結合相關文獻報道和專家品評員對酒樣進行感官特征描述，篩選澀味、苦味和其他異味3 個指標進行描述性感官分析。采用5 分制感官強度進行定量描述，以未添加樣品為對照，對1 mg/L（低劑量）、2.5 mg/L（中劑量）、5 mg/L（高劑量）添加量的樣品進行分析，結果如圖4所示。

圖4 綠豆黃酮在基酒中口感特性

感官分析發現，綠豆黃酮在基酒中主要表現苦味，除苦澀外其他異味不明顯，高酒度下澀感更強。在42%vol 濃香型白酒中，綠豆黃酮苦味表現突出，但在52%vol濃香型白酒中，苦味和澀感得分相近，說明更高濃度的乙醇會增強其澀感，這與前人報道相符[22]。42 %vol 濃香型白酒中，低劑量與中劑量味感差異不大，可能與其閾值有關。52%vol濃香型白酒中，低劑量與中劑量差異明顯，而中劑量與高劑量相差不大，說明此條件下舌面苦味受體已接近飽和。以上結果側面反映了前述分析中酒精度對可接受的添加量的影響。對比兩種基酒中的感官表現，發現同劑量下高酒度組的苦味均低于低酒度組，推測可能是由于乙醇鈍化了味感的產生。

綜上所述，綠豆黃酮在濃香型白酒中主要表現苦味和澀感，其他異味不顯著。酒精度可能對口感表現具有增強澀感和協同苦味作用。

3 小結與展望

本研究在單因素試驗的基礎上，通過響應面回歸分析，優化得到綠豆黃酮的超聲波輔助乙醇提取最佳工藝條件為：乙醇體積分數40 %，料液比1∶3（g/mL），超聲功率300 W，超聲溫度70 ℃，超聲時間59 min，在此條件下綠豆黃酮提取量可達1055.58 μ g/g。利用微濾和超濾對綠豆黃酮提取液進行純化，純化產物濃縮、凍干后作為綠豆黃酮提取物，純度為31.00%。

以濃香型白酒為基質，分析綠豆黃酮提取物在濃香型白酒中的感官特性，明確了其在不同基質中的閾值、舒適閾和感官特性，為綠豆黃酮在露酒中的應用提供了理論基礎，但針對其他香型酒基的感官特性和與酒精度的互作機理還需進一步探究。接下來的研究將圍繞綠豆黃酮的感官作用機理，針對性輔以其他原料，通過酒體設計手段改善綠豆黃酮在濃香型白酒體系中的感官表達，結合綠豆黃酮在露酒中的功效評價，優化綠豆黃酮使用量，進一步增加產品市場競爭力，形成更為顯著的經濟效益。同時，大量天然食藥材中均富含黃酮，本研究成果也可對從其他原料中提取到的黃酮物質在白酒中的感官特性研究提供一定研究思路及應用參考。