基于網絡藥理學研究復方精油治療頸肩痛的關鍵活性成分及透皮吸收性能

邱曉雨，金浩鑫，吳東，黃文平，曾文輝，龔建平,

1.江西中醫藥大學，江西 南昌 330004；2.江西中醫藥大學中藥固體制劑制造技術國家工程研究中心，江西 南昌 330006；3.江西省藥品檢查員中心，江西 南昌 330029

頸肩痛是指頸、肩、肩胛等處的疼痛，伴有一側或兩側上肢痛、頸脊髓損害癥狀等，主要源于頸椎病、肩周炎等疾病［1］。頸肩痛的治療方式包括手術治療和非手術治療［2］。大多數患者選擇非手術治療，主要分為藥物治療、推拿手法治療、針灸治療、牽引治療等［3-6］。目前暫無針對頸肩痛的特效藥，臨床上主要應用消炎鎮痛藥物如阿司匹林、布洛芬、雙氯芬酸等，此類藥物可有效鎮痛，但長期服用對胃腸道、心血管、神經系統、肝臟、腎臟等有不良反應［7］，且隨著疼痛加重服藥劑量也隨之增加。

芳香療法是一種替代療法，主要使用精油通過推拿按摩的方式進行治療，可緩解疲勞、疼痛等癥狀［8］。中藥精油的止痛作用近年來頗受關注，并展現出多種治療疼痛效果，如痛經、偏頭痛、頸椎痛等［9］，而精油多來源于具有活血化瘀、通經止痛等功效的中藥。精油治療頸肩痛多選用經皮給藥的給藥方式［10］。研究發現兩種或者多種不同中藥精油組合得到的復合中藥精油遞釋系統相較于單一中藥精油的生物活性可顯著增強［11］。

本實驗研究選取包括艾葉、沒藥、乳香、肉桂、干姜及冬青六種精油組成復方精油，文獻［12-14］報道上述六種精油主要含有成分為1,8-桉葉素（桉油精）、α-姜黃烯、蒎烯、D-莰烯、芳樟醇、肉桂醛等。而研究［15］表明頸肩痛的發病機制與外周敏化和中樞敏化有關，鉀離子、鈉離子、5-羥色胺、ATP 等炎性介質激活花生四烯酸通路引發痛敏反應，此外頸肩痛和神經源性炎癥也有關系［16］。“網絡藥理學”是一門運用網絡方法分析藥物與疾病和靶點之間“多成分、多靶點、多途徑”協同作用關系的藥理分析手段［17］。因此，本研究將以網絡藥理學探究對頸肩痛的作用成分及靶點，并結合氣相色譜-質譜（GC-MS）技術鑒定復方精油的化學成分，最后選取指標成分以Franz 擴散池法考察透皮吸收性能。以期探究復方精油治療頸肩痛的主要靶點和通路，為深入研究精油經皮給藥提供參考。

1 材料

1.1 動物

KM 小鼠，18～22 g，雌雄各半，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（湘）2022-0004。

1.2 藥材與試劑

艾葉（批號20211106）、乳香（批號20210405）、沒藥（批號20210504）、肉桂（批號20211009）、干姜（批號20211211）、冬青（批號20210608）藥材均購于江西一方藥業有限公司。乙酸乙酯（中國醫藥集團有限公司）；無水硫酸鈉（上海羅恩試劑有限公司）；甲醇（中國醫藥集團有限公司）。

對照品：桉油精對照品（批號110788-201506,含量98.4%），樟腦對照品（批號110747-201409,含量98.7%）購買于中國食品藥品研究院。龍腦對照品（批號DST210312-194,含量98.0%）購買于成都樂美天醫藥科技有限公司。

1.3 儀器

Agilent 7890B-7000D 三重四級桿氣相質譜儀，KDM 型控溫電熱套（山東鄄城華魯電熱儀器），Agilent 6890N 氣相色譜儀，TG328A 十萬分之一天平（北京賽多利斯儀器），TP-6 型智能透皮擴散儀及垂直式 Franz 型擴散池（天津精拓儀器科技），HC-3016R 高速冷凍離心機（安徽中科中佳科學儀器）。

2 方法與結果

2.1 揮發油的提取

參照2020 年版《中國藥典》通則2204 揮發油測定法提取，以得油量為指標單因素考察料液比、浸泡時間、蒸餾時間對提取量的影響，得到最佳提取工藝參數，見表1。

表1 藥材最佳提取工藝參數

2.2 復方精油的GC-MS 分析

2.2.1 色譜條件 氣相條件：分流模式，分流比為2∶1；載氣流速，1.0 mL/min；色譜柱，Agilent VF-WAXms 30 m×250 μL×0.5 μm；程序升溫，初始溫度40 ℃，保持2 min，以3 ℃/min 升溫至180 ℃，再以5 ℃/min 升溫至250 ℃，保持5 min；傳輸線溫度為260 ℃；進樣量為1 μL；載氣為氦氣。

質譜條件：Scan 全掃描模式；溶劑延遲：3.5 min；離子源溫度：230 ℃；電子能量：70 eV；掃描范圍：15～650 m/z。

2.2.2 GC-MS 分析 GC-MS 測定復方精油中的化學成分，總離子流見圖1。結合文獻資料解析，鑒定出化學成分75 個，占比最高的是桉油精、反式肉桂醛、丁香酚、芳樟醇、α-姜黃烯、莪術烯、樟腦、蒈烯、莰烯等。

圖1 復方精油的GC-MS總離子流圖

2.3 網絡藥理學探討

2.3.1 精油成分及頸肩痛靶點篩選 基于GC-MS定性成分和已發表的文獻報道，并通過TCMSP 數據庫、HERB 數據庫補充收集復方精油成分。基于精油的經皮給藥特點和里賓斯基五規則，ALogP是反映生物膜之間通透性的主要物理化學參數之一［18］，以1＜ALog P＜5 為指標，篩選精油的目標活性靶點。

以“Cervical Syndrome 頸椎綜合征”“Myalgia 肌痛”“Neck Pain 頸部疼痛”“Pain Syndrome Myofascial疼痛綜合征肌筋”“Shoulder Pain 肩部疼痛”為頸肩痛相關的疾病關鍵詞，通過挖掘GeneCards 數據庫、OMIM 數據庫、Drugbank 數據庫、DisGeNET 數據庫獲取頸肩痛的疾病靶點。

結果顯示篩選后活性成分共77 種，導入Uniprot蛋白質數據庫合并刪除重復值后共183 個化合物靶點和1 126 個疾病靶點。

2.3.2 中藥精油-成分-靶點網絡的構建 將藥物疾病交集靶點及成分輸入Cytoscape3.9.1 軟件得到網絡圖，見圖2。

圖2 中藥-活性成分-靶點網絡

2.3.3 中藥精油成分-頸肩痛疾病靶點PPI 網絡構建將成分靶點與疾病靶點做Veen 圖匯集得到共同靶點46 個，見圖3。導入STRING 數據庫，將生物種類設定為“Homo sapiens”，得到核心靶點，見圖4。

圖3 活性成分和疾病靶點的Venn圖

圖4 核心靶點

2.3.4 中藥精油-頸肩痛疾病靶點功能與通路的富集分析 在Metascape 的基因面板中導入關鍵靶點，物種限定設置為“Homo sapiens”，進行GO 富集分析和KEGG 信號通路富集分析。分析時設置P＜0.01，重疊值（Overlap）≥3，富集值（Enrichment）≥1.5。

分析獲得974 個GO 功能條目，選取排名前10的條目繪制GO 功能分析圖，見圖5。在生物過程（biological process，BP）中，涉及對異種刺激的反應，循環系統過程、血液循環、細胞對氮化合物的反應，對細胞外刺激的反應等；在細胞組分（cellular component，CC）中，涉及膜筏、膜微區、質膜筏、小窩突觸膜等；在分子功能（molecular function，MF）中，涉及G 蛋白偶聯胺受體活性、腎上腺素受體活性、金屬離子跨膜轉運蛋白活性、α1-腎上腺素能受體活性等。KEGG 通路富集分析得到化學致癌-受體激活、脂質和動脈粥樣硬化、5-羥色胺能突觸、神經活性配體-受體相互作用、cGMPPKG 信號通路、IL-17 信號通路、TRP 通道的炎癥介質調節、膽堿能突觸、花生四烯酸代謝、細胞色素P450 對異生素的代謝、cAMP 信號通路類風濕關節炎等相關信號通路，見圖6。

圖5 潛在靶點的GO富集分析

圖6 潛在靶點的KEGG通路富集分析

2.4 復方精油GC 含量測定

2.4.1 氣相色譜條件 采用HP-5（0.32 mm×30 m×0.25 μm）毛細管色譜柱，以氮氣為載氣，程序升溫，初始溫度為90 ℃，保持2 min；以5 ℃/min 上升到110 ℃；再以10 ℃/min 上升到150 ℃，保持10 min。檢測器溫度為250 ℃，進樣口溫度200 ℃，進樣量1 μL，分流比為5∶1。

2.4.2 方法學考察 專屬性考察：取空白溶劑、供試品透皮接收液和含桉油精157.792 μg/mL、樟腦479.68 μg/mL、龍腦468.48 μg/mL 的混合對照品溶液，按“2.4.1”色譜條件進樣檢測。結果如圖7 所示，空白溶劑沒有干擾測定。

圖7 色譜圖：A.空白溶劑，B.混合對照品溶液，C.供試品透皮接收液

線性考察：精密量取混合對照品溶液，加乙酸乙酯稀釋為系列質量濃度的溶液，分別按“2.4.1”項下色譜條件進樣分析。以質量濃度X為橫坐標，峰面積Y為縱坐標，進行線性回歸。結果表明，桉油精、樟腦、龍腦在表2 所示的質量濃度范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

表2 線性關系考察結果

精密度考察：取含樟腦479.68 μg/mL、龍腦468.48 μg/mL、桉油精157.792 μg/mL 的混合對照品溶液，按“2.4.1”項下色譜條件，平行進樣6 次，結果表明，桉油精、樟腦、龍腦峰面積的RSD 分別為1.20%、0.53%和0.87%，表明儀器精密度良好。

穩定性考察：取同一接收液樣品，按“2.4.1”色譜條件下分別于0、2、4、8、12、24 h 時進樣分析，結果顯示，桉油精、樟腦、龍腦的峰面積RSD分別為3.84%、1.78%、3.47%，表明樣品在24 h 內穩定。

2.5 體外透皮吸收考察

2.5.1 小鼠離體皮膚的制備 用脫毛膏除掉小鼠腹部體毛，小鼠處死后立即剪下腹部皮膚，將皮膚附帶的脂肪和皮下組織清理干凈，用生理鹽水小心清洗并擦干多余水分，再用錫箔紙包裹后放置-20 ℃冷凍保存，備用。

2.5.2 Franz 擴散池試驗 將轉子置于接收池中，量取15 mL 空白接收液（無水乙醇和生理鹽水以3∶7的比例混合，超聲10 min 即得）加入。將冷凍保存的小鼠離體皮膚放入生理鹽水中浸泡30 min，取出后用濾紙吸干水分，剪成適當大小，真皮層朝向接受池平鋪，夾緊固定且排盡氣泡。精密吸取1 mL復方精油樣品，置于鼠皮上并用封口膜將釋放池封閉，平行六組。

智能透皮試驗儀循環水浴溫度37.5 ℃，攪拌速度為300 r/min，預平衡30 min。在計時開始后的第1、2、4、6、8、10、12、24 h 精密吸取接收液1 mL，并補充1 mL 空白接收液。將所取的接收液4 ℃低溫離心20 min 后加入1 mL 乙酸乙酯萃取，靜置取上清液用0.22 μm 有機濾膜濾過，置于進樣小瓶中，按“2.4.1”項下色譜條件進樣分析，并計算指標成分桉油精、樟腦和龍腦的累積透過量Qn（μg/cm2）。計算公式為：

其中：Qn 為第n 個時間點單位面積的累積透過量（μg/cm2），Cn、Ci 分別為第n、i 個時間點測得的藥物質量濃度（μg/mL），V 為接收液加入體積（15 mL），Vi 為每次取樣體積（1 mL），A 為有效透皮面積（1.13 cm2）。

以累積透過量Qn為縱坐標，時間t為橫坐標作圖，結果見圖8。將數據分別用零級方程、一級方程、Higuchi 方程擬合［19］。結果顯示三種指標成分均符合零級方程和Higuchi 方程，表明復方精油具有緩控釋效果。

圖8 桉油精、樟腦、龍腦的累積透過量

對三種指標成分的Qn-t 曲線中的直線部分進行線性回歸，求出的直線斜率即為穩態透皮速率（Js）［20］。由表3 結果可知，桉油精、樟腦、龍腦在復方精油中的透皮速率分別為34.442、88.515、35.213 μg·cm-2·h-1。

表3 指標成分的滲透動力學參數

3 討論

精油具有高滲透性、代謝快、不滯留，毒性小，又易于透過血腦屏障的優點［21］，可廣泛適用于頸肩痛患者。中藥精油的止痛作用機制是通過多種途徑實現的，有研究表明芳樟醇可促進神經遞質抑制劑的增加起到調節中樞來達到緩解慢性疼痛的作用［22］，α-蒎烯能阻止NF-κB 炎癥通路的傳導和白細胞介素-6（IL-6），腫瘤壞死因子-α（TNF-α），一氧化氮NO 的釋放達到抗炎鎮痛的作用［23］；桉油精通過調節氧化應激和抑制誘導型一氧化氮合酶（iNOS）生成，從而減輕疼痛［24］；樟腦的鎮痛作用則其可能與作用于TRPV1 通道有關［25］。

通過GC-MS 分析與網絡藥理學預測結果所得的治療頸肩痛的關鍵活性成分基本重合。活性成分通過抑制5-羥色胺（5-HT）、γ-氨基丁酸（GABA）的釋放調節中樞神經以此鎮痛；抑制炎癥因子NO、IL-6、TNF-α 的合成釋放從而抗炎鎮痛；抑制環氧合酶-2（COX-2）的表達緩解疼痛。選取桉油精、樟腦和龍腦作為指標性成分，透皮試驗結果顯示釋放數據均符合零級動力學方程和Higuchi 方程，表明復方精油的體外透皮行為均具有緩釋作用。

綜上所述，復方精油通過多種成分和靶點相互調節治療頸肩痛的發作機制，且透皮吸收具有控緩釋效果。為進一步研究精油的止痛作用和劑型研究提供參考。