小麥矮稈基因Rht-B1b和Rht-D1b的降稈效應及株高相關QTL挖掘

單寶雪,劉秀坤,肖延軍,展曉孟,黃金鑫,劉百川,張玉梅,李豪圣,劉建軍,高 欣,曹新有,趙振東

(1.青島農業大學 農學院,山東青島 266109;2.山東省農業科學院作物研究所/小麥玉米國家工程中心/農業部黃淮北部小麥生物學與遺傳育種重點實驗室/山東省小麥技術創新中心,山東濟南 250100)

小麥是世界主要糧食作物,也是中國第三大糧食作物[1],可為世界人口提供20%的卡路里和蛋白質[2],也是人體微量元素的重要來源[3]。小麥株高與抗倒伏能力[4]具有顯著的相關性,是影響小麥產量的重要因素之一。據研究,矮化或降低株高與產量潛力的大幅增加有關[5]。自19世紀60年代的綠色革命以來,我國在小麥育種工作中引進了小麥矮稈、半矮稈基因Rht,小麥產量因此上升[6]。合理利用矮稈基因現已成為小麥育種的主要策略之一[7],小麥株高是多基因控制的數量性狀,主要受矮稈基因控制[8],還受到大量數量性狀位點的影響,同時根據遺傳背景和環境條件的不同而表現出差異[9-10]。目前已經被命名的矮稈基因有27個,分布在2AS、2BL、2DS、3BS、4BS、4DS、5AL、5DL、6AS、7AS和7BS等染色體上[11],多由突變產生。

Rht-B1b和Rht-D1b半矮稈基因來源于日本品種農林10號(Norin 10),分別定位于4B和4D染色體短臂,目前存在于70%的全球商品化小麥品種中[12]。Ellis[13]開發的小麥Rht-B1b和Rht-D1b基因特異性引物,利用等位基因特異性標記進行基因分型。1996年,郭保宏等[14]檢測我國76個矮稈小麥品種中的矮稈基因分布情況,單獨含有Rht-B1b或Rht-D1b基因的品種分別占21%和72%,同時含有Rht-B1b和Rht-D1b基因的品種占7%。含有Rht-B1b基因的小麥品種生產上累計推廣面積河南省最大,為524萬hm2,含有Rht-D1b基因的品種以山東省累計推廣面積最大,為1 575萬hm2。2005年慕美財等[15]對150份山東小麥品種的Rht-B1b和Rht-D1b基因進行鑒定,結果表明20.67%含有Rht-B1b基因,有54.00%含有Rht-D1b基因,同時含有Rht-B1b和Rht-D1b矮稈基因的品種僅占3.33%。2017年周曉變等[16]對黃淮麥區246份小麥材料進行矮稈基因檢測,結果表明41.46%含有Rht-B1b基因,63.41%含有Rht-D1b基因,同時含有Rht-B1b和Rht-D1b基因的材料占45%。2018年朱浩等[17]檢測202份小麥的矮稈基因分布情況,發現10.89%含有Rht-B1b基因,73.76%含有Rht-D1b基因。在過去20多年間大量研究表明,Rht-B1b、Rht4-D1b基因的分布頻率逐年提高,黃淮麥區Rht-D1b基因的分布頻率高于Rht-B1b基因,表明Rht-D1b基因的利用更廣泛,普及率更高。隨著分子生物技術的不斷發展,DNA芯片技術由于其快捷和精確的特性在QTL定位中得到了廣泛的應用。廖思敏等[18]利用55K SNP芯片,在W7268和川育12衍生的RIL群體中檢測到兩個控制株高的穩定的主效QTL:QPh.cib-4B.1和QPh.cib-2D.1。王盈等[19]在高代分離群體中檢測到一個控制株高的新位點:Qph-6A,可以解釋8.33%～13.93%的表型變異。前人分別利用芯片、GWAS技術以及分子標記對多個小麥群體進行QTL定位,在不同環境下檢測到大量的株高QTL位點,廣泛地分布于基因組染色體上,但由于檢測到的QTL位點數量多、效應小,導致在生產上應用較少。因此挖掘在多環境下穩定的QTL位點,在矮化育種中加以應用,是目前亟需解決的問題。

為發掘新的株高相關QTL位點,分析矮稈基因Rht-B1b和Rht-D1b在遺傳群體內的降稈效應,本研究選用黃淮北片育成的濟麥44×濟麥229衍生的重組自交系(RIL)群體為材料,結合株高表型數據,分析不同基因型的降稈效應并進行株高QTL定位,以期為發掘新的矮稈基因和矮化育種提供指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究選用黃淮北片育成的小麥新品種濟麥44和濟麥229衍生的重組自交系(F2∶6,285個株系)群體為材料。其中濟麥44含有Rht-D1b基因,濟麥229含有Rht-B1b基因。

1.2 田間試驗設計

試驗材料于2020-2021年種植在濟南試驗基地(21JN)、2021-2022年種植在濟南(22JN)和濟陽(22JY)試驗基地。試驗點采用隨機區組設計,1.5 m×6 m小區種植,機播180 g。按常規方法進行大田試驗管理。

1.3 表型鑒定及統計分析

小麥自然成熟收獲前,對濟南、濟陽的重組自交群體分別進行株高的數據測定,分別進行3次重復,取平均值用于表型和遺傳分析。

1.4 數據分析

利用Execl 2016對測量的株高數據進行整理和分析,在QTL IciMapping V4.0軟件(http://www.isbre ed.net)假設基因型的固定效應,使用ANOVA函數跨環境計算最佳線性無偏估計(BLUE)。采用SAS 9.4軟件(SAS institute,http://www.sas.com)進行方差分析(ANOVA)。利用Origin 2022b繪制矮稈基因降稈效應圖。利用R studio繪制群體株高的相關性熱圖。

1.5 DNA提取

利用Tiangen快捷植物基因組DNA提取系統來提取小麥苗期的幼嫩葉片DNA,利用NANO DROP 2000檢測DNA濃度及質量,將終濃度調至50 ng/μL,并置于-20℃冰箱保存備用。

1.6 PCR擴增

根據Ellis[13]發表的序列設計引物。引物對BF/WR1可擴增Rht-B1a野生型基因,引物對BF/MR1可擴增Rht-B1b突變型基因,引物對DF2/WR2可擴增Rht-D1a野生型基因,引物對DF1/MR2可擴增Rht-D1b突變型基因。

試驗分別以小偃6號(含矮稈基因Rht-B1b)、濟南17(含矮稈基因Rht-D1b)做陽性對照,以中國春(不含任何矮稈基因)做陰性對照,來驗證試驗結果的準確性。引物由上海生工生物股份有限公司合成,序列信息見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

PCR反應體系:10 μL體系中,DNA模板(已進行稀釋)1 μL,正、反向引物(10 μmol·L-1)各1 μL,Mix 5 μL,ddH2O 2 μL。

PCR反應條件:95 ℃預變性2 min,94 ℃變性15 s,退火15 s,退火溫度見表1,72 ℃延伸15 s,35個循環,72 ℃延伸5 min。

PCR擴增產物以2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,緩沖體系為1×TAE緩沖液,150 V電壓電泳30 min,凝膠成像儀下觀察條帶并照相。

1.7 遺傳圖譜的構建與QTL定位

利用中玉金標記(北京)生物技術股份公司開發的55K小麥專用芯片進行基因型檢測,刪除雜合率≥10%和缺失率≥10%的標記,用TASSEL V5.0軟件將偏分離標記(Min∶Max=0.3∶0.7)過濾,使用QTL IciMapping V4.2軟件整理剩余的標記。利用JionMap4構建全基因組遺傳圖譜,然后利用Map Chart繪制遺傳圖譜。利用軟件QTL IciMapping 4.1進行QTL分析,選擇復合完備區間作圖(ICIM-ADD)法,做1 000次重復,臨界閾值P=0.05,作為判定QTL存在與否的標準。QTL的置信區間(CI)為LRs峰值±1所在位置。QTL命名以“Q+性狀名稱縮寫+染色體編號+編號”。在超過一半的環境中發現相同性狀的QTL認為是穩定的QTL。

2 結果與分析

2.1 親本及重組自交系的株高表型分析

濟南和濟陽基地的基本氣候和土壤情況見表2,兩地塊在小麥播種前土壤均進行旋耕處理。在三個環境下對RIL群體的285個株系進行株高的測定,結果(表3、圖1)表明,21JN中RIL群體的株高范圍為34.33～103.00 cm,平均值為64.53 cm;22JN中RIL群體的株高范圍為44.67～100.00 cm,平均值為78.07 cm;22JY中RIL群體的株高范圍為45.33～119.00 cm,平均值為91.33 cm。由于濟陽試驗田的土壤速效磷及速效鉀含量整體高于濟南試驗田,年平均降雨量相近,造成22JN和22JY之間的株高存在差異。濟南試驗基地2022年小麥生長期間及小麥拔節期降水量(395.7和40.2 mm)高于2021年(324.4和27.8 mm);進而造成2022年群體的平均株高高于2021年。21JN、22JN未發生倒伏情況,22JY由于株高較高、灌漿后期出現大風降雨天氣,23.5%的小區發生了不同程度的點片倒伏。因此群體內家系間株高變異幅度較大。三個環境下株高表型數據的偏度與峰度(表3)的絕對值均小于1。

圖1 21JN(A)、22JN(B)、22JY(C)和BLUE(D)環境下RIL群體株高的頻率分布Fig.1 The frequency distribution of plant height of RIL population in 21JN(A), 22JN(B), 22JY(C), and BLUE(D) environments

表2 濟南和濟陽基地氣候和土壤情況Table 2 Climate and soil conditions of JN and JY locations

表3 RIL群體的株高表現Table 3 Plant height of RIL population

株高的遺傳力在21JN、22JN和22JY三個環境分別為0.9728、0.9837和0.9886,表明株高主要受遺傳因子的影響。由圖1可知,重組自交系的株高在不同的環境下均表現為近似正態分布,群體中株高出現了超親分離的現象,符合數量性狀遺傳的特點,可以進行株高性狀的QTL定位。

2.2 重組自交系的矮稈基因Rht-B1b與Rht-D1b的檢測

引物對BF/WR1和BF/MR1分別用來檢測Rht-B1a和Rht-B1b基因, BF/WR1可以從含有Rht-B1a基因的材料中擴增出一條237 bp的特異性片段,BF/MR1可以從含有Rht-B1b基因的材料中擴增出一條237 bp的特異性片段。結果驗證濟麥44不含Rht-B1b基因,濟麥229含有Rht-B1b基因,在285份重組自交系材料中,113份材料含有Rht-B1b基因,占總數的39.65%;172份材料含有Rht-B1a基因,占總數的60.35%。

引物對DF2/WR2和DF1/MR1分別用來檢測Rht-D1a和Rht-D1b基因,DF2/WR2可以從含有Rht-D1a基因的材料中擴增出一條254 bp的特異性片段,DF1/MR1可以從含有Rht-D1b基因的材料中擴增出一條264 bp的特異性片段。結果驗證濟麥44含有Rht-D1b基因,濟麥229不含Rht-D1b基因,在285份重組自交系材料中,102份含有Rht-D1b基因,占全部材料的35.79%;183份含有Rht-D1a基因,占全部材料的64.21%。同時含有Rht-B1b與Rht-D1b兩基因的有29份,占全部材料的10.18%。

2.3 Rht-B1b和Rht-D1b對株高的遺傳效應

將285個RIL家系的基因檢測結果與其對應株高表型進行比較,發現在三個環境下含有Rht-B1b基因的株系株高均大于基因型Rht-B1a的株系(圖2A),其中21JN、22JN和22JY三個環境下表現為顯著或極顯著的差異,相較于Rht-B1a,Rht-B1b可降低株高8.45 cm(10.75%)、6.76 cm(8.10%)和8.83 cm(9.41%)。根據圖2B,在三個環境下含有Rht-D1b基因的株系株高均大于基因型Rht-D1a的株系,其中21JN、22JN和22JY三個環境下均表現為顯著或極顯著的差異,相較于Rht-D1a,Rht-D1b可降低株高11.68 cm(14.68%)、12.74 cm(14.93%)和16.60 cm(17.36%)。

根據圖2C,Rht-B1b和Rht-D1b對小麥群體株高的聯合效應可以顯著降低株高,根據群體中Rht-B1b基因與Rht-D1b基因單獨存在的株高性狀對比,可以看出Rht-D1b基因的降稈效應要大于Rht-B1b基因。且Rht-B1b和Rht-D1b基因同時存在可顯著降低株高8.85～35.80 cm(11.05%～34.82%)。

矮稈基因Rht-B1b和Rht-D1b存在的前提下,重組自交群體內株高仍有較大差異,兩基因無法解釋全部的株高變異,因此利用已構建的285個家系,利用55K芯片進行分析,期望找到新的控制株高的QTL,可以更合理地解釋小麥群體株高的差異分布。

2.4 遺傳連鎖圖譜

經過小麥55K SNP芯片分析,親本間具有多態性的SNP標記共有53 064個,其中2 344個骨架標記用于遺傳圖譜的構建。獲得的遺傳圖譜含有29個連鎖群,全長3 349.95 cM,覆蓋基因組全部21條染色體,其中1A、2B、2A、4B、5D、6B、7A、7B分別有兩個連鎖群。B基因組標記最多(936個)且長度最短,為1 091.06 cM。A基因組有815個標記,D基因組含593個標記,覆蓋染色體長度分別為1 123.57、1 091.06和1 135.32 cM。(表4)。平均標記密度為1.43/cM。

表4 “濟麥44×濟麥229”RIL群體的高密度遺傳圖譜Table 4 Distribution and length of the markers in genetic map of the RILs derived from “Jimai 44×Jimai 229”

2.5 株高相關QTL位點

共檢測出6個與株高性狀相關的QTL(表5,圖3),共分布在1A、1B、2B、4B和4D(2)共5條染色體上。單個QTL可以解釋0.81%～32.32%的表型變異,其中可以被穩定檢測到主效的QTL有2個,分別是位于4B和4D染色體的Qph.saas-4B.1、Qph.saas-4D.2,分別可以解釋10.40%～20.12%和22.25%～32.32%的表型變異。Qph.saas-2B.2在兩個環境下被檢測到,可以解釋0.81%～1.52%的表型變異,Qph.saas-4D.1在一個環境和BLUE值被檢測到,可以解釋21.58%～22.88%的表型變異。還有兩個QTL:Qph.saas-1A、Qph.saas-1B在一個環境中被檢測到,可以解釋1.88%～2.23%的表型變異。

表5 “濟麥44×濟麥229”RIL群體株高性狀的QTLTable 5 QTLs for plant height of the RIL population derived from “Jimai 44×Jimai 229”

3 討論

2014年許琦等[20]研究發現Rht-B1b基因的降稈效應達到10.4%,Rht-D1b的降稈效應達到16.7%。Wang等[21]和Akman等[22]發現,Rht-D1b能夠降低16%～30%的株高。丁夢云等[23]檢測Rht-B1b基因的降稈效應為8.2%～8.9%。Flintham[24]檢測發現Rht-B1b和Rht-D1b單獨存在時的平均降稈效應為15.5%,兩基因同時存在時的降稈效應可達到42%。Richards[25]證明Rht-B1b和Rht-D1b單基因的降稈效應在23%,而基因組合的降稈效應可達到47%。Butlerd等[26]檢測到單個Rht-B1b和Rht-D1b單基因的降稈效應平均達到14.8%,兩基因同時存在的降稈效應達到35.7%。Miralles等[27]和Wurschum等[28]研究發現Rht-B1b和Rht-D1b基因單獨存在時的平均降稈效應在24%左右。不同研究中得到的降稈效應的差異表明基因型背景和環境條件對株高也有影響。

本試驗利用Ellis[13]發表的4對特異性分子標記對矮稈基因Rht- B1b和Rht-D1b在群體中的分布情況進行檢測,由于標記的多態性強且擴增出的目的片段條帶清晰,該分子標記被廣泛應用于小麥分子標記輔助育種。小麥矮稈基因Rht-B1b和Rht-D1b是隱性基因,不適宜在早代篩選,通過利用分子標記輔助選擇可以提前確定含有矮稈基因的個體,進而加速小麥育種的進程[29]。通過對285份RIL材料的Rht-B1b和Rht-D1b基因進行檢測,結果表明82份材料含有Rht-B1b基因,占39.65%;78份材料含有和Rht-D1b基因,占35.79%;29份材料同時含有Rht-B1b和Rht-D1b基因,占10.18%。本研究中得到Rht-B1b和Rht-D1b兩基因的分布情況略低于前人研究的結論,這可能與本試驗選取的材料有關,RIL群體的基因主要來源于兩親本,具有基因組合的局限性,因此與其他群體的基因分布情況有差異。

根據本研究結果,Rht-B1b可降低株高6.76～8.83 cm,降稈效應在8.10%～10.75%;Rht-D1b可降低株高11.68～16.60 cm,降稈效應達到14.68%～17.36%。Rht-B1b和Rht-D1b基因同時存在可顯著降低株高8.85～35.80 cm,降稈效應達到11.05%～34.82%。綠色矮稈基因Rht-B1b和Rht-D1b的廣泛應用,極大地促進了綠色革命的進程,不僅保證了小麥的穩產,更促進了小麥產量潛力的提高[30]。與1990年前后的品種相比,Rht-B1b的頻率從8.6%提高至32.2%,Rht-D1b的頻率從36.2%提高至53.4%[31],基因分布頻率的顯著提高表明矮稈基因Rht-B1b和Rht-D1b在中國不同環境下的小麥生產中都獲得了大量的應用。

本研究通過構建高密度遺傳圖譜定位到兩個穩定表達的主效QTL位點,分別是Qph.saas-4B.1和Qph.saas-4D.2。試驗前期已驗證親本濟麥44含有Rht-D1b,濟麥229含有Rht-B1b。Qph.saas-4B.1的物理位置在31.85～150.62 Mb之間,Rht-B1b基因在4B染色體上的33.61 Mb處,表明Qph.saas-4B.1就是Rht-B1b基因。Qph.saas-4D.2在16.15～37.49 Mb之間,Rht-D1b在4D染色體的18.78 Mb處,表明Qph.saas-4D.2就是Rht-D1b基因。Mao等[32]利用Meta分析法,確定了30個與株高相關的QTL,其中P13對應矮稈基因Rht-B1b,定位在Xgwm495-Xfba78側翼序列之間;P14對應矮稈基因Rht-D1b,定位在Xwmc419-Xwmc457側翼序列之間,本研究所結果與其定位結果相近。

本研究中定位到的Qph.saas-4D.1位于4D染色體11.87～16.15 Mb之間,可以解釋22.23%的表型變異,在多個環境中被檢測到。梁子英等[33]定位到多個株高及其相關性狀QTL位點,位于Xwmc473-Xwmc285區間內,可以解釋13.49%～63.42%的表型變異。劉賓等[34]定位到一個株高QTL:Oph4D-2,位于Xbarc334-Xwmc331之間。本研究定位到的株高相關位點Qph.saas-4D.1與上述多個QTL位點物理位置重疊,可能為同一QTL,是一個新的矮稈基因,目前未被克隆利用。Qph.saas-4D.1可以解釋22.23%的表型變異,是“濟麥44×濟麥229”衍生的重組自交群體在Rht-B1b和Rht-D1b兩個主效矮稈基因存在的情況下,群體中仍存在較大的株高分離現象的主要原因之一。本研究中的定位到的QTL位點Qph.saas-2B.2位于2B染色體678.84～680.04 Mb之間,與前人研究報道的QTL位點不重合,可以解釋2.73%～2.82%的表型變異,在兩個環境下被檢測到,可能為一個新的微效株高QTL位點,后續可進一步開展相關研究并在矮稈育種中加以利用。

4 結論

本研究利用濟麥44與濟麥229構建的285份RIL家系對Rht-B1b與Rht-D1b基因及其降稈效應進行檢測,結果表明82份材料含有Rht-B1b基因,降稈效應達到8.10%～10.75%;78份材料含有Rht-D1b基因,降稈效應達到14.68%～17.36%;29份材料同時含有Rht-B1b和Rht-D1b基因,兩基因同時存在的降稈效應達到11.05%～34.82%。構建高密度遺傳圖譜對群體矮稈基因進行檢測,共檢測到6個QTL,其中兩個被穩定檢測到的QTL分別為已克隆的Rht-B1b和Rht-D1b基因。此外,Qph.saas-2B.2和Qph.saas-4D.1可在2個環境下被檢測到,Qph.saas-2B.2可能為影響株高相關新QTL位點,用于小麥矮化育種實踐中,為進一步矮稈基因的精細定位和矮化育種提供理論參考。