新疆小麥白粉病菌群體遺傳多樣性分析

來漢林,沈煜洋,李 月,陳 利,李廣闊,崔燕華,高海峰

(1.新疆農業大學生命科學學院,新疆烏魯木齊 830052; 2.新疆農業科學院植物保護研究所/農業部西北荒漠綠洲作物有害生物綜合治理重點實驗室/農業部庫爾勒作物有害生物科學觀測實驗站,新疆烏魯木齊 830091;3.新疆農業科學院綜合試驗場,新疆烏魯木齊 830012)

由專性寄生菌Blumeriagraminisf.sp.tritici引起的小麥白粉病是一種典型的氣傳病害,是我國小麥生產上危害最為嚴重的病害之一,嚴重影響小麥的產量和品質[1-2]。20世紀70年代以來,由于矮稈品種、密植技術的推廣和氮肥使用量的增加,導致小麥白粉病的危害呈現逐年加重的趨勢[3]。近年來,受菌源變異、氣候變化、種植條件改變及部分主栽品種抗病性喪失等多種因素的影響,新疆地區小麥白粉病嚴重發生[4]。培育和選用抗病品種是防治該病最經濟、有效的措施[5],研究小麥白粉菌群體遺傳多樣性對選育抗病品種和病害防治具有重要意義。

隨著分子生物學的發展,DNA分子標記在小麥白粉病菌群體遺傳結構的研究中發揮著重要作用[6]。用于白粉病菌研究的DNA分子標記技術有限制性片段長度多態性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)、隨機擴增多態性(random amplified of polymorphic DNA,RAPD)、簡單重復序列(simple sequence repeats,SSR)、簡單重復序列區間(simple repeat sequence intervals,ISSR)、擴增片段長度多態分析(amplified fragment length polymorphism,AFLP)和單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism,SNP)分析等[7-8]。雷 雨等[9]在2013年利用RAPD分子標記對四川西南部小麥白粉病菌群體遺傳多樣性進行了研究,發現該地區的遺傳多態性豐富,毒性多樣性與遺傳多樣性不存在線性關系。曹志強等[10]利用AFLP技術對2009—2015年安徽省各地區小麥白粉病菌群體遺傳結構進行研究,發現不同年份的白粉病菌群體遺傳多樣性水平存在一定的遺傳變異。馬原里等[11]用SNP結合SSR分子標記對小麥抗白粉病基因進行了定位。ISSR技術具有操作簡單、重復性高、無需同位素、精準度高、能高程度揭示DNA多態性等優點,被廣泛應用于分子檢測中[12]。賈少鋒等[13]構建了小麥白粉病菌ISSR-PCR體系,并首次將其應用到小麥白粉病菌遺傳多樣性分析中。劉 娜等[14]采用ISSR和SRAP分子標記對四川省小麥白粉病菌野生群體遺傳多樣性進行了比較分析,發現這兩種標記均可用于研究小麥白粉病菌的遺傳多樣性。李 瑩等[15]和李 強等[16]用ISSR技術分析了陜西省不同年份小麥群體的遺傳多樣性。有關新疆小麥此方面的研究未見報道。為此,本研究利用ISSR分子標記技術對2020年喀什、阿克蘇、和田、昌吉、塔城小麥白粉病菌群體進行遺傳多樣性研究,以期為新疆小麥白粉病流行監測、抗病育種及病害的防治提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株:2020年5月初至6月中旬小麥白粉病發病高峰期,分別從新疆5個地區13個縣市采集小麥白粉病菌樣品,地點為:和田地區的墨玉縣(1)和洛浦縣(2),喀什地區的澤普縣(2)和葉城縣(2),阿克蘇地區的溫宿縣(7)、拜城縣(2)和阿瓦提縣(3),塔城地區的額敏縣(6)、塔城市(5)和托里縣(6),昌吉州的阜康市(8)、木壘縣(5)和奇臺縣(5),經分離純化,共獲得54株白粉病菌菌株(表1)。

表1 采樣位置信息Table 1 Isolates location information

擴繁小麥品種:感病品種新春6號,由新疆農業科學院糧食作物研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 菌株DNA提取

將獲得的54株菌株用新春6號擴繁,收集葉片上小麥白粉病菌分生孢子,稱取10～15 mg,用天根微生物基因組DNA提取試劑盒DP302(中國)提取基因組DNA,用Nano Drop 610檢測DNA濃度,OD260/OD280為1.65～1.85之間,4°C保存待用。

1.2.2 ISSR-PCR檢測

對小麥白粉病菌利用ISSR標記進行PCR檢測,預試驗從P1～P18[15]中篩選出8條擴增條帶明顯且多態性穩定的引物P3、P5、P7、P9、P15、P16、P17和P18(表2),引物由上海生工合成,目標片段在100～2 000 bp之間。PCR反應體系25 μL:2×PCR Mix 12.5 μL,菌株DNA模板1 μL,上下游引物各0.25 μL,ddH2O 11 μL。反應條件:94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s,50～54 ℃退火35 s,72 ℃ 延伸40 s,35個循環;72 ℃延伸3 min,4 ℃保存。擴增結果用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表2 ISSR引物序列Table 2 Sequence of ISSR primers

1.2.3 遺傳多樣性分析

根據54個小麥白粉病菌菌株的擴增條帶結果,有條帶的記為1,無條帶的記為0,表示等位基因的有或無。將轉換的0/1數據矩陣用NTSYS pc(2.10e,WIB,CAS)統計軟件進行遺傳相似性分析,通過Normalized Mantel Statistic進行遺傳距離和地理距離相關性分析。采用非加權類平均法(unweight pairgroup method using arithmetic averages,UPGMA)構建小麥白粉病菌遺傳多態性聚類分析樹狀圖。用popgene(1.32, UA, CIFOR)軟件對菌株群體進行等位基因數、有效等位基因數、Nei’s遺傳多樣性指數、香農指數、多態性位點數、遺傳距離、遺傳一致度和基因流Nm群體遺傳分化系數的計算。

2 結果分析

2.1 ISSR擴增結果分析

供試菌株ISSR-PCR擴增的瓊脂糖凝膠電泳結果(圖1,表2)顯示,引物P3擴增出了22條清晰條帶,數目最多;引物P5擴增出3條清晰帶,數目最少;引物P7、P9、P15、P16、P17和P18擴增條帶數分別為10、12、9、9、7和5條。共擴增出條帶77條,其中多態條帶68條,多態性比率為88.31%。

2.2 群體間分子遺傳多樣性分析

由表3可知,新疆不同區域小麥白粉病菌群體遺傳多樣性存在差異。5個群體的Nei’s遺傳多樣性指數介于0.146 1～0.260 9之間,塔城群體最高,其次是阿克蘇群體(0.246 7),二者顯著高于和田群體,與昌吉群體和喀什群體之間無顯著性差異;昌吉群體和喀什群體分別為0.223 4和0.210 7,均高于和田群體,但差異不顯著;和田群體遺傳多樣性最低。塔城群體的等位基因數為1.805 2,多態位點數和多態位點百分比為62和80.52%,均高于其他4個群體。表明塔城群體的遺傳多樣性水平最高,其次是昌吉群體,和田群體最低。當Nm< 1時,表明不同群體間基因交流水平低,僅具有遺傳分化的潛力;當基因流1≤Nm≤4時,表明不同群體間存在一定的基因交流,并且遺傳分化較小[17]。本研究的基因流Nm為2.749 0,表明新疆不同地區小麥白粉病菌群體存在一定的基因交流。

表3 新疆5個小麥白粉病菌群體遺傳多樣性Table 3 Genetic diversity of five Blumeria graminis f. sp. tritici populations in Xinjiang

2.3 群體間的遺傳距離和一致度分析

昌吉、塔城、阿克蘇、喀什和和田群體間的遺傳距離和一致度分析結果(表4)表明,其遺傳距離介于0.031 7～0.094 5之間,遺傳一致度介于0.909 8～0.968 8之間,其中,塔城與阿克蘇群體的遺傳距離最近,和田與喀什的遺傳距離最大;遺傳一致性則與對應的遺傳距離相反。說明塔城與阿克蘇群體親緣關系更近。

表4 新疆5個小麥白粉病菌群體遺傳距離與遺傳一致度Table 4 Genetic distance and genetic consistency of five Blumeria graminis f. sp. tritici populations in Xinjiang

2.4 群體遺傳變異分析

新疆5個區域小麥白粉病菌群體總Nei’s多樣性指數為0.257 1,群體內Nei’s多樣性指數為0.217 5,群體遺傳分化系數為0.153 9,群體內的遺傳變異占總體變異的84.60%。由此表明,遺傳變異主要來源于群體內,群體間存在較大的分化。

2.5 群體遺傳聚類分析

UPGMA聚類分析結果(圖2)表明,當遺傳距離為0.932時,可將5個群體分為三大分支,第一大分支包含昌吉、塔城、阿克蘇共3個亞群,其中塔城和阿克蘇群體歸為一小分支;第二大分支是喀什;第三大分支是和田群體。建立群體間的遺傳距離和地理位置距離矩陣,通過Normalized Mantel Statistic檢驗分析,相關系數為r= 0.170 0,表明新疆5個小麥白粉病菌群體的遺傳距離與地理距離相關性不顯著。

圖2 基于非加權組平均法的新疆5個小麥白粉病菌群體聚類分析Fig.2 Cluster analysis of five Blumeria graminisf. sp. tritici populations from Xinjiang based on unweighted pair-group method with arithmetic means

3 討論

前人對新疆地區小麥白粉病的研究主要集中在藥效評價、抗病品種鑒定、毒性監測和田間發生流行規律研究方面。趙海燕等[18]和李廣闊等[19]研究發現,核桃小麥套種有利于白粉病的發生。高海峰等[20]篩選出新紫1號和14/8329兩個品種(系)對小麥白粉病具有明顯抗性。王振花等[21]對新疆小麥白粉病菌群體毒性進行了鑒定,發現大部分基因乃存在抗性。高海峰等[22]發現新冬60號和新冬57號田間發生危害程度顯著低于新冬20號。

本研究利用ISSR分子標記對新疆不同區域5個群體54株小麥白粉病菌進行遺傳多樣性分析,結果表明,不同地區白粉病菌群體之間遺傳多樣性存在差異,遺傳變異主要來源于群體內部,且不同群體之間存在一定的基因交流。這與李 瑩等[15]、李 強等[16]、趙紫慧等[23]和石 琳等[24]對陜西、山東、河北、四川、甘肅等地區的研究結果相似。本研究發現,新疆小麥白粉病菌群體遺傳距離與地理距離的相關不顯著,這與李 瑩等[15]對2016年陜西省小麥白粉病菌遺傳多樣性研究的結果相似,而李 強等[16]和Zeng等[25]研究發現,小麥白粉病菌群體遺傳距離與地理距離顯著相關,結果不同可能是由于不同區域之間因地形特征引起的環境不同。

北疆地區的昌吉和塔城之間白粉病菌群體遺傳一致度較高,這可能是由于塔城和昌吉位于準噶爾盆地兩緣,中間無山脈阻礙,白粉病菌在高空氣流作用下便于基因交流。南疆地區的喀什與和田白粉病菌群體遺傳一致度最低,這可能是由于喀什與和田位于塔克拉瑪干沙漠邊緣,白粉病菌很難通過沙漠在兩地之間進行基因交流。整體分析表明,北疆和南疆小麥白粉病菌群體遺傳一致度較低,原因可能是天山山脈把昌吉、塔城與阿克蘇、喀什、和田分開,且南疆有我國最大的塔克拉瑪干沙漠,阻礙了南、北疆小麥白粉病菌基因交流。新疆面積大,南、北疆小麥主產區相距較遠,種植制度不同,且有高山、沙漠阻隔,易造成小麥白粉病菌群體遺傳差異大,因此,在下一步研究中應擴大樣本采集區域和數量,進一步明確南、北疆小麥白粉病菌群體遺傳特征,為新疆小麥白粉病的科學防控提供依據。