A型肉毒毒素輕鏈肽類抑制劑CPI-1衍生物的合成及解毒活性評價

徐書靜，沈錦濤，劉佳，黃悅，余碩，余云舟，孫黔云，戴秋云

（1.貴州醫科大學藥學院，貴州貴陽 550000；2.軍事科學院軍事醫學研究院生物工程研究所，北京 100071；3.貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室，貴州貴陽 550014）

A 型肉毒毒素（botulinum toxin A，BoNT/A）是目前已知毒性最強的生物毒素，由1 個輕鏈和1 個重鏈通過二硫鍵連接而成［1-2］。輕鏈為含鋅離子的肽鏈內切酶，可特異性切割神經蛋白SNAP-25，阻止乙酰膽堿釋放，導致中毒［2-4］。抗毒素治療是臨床上用于治療肉毒中毒的主要手段［5-6］，但其僅可中和血液或體液中的肉毒毒素，對已經進入神經細胞的毒素無效。開發輕鏈抑制劑是全面解決肉毒中毒問題的有效手段，目前已報道的輕鏈抑制劑主要有羥肟酸類［7-9］、喹啉類［10-11］、硒唑類［12］和多肽類［13-16］等，但均存在半衰期短、體內活性不佳等缺點。原因是BoNT/A 輕鏈極難降解，半衰期達數周［17］，而一般抑制劑半衰期僅數小時，難以達到解毒目的。目前，BoNT/A 輕鏈抑制劑的設計仍面臨很大挑戰。CPI-1（IC50=0.27 μmol·L-1）是近年來發現的一種活性最高的環肽類輕鏈抑制劑，由8 個氨基酸組成〔C（Dab）RWTKCL-NH2〕（Dab：L-2，4-二氨基丁酸）［16］。但該肽穩定性及體內活性不佳。為提高其抑制活性、進入細胞的能力及穩定性，本研究合成了CPI-1 衍生物，在CPI-1 的N 端或C 端引入不同性質的氨基酸或長鏈，測定其抑制BoNT/A 輕鏈活性、抗酶解穩定性及小鼠體內抗毒素毒性作用，以獲得活性更高、抗酶解穩定性更好的BoNT/A 輕鏈抑制劑。

1 材料與方法

1.1 試劑、儀器和動物

Rink 樹脂，天津南開合成有限公司；9-芴甲氧羰基（9-fluorenylmethyloxycarbonyl，Fmoc）保護氨基酸、苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯（O-benzotriazole-N，N，N′ ，N′-tetramethy l-uranium-hexafluorophosphate，HBTU）、羥基苯并三唑（1-hydroxybenzotrizole，HOBt），上海吉爾生化有限公司；辛酸（>98%），北京伊諾凱有限公司；月桂酸（≥99%）、肉豆蔻酸（99%）和軟脂酸（99%），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其他化學試劑，北京國藥有限公司。

LC424 為從BoNT/A 輕鏈中截取的一個片段，SNAPtide 來源于SNAP-25189-202，包含輕鏈識別位點Q197-R198，兩端分別標記有熒光基團FITC-1和淬滅基團Dabcyl。LC424 的表達及SNAPtide 的合成及純化按本實驗室前期文獻進行［18］。

多肽合成儀（Sophus），德國Zinsser Analytic公司；真空冷凍干燥機（Alphal-2），德國Christ 公司；高效液相色譜C18 分析柱（Agilent Eclipse Plus C18）、C18 純化柱（Agilent 10 Prep-C18）及高效液相色譜儀（Agilent 1260 Infinity Ⅱ、Agilent 1200 Series），美國安捷倫公司；半制備型高效液相色譜儀（Waters Delta Prep 4000、Waters 2489），美國Waters公司；多功能酶標儀（EnSpire?）和384孔黑板（OptiPlate-384F），美國鉑金埃爾默公司；質譜儀（MicrOTOF QⅡ），德國Bruker公司。

6～8周齡KM 小鼠，雌雄各半，體重18～20 g，購自北京斯貝福生物技術有限公司，實驗動物許可證編號：SCXK（京）2019-0010。KM 小鼠于室溫下潔凈環境中喂養，保證充足的食物及水源。動物實驗由軍事醫學研究院實驗動物倫理委員會審查批準，動物倫理審核編號2021068。

1.2 目標肽固相合成、色譜純化及鑒定

主要合成2 類CPI-1 衍生物：①在CPI-1 C 端引入亮氨酸（Leu）、色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）、精氨酸（Arg）、賴氨酸（Lys）和谷氨酸（Glu）等氨基酸修飾的非長鏈衍生物；②在CPI-1 C 端引入側鏈被硬脂酸修飾的Lys（在其序列中插入Leu或Gly作連接體），或是在CPI-1 N端引入辛酸、月桂酸、肉豆蔻酸及軟脂酸修飾的長鏈衍生物。具體合成方法見圖1，具體序列見表1。

Fig.1 Synthesis scheme of CPI-1 C-terminal and N-terminal derivatives modified by long chain carboxylic acids.A：synthesis of CPI-1 derivatives modified by long chain at C-terminus；B：synthesis of CPI-1 derivatives modified by long chain at Nterminus. X1 and X2 are 0，or L，G，respectively；Xn is fatty acids of different lengths. Fmoc：9-fluorenylmethyloxycarbony；Acm：acet?amidomethyl；Boc：t-butyloxycarbonyl；Pbf：2，2，4，6，7-pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl；tBu：tert-butyl；HOBt：1-hydroxy?benzotriaole；DMF：N，N-dimethylformamide；DTT：dithiothreitol；TFA：trifluoroacetic acid；Tip：triisopropylsilane.

Tab.1 Amino acid sequence of N-terminal and C-terminal derivatives of CPI-1 and inhibitory activity on botulinum toxin A light chain（LC424）

①非長鏈修飾的CPI-1 C 端衍生物的合成：首先在樹脂上固相合成肽-樹脂，采用裂解劑（88%三氟乙酸/5% H2O/5%二硫蘇糖醇/2%三異丙基硅烷）裂解后，線性肽空氣氧化折疊關環得到目標肽［19］。②C端用硬脂酸修飾的Lys修飾的CPI-1衍生物的合成（圖1A）：硬脂酸修飾的Lys 的合成參照文獻方法進行［20-21］。合成時將硬脂酸修飾的Lys偶合在序列C 端，并在其中插入Leu 或Gly 作為連接體。固相合成線性肽后，保留最后1 個氨基酸的N端Fmoc 保護基，加入5 倍摩爾量I2/、二甲基甲酰胺（DMF）溶液，使2 個半胱氨酸（Cys）在樹脂上氧化成環，后脫除Fmoc保護基，裂解得目標肽。③N端用長鏈羧酸修飾的CPI-1衍生物的合成（圖1B）：在樹脂上固相合成帶有Fmoc 保護基的CPI-1 線性肽，然后加入5 倍摩爾量的I2/DMF 溶液，使2 個Cys在樹脂上氧化成環，脫除Fmoc保護基，再分別偶聯辛酸、月桂酸、肉豆蔻酸、軟脂酸，裂解后得目標肽并經高效液相色譜純化。高分辨質譜法測定目標化合物的精確相對分子質量。

1.3 熒光共振能量轉移法測定目標肽對BoNT/A 輕鏈片段LC424的體外抑制活性

基于熒光共振轉移法，參照文獻及本實驗室方法［18，22］測定目標肽對BoNT/A輕鏈LC424的體外抑制活性。首先將多肽抑制劑配置成不同濃度梯度（水溶性較差多肽采用DMSO 溶解）溶液。設置陰性毒素組（工作液+SNAPtide）、陽性毒素組（工作液+LC424+SNAPtide）、實驗組（工作液+LC424+多肽+SNAPtide），每組3 復孔。然后按照工作液、LC424、多肽、SNAPtide（待LC424 與多肽孵育0.5 h 后加入）的順序加入384 孔板中，總體積為50 μL，37 ℃下檢測其熒光值變化。以523 nm 處熒光發射值對時間做圖，直線的斜率代表反應速率（v）。以不加多肽時的反應速率為v0，加入多肽后的反應速率為vi，抑制率=（1-vi/v0）×100%。采用Y=bottom+（top-bottom）/〔1+10^（logIC50-X）〕×Hill?Slope 方程擬合劑量曲線，top 指最大響應，Bottom指基線響應，Hill-Slope指曲線的斜率。

1.4 高效液相色譜法HPLC測定目標肽的胰蛋白酶酶解率

選取胰蛋白酶對CPI-1 及其部分衍生物的穩定性進行考察，具體操作步驟參考文獻［23］。將500 μL胰蛋白酶（200 μg·L-1）與500 μL多肽（500 μmol·L-1）混合，37 ℃孵育。每小時分別取樣100 μL，迅速加入100 μL 終止液（50 μL 乙腈，50 μL 去離子水），振蕩混勻，離心（12 210×g，10 min），取上清，采用已驗證的HPLC 方法進行分析，重復測量3 次。色譜條件：Agilent Eclipse Plus C18分析柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），流動相A 為含0.1% TFA 的去離子水，B為含0.1% TFA 的乙腈；梯度洗脫：0～1 min，5%B～10% B；1～25 min，10% B～50% B，25～31 min，50%B～95%B；流速：1 mL·min-1；檢測波長：214 nm。上樣量為100 μL。降解率（%）=（S0-St）/S0×100%（S0：0 min時樣品峰面積；St：tmin時樣品峰面積）。

1.5 小鼠體內目標肽對A型肉毒毒素毒性的影響

1.5.1 毒素與抑制劑混合實驗

將小鼠隨機分為毒素組、毒素+CPI-1 組和毒素+CPI-1 衍生物〔CPI-1-L（1），CPI-1-W（3），CPI-1-Y（4），CPI-1-R（5），CPI-1-K（6），CPI-1-K（stearic）GG（8），CPI-1-LK（stearic）GG（9），CPI-1-LGK（stearic）GG（10），C8-CPI-1（11），C12-CPI-1（12），C14-CPI-1（13）及C16-CPI-1（14）〕組，每組8或10只，雌雄各半。分別用生理鹽水、CPI-1、CPI-1 衍生物與BoNT/A 共孵育30 min 后ip 給予小鼠，每12 h 記錄1次小鼠存活數，觀察72 h內小鼠存活率。毒素劑量為每只2×LD50或2.5×LD50〔稀釋液（mmol·L-1）：4，KH2PO4；6，Na2HPO4·12H2O；100，NaCl；2‰明膠；pH=7.0〕，多肽抑制劑劑量為5 mg·kg-1（DMSO 或H2O溶），注射體積為200 μL。

1.5.2 解毒實驗

分組同1.5.1，每組10 只，雌雄各半。由于BoNT/A 中毒的平均潛伏期為數小時［4，24-25］，另考慮到救治時間方便性及多肽半衰期，注射BoNT/A 2和6 h后，分別ip給予生理鹽水、CPI-1及CPI-1衍生物〔CPI-1-L（1），CPI-1-LK（stearic）GG（8），CPI-1-LGK（stearic）GG（10），C12-CPI-1（12）和C16-CPI-1（14）〕進行解救，每12 h 記錄1 次小鼠存活數，觀察72 h 內小鼠存活率。BoNT/A 劑量為每只2×LD50，體積為20 μL，多肽給藥劑量為5 mg·kg-1，體積為200 μL。采用乘積極限法（Kaplan?Meier）繪制生存曲線。

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 目標肽的鑒定

典型多肽的HPLC 分析結果見圖2，經C18 柱純化后所有多肽純度均>95%。經質譜鑒定所有多肽相對分子質量與理論相對分子質量一致（表1）。

Fig.2 High performance liquid chromatography（HPLC）of typical CPI-1 derivatives. A：CPI-1-L（1）；B：CPI-1-R（5）；C：CPI-1-K（stearic acid）GG（9）；D：C12-CPI-1（12）. Analytical conditions：Agilent Eclipse plus C18（5 μm，4.6 mm×250 mm），mobile phase A and B were water containing 0.1% TFA and acetonitrile containing 0.1% TFA，respectively.Flow rate was 1.0 mL·min-1，λ=214 nm.Elution gradient for Fig. 2A and 2B：1-25 min，10% B-50% B；25-31 min，50% B-95% B；31-32 min，95% B-5% B；Elution gradient for Fig.2C and 2D：1-25 min，30% B-90% B；25-31 min，90% B-95% B，31-32 min，95% B-5% B.

2.2 目標肽對BoNT/A 輕鏈LC424 的體外抑制活性

多肽對BoNT/A 輕鏈LC424的抑制活性與劑量關系見圖3，IC50值見表1。與CPI-1相比，在C端引入疏水氨基酸Leu、Trp、Tyr 后，化合物抑制活性〔IC50=（0.06±0.01），（0.14±0.00）和（0.15±0.01）μmol·L-1〕較CPI-1〔IC50=（0.27±0.02）μmol·L-1〕［25］提高3.5～0.8倍（P<0.01），引入堿性氨基酸Arg和Lys后，抑制活性〔IC50=（0.15±0.01）和（0.24±0.05）μmol·L-1〕分別提高80.0%（P<0.01）及12.5%，但引入酸性氨基酸Glu 后抑制活性〔IC50=（1.26±0.28）μmol·L-1〕降低78.6%（P<0.01）。在C 端或N 端引入疏水性長鏈進行修飾后抑制活性（IC50>1.36 μmol·L-1）下降>80%（P<0.01）。

Fig.3 Inhibitory activity-dose curves of CPI-1 derivatives interacting with botulinum toxin A (BoNT/A) light chain LC424. See Tab.1 for the evaluated method of IC50. A：non long-chain CPI-1 derivatives；B：long-chain CPI-1 derivatives.

2.3 目標肽的胰蛋白酶穩定性

在胰蛋白酶100 μg·L-1作用下，CPI-1及部分典型衍生物降解率見圖4。結果表明，4 h 時CPI-1、CPI-1-GL 及CPI-1-W 降解率分別為（98.36±0.01）%、（98.00±0.02）%及（99.06±0.00）%，幾乎完全降解；C12-CPI-1 和CPI-1-K（stearic）GG 的降解率分別為（69.24±0.04）%和（50.90±0.01）%，與CPI-1 相比均顯著降低（P<0.01）。8 h 時C12-CPI-1和CPI-1-K（stearic）GG 的降解率分別為（82.56±0.02）%和（78.09±0.09）%，與CPI-1 相比，降解率顯著降低（P<0.05，P<0.01），表明其對胰蛋白酶的穩定性增強。

Fig.4 Trypsin degradation activity of CPI-1 and its typical derivatives. The mixture of trypsin（200 μg·L-1）and polypeptide inhibi?tors（500 μmol·L-1）was incubated at 37 ℃，and samples were taken every hour for HPLC detection. Analytical conditions：Agilent Eclipse plus C18（5 μm，4.6 mm×250 mm），the elution gradient in Fig.4A，4B and 4C was the same as Fig. 2A，the elution gradient in Fig. 4D and 4E was the same as in Fig.2C. A：CPI-1；B：CPI-1-GL；C：CPI-1-W；D：CPI-1-K（stearic）GG；E：C12-CPI-1；F：degrada?tion rate-time curves.±s，n=3.＊P<0.05，＊＊P<0.01,compared with CPI-1 group.

2.4 小鼠體內解毒活性

2.4.1 毒素與多肽抑制劑混合實驗

氨基酸修飾衍生物體內活性結果（圖5A～C）表明，2×LD50BoNT/A 與多肽共孵育30 min 后ip 給予小鼠24 h 后，毒素組及毒素+CPI-1 組小鼠全部死亡。72 h 后，毒素+衍生物CPI-1-W、CPI-1-R 和CPI-1-K 組小鼠存活率為12.5%，其余各組小鼠全部死亡。與毒素組及毒素+CPI-1 組相比，毒素+CPI-1-L、CPI-1-W、CPI-1-Y、CPI-1-R和CPI-1-K組小鼠72 h內存活率明顯提高（P<0.05，P<0.01）。

Fig.5 Survival curves of mice after intraperitoneal co-injection of BoNT/A and CPI-1 derivatives or rescued by some CPI-1 derivatives. A-C：intraperitoneal co-injection of BoNT/A（2×LD50）and 5 mg·kg-1 CPI-1 derivatives；D-F：intraperitoneal co-injection of BoNT/A（2.5×LD50）and 5 mg·kg-1 CPI-1 fatty acid derivatives（n=10）；G-I：2 and 6 h after injection of BONT/A (2×LD50)，CPI-1 derivatives（5 mg·kg-1）were ip injected（n=10）. The survival rates of mice were recorded every 12 h for 72 h. The differ?ences in survival curves between groups were determined using Log rank（Mantel-Cox）test. ＊P<0.05，＊＊P<0.01，compared with blank control group；#P<0.05，##P<0.01，compared with CPI-1 group.

脂肪酸修飾衍生物的體內活性結果（圖5D～F）表明，2.5×LD50BoNT/A 與多肽共孵育30 min 后ip給予小鼠72 h 后，毒素+CPI-1-LK（stearic）GG 和C12-CPI-1組小鼠存活率均為10%，其余各組小鼠均死亡。與毒素組相比，毒素+CPI-1組及毒素+CPI-1-LK（stearic）GG，C12-CPI-1，C14-CPI-1 和C16-CPI-1組小鼠72 h 內存活率明顯提高（P<0.05，P<0.01），毒素+CPI-1-K（stearic）GG，CPI-1-LGK（stearic）GG及C8-CPI-1組無明顯差異。與毒素+CPI-1組相比，毒素+各衍生物組均無明顯差異。

2.4.2 解毒實驗結果

2×LD50BoNT/A 攻毒72 h 后，毒素+CPI-1-L組小鼠存活率為10%，毒素+C12-CPI-1 組小鼠存活率為30%，其余各組小鼠均全部死亡（圖5G～I）。與毒素組相比，毒素+C12-CPI-1 組小鼠72 h 內存活率明顯提高（P<0.05），而毒素+CPI-1 組及其余各組無明顯差異；與毒素+CPI-1組相比，毒素+各衍生物組小鼠無明顯差異。

3 討論

本研究合成了長鏈修飾CPI-1 的N 端或C 端衍生物，由于引入疏水性長鏈后線性肽溶解度顯著降低，在溶液中無法獲得正確折疊產物，因此采用樹脂上直接碘氧化法使2 個Cys 氧化關環，然后進行裂解及純化。

多肽對BoNT/A 輕鏈體外抑制活性測定結果顯示，在CPI-1 的C 端引入疏水性或堿性氨基酸Arg后，抑制活性明顯提高。CPI-1-L 活性提高3.5 倍，是目前發現的活性最高的BoNT/A 輕鏈抑制劑。但引入疏水性較強的硬脂酸或酸性氨基酸后抑制活性反而下降。而在N 端修飾的衍生物中，隨著脂肪鏈的增長抑制活性反而下降。表明C端適當引入疏水基團可提高活性，但如引入疏水基團體積過大，不利于突變體與輕鏈活性位點結合。N端修飾與此類似。

酶解穩定性結果顯示，在CPI-1 的N 或C 端引入長鏈后衍生物抗酶解能力增強。這可能是長鏈結構掩蔽了酶切位點，使其穩定性提高。

小鼠體內解毒活性測定結果顯示，在毒素與多肽混合實驗中，非長鏈修飾CPI-1 衍生物CPI-1-L、CPI-1-W、CPI-1-Y、CPI-1-R和CPI-1-K及長鏈修飾CPI-1 衍生物CPI-1-LK（stearic）GG、C12-CPI-1、C14-CPI-1及C16-CPI-1均可有效提高小鼠72 h內存活率（P<0.05）。而解毒實驗中僅CPI-1 N 端月桂酸修飾衍生物C12-CPI-1 可提高中毒小鼠72 h 內存活率（P<0.01）。這可能是合適的烷基長度利于其進入細胞并具有較好的抗酶解能力，使CPI-1的半衰期延長，提高了小鼠的存活率。

總之，在CPI-1 的C 端引入疏水或堿性氨基酸Arg 可顯著提高CPI-1 對輕鏈的抑制活性，脂肪鏈修飾的CPI-1 抗酶解能力增強，CPI-1 N 端月桂酸修飾衍生物具有顯著的體內抗BoNT/A活性。