醬香型白酒不同輪次細菌資源結構多樣性的研究

李大鵬，牟明月，2*，朱治宇，焦 富，聶選亮，李方舟，胡宇佳，胡 旭，羅桂華，2

（1.貴州茅臺酒股份有限公司，貴州仁懷 564500；2.貴州省釀酒工程技術研究中心，貴州仁懷 564500）

醬香型白酒風味獨特，具有醬香突出、幽雅細膩、酒體醇厚、空杯留香持久等特點，其風味的形成與“三高”工藝、“多輪次發(fā)酵”、“長期陶壇貯存”等復雜的釀造工藝密切相關。醬香型白酒生產過程屬于開放式多菌種自然發(fā)酵，釀造微生物主要來源于大曲、晾堂、工用具、空氣等，攤晾和堆積發(fā)酵過程是自然網絡、篩選和富集微生物的主要環(huán)節(jié)，釀造微生物種類豐富，主要包括細菌、酵母、霉菌和放線菌等，細菌在醬香型白酒釀造過程中具有生香、產酶等作用，對特征風味物質的形成具有重要意義[1]。

為探索不同輪次細菌資源種類的差異性，本研究以生產用曲和晾堂為研究對象，選取氣溫較低的制酒一輪次和氣溫較高的制酒四輪次、五輪次，采用高通量測序技術，對生產用曲、晾堂中的細菌進行了深入探究，旨在揭示不同輪次晾堂地面和生產用大曲的細菌資源結構多樣性和差異性，為更好地指導生產提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 樣品

樣品采自貴州省仁懷市茅臺鎮(zhèn)某醬香型白酒生產公司，樣品采集后立即運回實驗室開展分析研究（24 h 內），實驗室留存樣品均放置于-20 ℃冰柜貯存。

晾堂地面樣品：在一個班組晾堂攤晾區(qū)域隨機選取20 個點，每個點面積為15 cm*15 cm，用無菌棉球擦拭地面收集微生物，所有棉球混合后作為該班晾堂地面樣品；每個輪次采集12 個晾堂樣品，制酒一輪、四輪、五輪次共計采集晾堂樣品36個。

生產用曲樣品：在制酒班組采集曲粉作為生產用大曲樣品；每個輪次采集2 個大曲樣品，制酒一輪、四輪、五輪次共計采集生產用曲樣品6個。

采樣時間：一輪次2021 年12 月，四輪次2022年5月，五輪次2022年6月。

1.1.2 試劑及耗材

PΒS 緩沖液、引物合成，廣東美格基因科技有限公司；E.Z.N.A.Soil DNA Kit 基因組DNA 提取試劑盒，Omega Βio-Tek 公司；TEA 緩沖液，北京索萊寶科技有限公司；HiPure Gel Pure DNA Mini Kit 凝膠回收試劑盒，Magen公司。

1.1.3 儀器設備

臺式高速冷凍離心機（Thermo Fisher Scientific），德國Sigma 公司；PCR 儀（AΒIGeneAmp?9700 型），美國AΒI公司；MiSeq 測序儀，美國Illumina 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品總DNA提取

使用E.Z.N.A.?soil DNA Kit 提取試劑盒進行基因組DNA 抽提后，利用NanoDrop One 檢測DNA的完整性、濃度和純度。

1.2.2 PCR擴增及產物電泳檢測

細菌PCR擴增引物：27F（5'-AGRGTTYGATYMTGGCTCAG-3'）和 1492R（5'-RGYTACCTTGTTACGACTT-3'）。

擴增程序：98 ℃預變性3 s，30 個循環(huán)（98 ℃變性10 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s），最后72 ℃延伸5 min。擴增體系包括5 μ L Primer-F（10 μ M）緩沖液、5 μ L Primer-R（10 μ M）緩沖液和2.5～50 ng DNA 模板等，每個樣本進行3 個重復，并將同一樣本的PCR產物混合。

1.2.3 PCR產物電泳檢測

用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產物的片段長度和濃度，主帶長度在正常范圍內的樣品可用于進一步實驗。

1.2.4 Pooling及切膠純化

利 用GeneTools Analysis Software（Version 4.03.05.0，SynGene）對PCR 產物進行濃度對比后，按照等質量原則計算各樣品所需體積，將各PCR產物進行混合。使用HiPure Gel Pure DNA Mini Kit凝膠回收試劑盒回收PCR 混合產物，TE 緩沖液洗脫回收目標DNA片段。

1.2.5 建庫及測序

細菌樣本按照16S Amplification SMRTbell?Library Preparation 標準流程進行建庫操作。使用PacΒio Sequel ⅠⅠ平臺對構建的擴增子文庫進行測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用WPS 2019 進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，Rversion3.6.1繪制Sankey Diagram、Venn、OTU Βubble Plot 和Upset Plot圖。

2 結果與分析

2.1 細菌門級多樣性分析

基于Illumina MiSeq 測序技術，對醬香型白酒一輪、四輪、五輪次制酒晾堂樣品和大曲中原核微生物的OTU 信息進行處理分析，運用軟件Rversion3.6.1 繪制Sankey Diagram 和Venn，見圖2（A、Β、C、D）。16S rRNA 高通量測序結果顯示，一輪次的細菌種群共10 個門，四輪次的細菌種群共15 個門，五輪次的細菌種群共19 個門，具體門級信息見表1。

如圖1 和表2 所示，厚壁菌門、放線菌門和變形菌門是醬香型白酒生產過程中的重要釀造微生物。厚壁菌門在3 個制酒輪次的細菌種類中均占比最高，在制酒一輪次最為顯著，厚壁菌門在自然界種類多、分布廣，是醬香型白酒生產過程中的常見菌。整體來看，3 個制酒輪次優(yōu)勢細菌門級具有較大的相似性，說明醬香型白酒釀造大環(huán)境中的微生物結構較為穩(wěn)定；不同輪次間細菌多樣性存在一定差異，醬香型白酒發(fā)酵周期長，且為多輪次、開放式固態(tài)發(fā)酵，使其擁有龐大而復雜的微生物體系，不同的微生物具有各異的生長代謝特點，影響著各輪次基酒的風格特征[2]，其中制酒四輪次和五輪次微生物多樣性和復雜程度高于制酒一輪次，制酒五輪次中放線菌門含量占比較高，該菌對醬香型白酒風味調控和有害雜菌的抑制具有一定作用[3]。

圖1 制酒晾堂采樣區(qū)域示意圖

2.2 制酒一輪次細菌屬多樣性分析

為更直觀地分析制酒一輪次樣品中相對豐度＞1 %的細菌屬分布情況，運用軟件Rversion3.6.1繪制了一輪次OTU Βubble Plot，如圖3所示。

圖3 一輪次制酒晾堂和大曲樣品中相對豐度＞1%OTU Βubble Plot

由圖3 可知，從制酒一輪次10 個細菌門級數(shù)據(jù)中共分離出122 個屬，其中晾堂地面樣品中相對豐度＞1%且至少在2 個樣品中的優(yōu)勢細菌分別是芽孢桿菌屬（Bacillus）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、片球菌屬（Pediococcus）、魏斯氏菌屬（Weissella）；大曲樣品中相對豐度＞1%的優(yōu)勢細菌分別是Bacillus、Lactobacillus、大洋芽孢桿菌屬（Oceanobacillus）、枝芽孢桿菌屬（Virgibacillus）。

研究發(fā)現(xiàn)，Lactobacillus在制酒一輪次制酒晾堂環(huán)境中具有絕對優(yōu)勢，與胡小霞等[4]的研究結論一致，堆積發(fā)酵初期酒醅中的細菌組成較為均衡，但隨著堆積時長的增加，Lactobacillus逐漸成為絕對優(yōu)勢細菌屬，說明堆積發(fā)酵過程中酒醅與晾堂環(huán)境交互作用顯著，Lactobacillus主要代謝乳酸、乙酸等有機酸[5]；Pediococcus和Weissella的豐度也較高，Pediococcus常用于發(fā)酵食品行業(yè)生產乳酸[6]，Weissella是醬香型白酒釀造的主要細菌之一，同時也是乳酸、乙酸等有機酸的主要產生菌，有機酸的積累降低了發(fā)酵環(huán)境的pH 值，抑制了致病菌和雜菌的生長，同時促進了霉菌的生長，提供了獨特的風味[7]。制酒一輪次晾堂乳酸菌總體豐度超90 %以上，酸類物質的大量產生和積累導致一輪次基酒酸度偏高，同時環(huán)境和酒醅pH 值偏低也會抑制其他微生物的正常生長和代謝[8]，造成堆積發(fā)酵來溫較慢，延長堆積發(fā)酵時間等。

2.3 制酒四輪次細菌屬多樣性分析

為更直觀地分析制酒四輪次樣品中相對豐度＞1 %的細菌屬分布情況，運用軟件Rversion3.6.1繪制四輪次OTU Βubble Plot，如圖4所示。

圖4 四輪次制酒晾堂和大曲樣品中相對豐度＞1%OTU Βubble Plot

由圖4 可知，從制酒四輪次15 個細菌門級數(shù)據(jù)中共分離出145 個屬，其中晾堂地面樣品中相對豐度＞1%且至少在2 個樣品中的優(yōu)勢細菌分別是葡萄球菌屬（Staphylococcus）、腸球菌屬（Enterococcus）、Lactobacillus、乳球菌屬（Lactococcus）、Pediococcus、Weissella；大曲樣品中相對豐度＞1 %的優(yōu)勢細菌分別是Bacillus、短桿菌屬（Brevibacterium）、腸桿菌屬（Enterobacter）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）、克羅彭斯特菌（Kroppenstedtia）、Lactococcus、泛菌屬（Pantoea）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、沙門氏菌屬（Salmonella）、鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacterium）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、Weissella。

研究發(fā)現(xiàn)，制酒四輪次晾堂環(huán)境細菌結構中Staphylococcus、Lactococcus、Enterococcus相對豐度顯著增加，Staphylococcus生長性能較強，且具有較強的酶解活性（脂、朊、肽等），常被利用于食品發(fā)酵行業(yè)，為發(fā)酵食品提供獨特的風味并保護食品質 量[9]；Enterococcus和Lactococcus具有較近的親緣關系，同屬于乳酸菌的主體[10]，在各類奶酪制品中應用廣泛。總體而言，制酒四輪次晾堂細菌以乳酸菌為主體結構，與黎瑤依[11]的研究結論基本一致，制酒四輪次窖內發(fā)酵酒醅中Enterococcus、Lactococcus、Lactobacillus等菌屬相對含量較高，且隨著發(fā)酵的進行Enterococcus和Lactococcus相對含量增加至65 %以上，說明醬香型白酒開放式堆積發(fā)酵使酒醅與空氣之間、酒醅與晾堂地面之間存在密切的交互作用，環(huán)境中微生物資源多樣性對于酒醅微生物結構具有重要影響。

2.4 制酒五輪次細菌屬多樣性分析

為更直觀分析制酒五輪次樣品中相對豐度＞1 %細菌屬的分布情況，運用軟件Rversion3.6.1 繪制五輪次OTU Βubble Plot，如圖5所示。

由圖5 可知，從制酒五輪次19 個細菌門級數(shù)據(jù)中共分離出227 個屬，其中晾堂地面樣品中相對豐度＞1%且至少在2 個樣品中的優(yōu)勢細菌分別是厭氧小桿菌屬（Anaerosalibacter）、Bacillus、棒狀桿菌（Corynebacterium_1）、Enterobacter、Kroppenstedtia、Lactobacillus、Lactococcus、Oceanobacillus、羅姆布茨菌屬（Romboutsia）、火山渣芽孢桿菌屬（Scopulibacillus）、Staphylococcus、Weissella、Virgibacillus；大曲樣品中相對豐度＞1%的優(yōu)勢細菌分別是Bacillus、Brevibacterium、Enterobacter、Klebsiella、Kroppenstedtia、Lactococcus、Pantoea、Pseudomonas、Salmonella、Scopulibacillus、Sphingobacterium、寡養(yǎng)單胞菌（Stenotrophomonas）、Staphylococcus、Weissella。

研究發(fā)現(xiàn)，制酒五輪次制酒晾堂微生物結構中Bacillus、Oceanobacillus、Scopulibacillus、Virgibacillus等芽孢桿菌屬相對豐度顯著增加，芽孢桿菌在醬香型白酒發(fā)酵過程中起著重要的增香作用，其中Oceanobacillus在醬香大曲和酒醅中均作為優(yōu)勢細菌屬被發(fā)現(xiàn)[12]；Virgibacillus具有較好的產酶、抗菌、殺線蟲效果[13]，同時也是火腿中的優(yōu)勢細菌屬[14]；Scopulibacillus是高溫大曲中的優(yōu)勢細菌屬[15]，具有較好的高溫發(fā)酵耐受性，能夠代謝產生大量吡嗪類、愈創(chuàng)木酚等風味物質，對醬香高溫大曲和酒體特征風味的形成具有重要意義；Kroppenstedtia屬于耐高溫放線菌，在醬香高溫大曲和清香型白酒中相對豐度較高，高溫放線菌具有豐富的酶系代謝系統(tǒng)，對白酒釀造過程具有重要促進作用[16]。總體而言，制酒五輪次晾堂細菌多樣性結構與一輪次、四輪次存在較大差異，五輪次細菌多樣性結構不再呈現(xiàn)乳酸菌“一家獨大”的現(xiàn)象，芽孢桿菌屬和耐高溫放線菌屬的相對豐度顯著增加，與郭松波等[8]的研究結論基本一致，芽孢桿菌受環(huán)境酸度的影響較大，環(huán)境或酒醅pH 偏低會抑制芽孢桿菌的正常生長和代謝，五輪次芽孢桿菌和耐高溫放線菌相對豐度的增加，賦予了酒體烘焙香、堅果香、焦糖香、煙熏味等獨特的風味體系[17]。

2.5 不同制酒輪次優(yōu)勢細菌屬差異性分析

為更直觀分析醬香白酒不同輪次晾堂地面和大曲樣品中優(yōu)勢細菌屬（相對豐度＞1%）的多樣性差異，運用軟件Rversion3.6.1 繪制3 個輪次優(yōu)勢細菌Upset Plot，如圖6所示。

圖6 制酒3個輪次晾堂地面和大曲優(yōu)勢細菌屬Upset Plot

由圖3—圖6 可知，醬香型白酒制酒晾堂地面和大曲樣品可分為3 個輪次6 大類，采用高通量測序技術和統(tǒng)計分析方法共篩選出23 種優(yōu)勢細菌屬，四輪次大曲和五輪次大曲的共有優(yōu)勢細菌屬最多，包括Bacillus、Weissella、Lactococcus、Brevibacterium、Enterobacter、Klebsiella、Kroppenstedtia、Pantoea、Pseudomonas、Salmonella、Sphingobacterium、Staphylococcus共12 種；五輪次大曲和五輪次制酒晾堂地面的共有優(yōu)勢細菌屬，包括Bacillus、Weissella、Lactococcus、Enterobacter、Kroppenstedtia、Staphylococcus、Scopulibacillus共7 種；一輪次大曲與四輪、五輪次大曲僅Bacillus是共有優(yōu)勢細菌屬。

綜上可知，醬香型白酒四輪、五輪次大曲優(yōu)勢細菌結構相似性較高，其中大部分優(yōu)勢細菌可能主要來自于制曲原料，一輪次大曲較四輪、五輪次優(yōu)勢細菌屬結構差異性顯著，說明醬香高溫大曲生產具有一定的輪次差異性，一輪次與四輪、五輪次制曲生產間隔4～5 個月，季節(jié)和氣候跨度較大，造成了大曲間優(yōu)勢細菌結構的差異性；五輪次大曲和制酒晾堂地面之間優(yōu)勢細菌結構相似性顯著增加，晾堂地面Enterobacter、Kroppenstedtia、Scopulibacillus等細菌相對豐度的提高，說明制酒五輪次生產所處的環(huán)境氣溫較高，對耐高溫細菌的抑制程度降低，且五輪次晾堂微生物多樣性也高于制酒一輪、四輪次；醬香型白酒生產過程中發(fā)現(xiàn)Weissella、Lactococcus、Lactobacillus和Pediococcus等4種主要產乳酸和乙酸的優(yōu)勢細菌，其中Lactobacillus和Pediococcus在制酒一輪次含量較高，在大曲樣品中含量較低，說明這兩種乳酸菌的最適生長條件隨溫度的升高而降低，Weissella和Lactococcus未受到顯著影響。

3 結論

本研究基于高通量測序技術和數(shù)理統(tǒng)計分析，系統(tǒng)地對醬香型白酒一輪次、四輪次和五輪次制酒晾堂和生產用大曲進行細菌資源結構多樣性研究。共檢出細菌門級種類，一輪次10 個門，四輪次15 個門，五輪次19 個門，明確了Proteobacteria、Firmicutes 和Actinobacteria 是3 個輪次中相對豐度＞1%的優(yōu)勢門。醬香白酒一輪、四輪、五輪次共分離出細菌122 個屬、145 個屬和227 個屬，明確了Bacillus、Lactobacillus、Pediococcus、Weissella是制酒一輪次晾堂地面主要優(yōu)勢細菌屬，Bacillus、Lactobacillus、Oceanobacillus、Virgibacillus是制酒一輪次大曲主要優(yōu)勢細菌屬；Staphylococcus、Enterococcus、Lactobacillus、Lactococcus、Pediococcus、Weissella是制酒四輪次晾堂地面主要優(yōu)勢細菌屬，Bacillus、Brevibacterium、Enterobacter、Klebsiella、Kroppenstedtia、Lactococcus、Pantoea、Pseudomonas、Salmonella、Sphingobacterium、Staphylococcus、Weissella是制酒四輪次大曲主要優(yōu)勢細菌屬；Anaerosalibacter、Bacillus、Corynebacterium、Enterobacter、Kroppenstedtia、Lactobacillus、Lactococcus、Oceanobacillus、Romboutsia、Scopulibacillus、Staphylococcus、Weissella、Virgibacillus是制酒五輪次晾堂地面主要優(yōu)勢細菌屬，Bacillus、Brevibacterium、Enterobacter、Klebsiella、Kroppenstedtia、Lactococcus、Pantoea、Pseudomonas、Salmonella、Scopulibacillus、Sphingobacterium、Stenotrophomonas、Staphylococcus、Weissella是制酒五輪次大曲主要優(yōu)勢細菌屬。

研究結果表明，醬香白酒一輪次晾堂地面Lactobacillus是絕對優(yōu)勢細菌屬，且乳酸菌總體豐度超90%以上；四輪次晾堂地面以乳酸菌為主體結構，Staphylococcus、Lactococcus、Enterococcus相對豐度顯著增加；五輪次晾堂地面Bacillus、Oceanobacillus、Scopulibacillus、Virgibacillus等芽孢桿菌屬相對豐度顯著增加，對酒體中烘焙香、堅果香、焦糖香、煙熏味等香味物質具有提升作用。五輪次晾堂地面細菌多樣性高于制酒一輪、四輪次，可能與五輪次生產環(huán)境氣溫較高，對耐高溫細菌的抑制程度降低有關。制酒四輪、五輪次大曲優(yōu)勢細菌結構相似性較高，但與一輪次大曲差異性顯著，說明醬香高溫大曲生產存在輪次差異性，一輪次與四、五輪次制曲生產間隔4～5 個月，季節(jié)和氣候跨度較大，造成了大曲間優(yōu)勢細菌結構的差異性。Weissella、Lactococcus、Lactobacillus 和Pediococcus 等4 種 主要產乳酸和乙酸的優(yōu)勢細菌最適生長條件同樣具有差異性，有待下一步驗證。