不同來源接種物對不同原料產氫烷潛力的影響及微生物群落結構分析

李 凱, 趙紊驍赟, 劉思雨, 張欣蕾, 李祿恩, 梅寶帆, 井琳琳, 孫雅雅, 袁海榮

(北京化工大學 化工資源有效利用國家重點實驗室, 環境科學與工程系, 北京 100029)

厭氧消化是一種很好的處理有機廢物并產生氫烷的能源化轉化技術。厭氧消化系統的啟動都離不開良好的接種物,接種物的優劣是影響厭氧消化啟動成敗的關鍵。影響厭氧消化的因素有很多[1],研究者的關注點主要集中在溫度[2]、pH值[3]、有機負荷[4]等因素對厭氧消化性能的影響上,對單純接種物的研究相對較少。

接種物是影響厭氧消化的主要參數之一。Hossain[4]等研究了溫度、接種物類型和接種比對干式厭氧消化沼氣產量的影響,發現厭氧污泥和牛糞混合比為1∶2的混合物作為接種物時,城市有機固體廢物的甲烷產量最高,但沒有對接種物中的微生物進行分析。Li[5]等對比了北郎中養豬廠的中溫厭氧消化沼液、北京城市污水處理廠的廢活性污泥和順義釀酒廠的活性顆粒污泥3種接種物對牛糞、玉米秸稈和蕃茄秧共消化的影響,發現豬糞沼液作為接種物時混合物的產甲烷量最高,活性顆粒污泥作為接種物時混合物的揮發性脂肪酸濃度較高,并對3種接種物進行了簡單的微生物群落結構分析,但未對比3種不同接種物之間的差異性。Aarle[6]等研究了厭氧污泥、顆粒污泥和產酸發酵液3種接種物分別對3種復雜的木質纖維素原料酸化產揮發性脂肪酸的影響。劉偉[7]等對比了5種接種物對牛糞高溫厭氧消化產氣性能的影響,發現接種物為沼液底物和二沉污泥的混合物時牛糞厭氧產氣效果最好。

綜上所述,研究者們以不同原料為基質,采用了多種不同接種物進行厭氧消化實驗,主要研究了不同接種物對不同基質的產氣性能方面的影響,很少有人關注不同接種物之間微生物群落結構變化和不同接種物之間微生物的差異性。由于在厭氧消化過程中,真正對厭氧消化起作用的是接種物里面的微生物,因此,探明不同接種物的群落結構特性及其差異性,關系到能否正常啟動厭氧消化系統,是厭氧消化系統啟動成敗的關鍵所在。所以,研究不同接種物對不同原料的產氣潛力及其微生物群落結構及差異性非常有必要。

1 材料與方法

1.1 實驗原料

為了評價不同來源的接種物是否適合作為厭氧消化的接種物,3種發酵原料被采用,分別為玉米秸稈、青稞稈和廚余垃圾,分別取自北京市延慶區、西藏拉薩市和北京化工大學學生食堂。秸稈經風干粉碎至20目后備用,廚余垃圾除雜后用垃圾粉碎機粉碎后備用。實驗選取3種接種物,分別為牛糞、秸稈厭氧消化液和餐廚干發酵出料,為表述方便,分別命名為NF、ZY、CN,3種接種物分別取自北京大興區金銀島牧場、三河市盈盈生物有限公司和北京化工大學固廢實驗室。原料和接種物的基本性質如表1所示。

表1 原料及接種物基本性質*

1.2 實驗方法

產氫烷潛力實驗采用批式厭氧消化方式。實驗裝置由500 mL藍蓋瓶(有效體積為400 mL)、集氣瓶、乳膠管、三通等組成(見圖1)。將ZY、NF和CN分別作為消化青稞稈、玉米秸稈和廚余垃圾的接種物,并考察其產氫和產甲烷潛力。將3種實驗原料分別與不同接種物按干物質比1∶2混合放入藍蓋瓶,加入去離子水至有效體積,充分攪拌均勻后封蓋,然后置于恒溫水浴箱中,保持反應器內溫度為35 ℃±1 ℃,每天定時手動搖動發酵瓶兩次,采用排水集氣法收集所產生的氣體,每天記錄氣體產量并用氣相色譜儀測定氣體中氫氣、甲烷和二氧化碳等氣體成分,計算氫氣出和甲烷的產量。每個反應瓶加入20 gTS原料,為了考察不同接種物是否能快速且正常啟動厭氧消化反應系統并順利進入甲烷化階段,厭氧消化時間設定為10天。同時設置純ZY、NF和CN接種物作為空白對照,實驗結果均扣除接種物空白產氣量,每組實驗設置3個平行樣,實驗結果為3平行樣的平均值。

圖1 實驗裝置示意圖

1.3 分析方法

樣品的總固體含量(TS)和揮發性固體含量(VS)采用國標法進行測定。堿度采用溴甲酚綠-甲基紅指示劑滴定;氨氮含量采用HI83206高精度試驗室多參數測定儀進行測定;pH值、總揮發性脂肪酸(TVFA)和氣體含量分別采用pH 計、氣相色譜儀(島津GC—2014)和氣相色譜儀(SP—2100)進行測定。選取NF、ZY和CN這3種接種物樣品送至上海美吉生物公司進行微生物測定,細菌和古菌PCR的引物分別為338F (5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)、806R (5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)和524F10ext(5’-TGYCAGCCGCCGCGGTAA-3’)、Arch958Rmod (5’-YCCGGCGTTGAVTCCAATT-3’)。基于16S rDNA高通量測序技術對樣品中的微生物群落進行分析。并根據Illumina MiSeq 平臺上的標準操作規程進行測序,相關微生物圖通過上海美吉生物云平臺進行在線作圖。

2 結果與討論

2.1 產氫烷潛力分析

產氫烷速率和產氫烷潛力是評價接種物優劣的兩個重要指標,不同接種物中加入青稞稈、玉米秸稈和廚余垃圾后其產氫烷速率和產氫烷潛力如圖2～圖4所示。由圖2可以看出:在厭氧發酵的第1天,廚余-CN組產甲烷速率最高,達到42.4 mL·g-1VS·d-1,然后產甲烷速率迅速下降,從第4天開始產氣幾乎為0。青稞稈-ZY和玉米秸稈-NF組產甲烷速率逐漸緩慢上升,到第10天時,日甲烷產量分別達到11.4和14.4 mL·g-1VS·d-1。廚余-ZY組在10天的發酵周期內幾乎未產甲烷。在厭氧發酵的前2天,玉米秸稈-NF和廚余-ZY組表現出良好的產氫氣優勢,最大日產氫氣速率分別為26.5和15.8 mL·g-1VS·d-1,最大氫氣含量分別為39.5%和21.0%(見圖3)。從氣體含量來看(見圖3),不同實驗組中(廚余-ZY組除外)甲烷含量均呈快速上升趨勢,從第3～4天開始,甲烷含量均已超過30%,到第10天時,不同實驗組的甲烷含量為56.7%～70.9%,玉米秸-NF組從第4天開始甲烷含量達到61.4%～71.6%。由圖4可知,玉米秸稈-NF組在10天的厭氧消化周期內累積甲烷產量最高,為80.9 mL·g-1VS,分別高出青稞稈-ZY、青稞稈-CN和廚余-CN組54.5%、255.4%和18.1%,這說明NF接種物更適合消化秸稈。同時玉米秸稈-NF組和廚余-ZY組的累積氫氣產量分別為33.9和27.1 mL·g-1VS。因此,玉米秸稈-NF組在產甲烷和產氫氣方面均為最優,其次是廚余-CN組。這說明接種物消化同源原料更容易,也就是NF接種物更適合消化秸稈,而CN接種物更適合消化廚余垃圾,這個現象與之前用不同來源沼液作為預處理劑后厭氧產甲烷的結果相似[3]。

圖2 不同接種物條件下日產氣甲烷和氫氣速率

圖3 不同接種物條件下甲烷和氫氣含量的變化

圖4 不同接種物條件下累積甲烷產量和氫氣產量

2.2 微生物群落結構分析

2.2.1 細菌和古菌群落結構

細菌在門水平和屬水平上的相對豐度如圖5～圖7。不同接種物中的細菌在12個門和57個屬上相對豐度較高。其中厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidota)在3種接種物中相對豐度占絕對優勢,分別為35.3%～53.2%和11.6%～36.5%(見圖5)。Firmicutes和Bacteroidota是厭氧發酵中最常見的兩個門,其中Firmicutes的主要作用是產生纖維素酶、蛋白酶和各種胞外酶來降解各種復雜有機物,其中部分Firmicutes具有降解纖維素的能力;Bacteroidetes的主要作用是將大分子有機物降解成小分子的酸類物質[8]。在NF接種物中,Firmicutes和Bacteroidota的相豐度均為最高,這說明NF接種物的水解酸化能力最強,可以很快將原料降解成小分子物質,這與玉米秸稈-NF組產甲烷和產氫氣的能力均為最強相對應。在屬水平上(見圖7),CN接種物中優勢菌種為未分類的多伊卡菌門g_norank_f_norank_o_norank_c_Dojkabacteria(19.20%),屬于Bacteroidota門類,該類細菌主要與碳水化合物降解有關,能夠適應極端環境[9]。這就是pH值為4.2的廚余垃圾(見表 1)在CN接種物條件下也能很好地厭氧消化產甲烷而廚余-ZY組則產氣不佳的主要原因,因為ZY接種物中缺少大量適應極端環境的細菌。在ZY接種物中,相對豐度最高的是Candidatus_Caldatribacterium(10.2%)。NF接種物中,優勢菌種為紫單胞菌(Proteiniphilum)、熱桿菌(Turicibacter)、發酵單胞菌(Fermentimonas)和賴氨酸芽胞桿菌(Lysinibacillus),相對豐度分別為16.2% 、12.6%、10.4%和9.0%。Fermentimonas和Proteiniphilum能夠利用不同類型的碳水化合物和纖維素產生氫氣、VFA和CO2以及利用含N類物質作為能源產生乙酸[10],Turicibacter主要參與糖類發酵物質的代謝,其代謝產物主要為乳酸[11]。因此,NF接種物以玉米秸為原料時,能夠既產生甲烷,也能夠產生氫氣。總體來說,上述細菌大都屬于Firmicutes、Bacteroidota和Proteobacteria菌門,對促進厭氧消化底物的水解起重要作用。

圖5 細菌在門水平上的相對豐度

圖6 古菌在門水平上的相對豐度

圖7 細菌在屬水平上的相對豐度

在甲烷化階段,不同的古菌對產甲烷起到重要的作用,在門水平和屬水平的相對豐度如圖6、圖8。廣古菌門(Euryarchaeota)和鹵桿菌門(Halobacterota)在門水平上的相對豐度占據絕對優勢,兩者的相對豐度之和占門水平總相對豐度的96.95%～99.95%(見圖6)。其中ZY接種物中Euryarchaeota和Halobacterota的相對豐度分別為52.9%和44.0%。NF和CN接種物中相對優勢菌門為Halobacterota(80.9%)和Euryarchaeota(98.6%)。在屬水平上,3種接種物之間有明顯區別(圖8)。Methanosphaera是CN接種物中的優勢菌種,相對豐度占98.2%。在NF接種物中,優勢菌種為Methanocorpusculum和Methanobrevibacter,其相對豐度分別為80.5%和18.6%。ZY接種物中的甲烷菌多樣性比NF和CN接種物中的優勢甲烷菌種類豐富得多,相對豐度大于1%的甲烷菌有8種,其中優勢菌種為甲烷鬃毛菌(Methanosaeta)、甲烷桿菌(Methanobacterium)和甲烷短桿菌(Methanobrevibacter),其相對豐度分別為41.7%、31.2%和16.4%。Methanosaeta的主要作用是能夠利用不同種類的底物,它可以將甲基胺或甲醇轉化為甲烷和二氧化碳,或者將氫氣、二氧化碳和乙酸轉化成甲烷[12]。Methanosphaera、Methanocorpusculum和Methanobrevibacter屬于氫營養型產甲烷菌,氫營養型產甲烷古菌利用氫氣、甲酸鹽等電子供體還原二氧化碳產生甲烷[8]。由于廚余垃圾易酸化,在CN接種物中其水解酸化過程產生的氫氣很容易被氫營養型產甲烷菌Methanosphaera所利用,因此,CN接種物中加入廚余垃圾更適合產甲烷。而在廚余-ZY組,由于ZY接種物中缺少Methanosphaera(1.9%),而能利用氫氣產甲烷的Methanobrevibacter豐度僅為16.4%,遠低于在CN接種物中98.2%豐度的Methanosphaera,故廚余-ZY組的產氫量高,而產甲烷量最低。由于NF接種物中含有極其豐富的氫營養型產甲烷菌和產氫產酸細菌,因此,NF接種物組產氫和產甲烷效果均最佳。

圖8 古菌在屬水平上的相對豐度

2.2.2 微生物差異性分析

為了進一步分析不同接種物之間微生物的不同,對不同接種物進行了屬水平上的組間差異性分析(見圖9、圖10)。由圖可知,不同接種物之間在細菌和古菌上的差異性非常明顯。NF接種物與CN和ZY接種物相比,NF接種物中的Proteiniphilum、Turicibacter、Fermentimonas和Lysinibacillus的相對豐度與接種物CN和ZY中相應地細菌在相對豐度上存在顯著性差異((9.0%～15.3%)***,p≤0.001)和((8.8%～15.6%)***,p≤0.001),Dojkabacteria和norank_f__W27在NF和CN接種物中也存在明顯差異(-11.0%～-19.2%)***,p≤0.001 )(見圖9)。在古菌屬水平上,NF接種物中的古菌Methanosphera、Methanocorpusculum和Methanobrevibacter的相對豐度與CN接種物中相應古菌的相對豐度存在顯著性差異(-97.8%***, 18.5%～80.5%***,p≤0.001),NF與ZY接種物中的Methanocorpusculum、Methanosaeta和Methanobacterium的相對豐度也存在顯著性差異(80.5%***,-41.7%***和-31.1%***,p≤0.001)(見圖10)。這說明不同接種物之間在屬水上的細菌和古菌均存在較大顯著性差異。這可以很好地解釋出不同接種物在產氫烷方面的能力是不同的。

圖9 細菌在屬水平上的差異

圖10 古菌在屬水平上的差異

2.2.3 微生物群落與接種物特性的相關性分析

接種物中的pH值、氮氨、堿度和TVFA等基本特性會直接影響接種物中微生物群落結構,最終影響接種物環境下的原料產氫氣和產甲烷的能力。因此,明確接種物基本特性與接種物中微生物群落結構的相關性,有助于分析原料的產氣潛力。不同接種物特性與微生物群落結構的相關性如圖11～圖14所示。由圖11可知:接種物中的pH值和TVFA分別與Fastidiosipila、norank_f__norank_o__norank_c__Dojkabacteria、norank_f__W27和Sedimentibacter、Romboutsia、Paeniclostridium呈現出顯著的正相關性(R=1.0***),與Turicibacter、Lysinibacillus和Gallicola、Pseudomonas、Rikenellaceae_RC9_gut_group表現出顯著的負相關性(R=-1.0***)。堿度和氨氮分別與Turicibacter、Lysinibacillus和Proteiniphilum、Fermentimonas、Acholeplasma表現出顯著性正相關性,而與norank_f__norank_o__norank_c__Dojkabacteria、norank_f__W27、Fastidiosipila和Candidatus_Caldatribacterium、norank_f__norank_o__MBA03、Christensenellaceae_R-7_group、_Caldicoprobacter、 norank_f__norank_o__norank_c__JS1表現出強烈地負相關。產氫潛力與接種物中堿度和微生物的相關性相似,而產甲烷潛力與接種物中氨氮與微生物的相關性一致。同時分析圖12可知,接種物中的堿度和產氫能力與Methanobrevibacter正相關(R=1***),pH值與Methanobrevibacter顯示出極強的負相關性(R=-1***)。Methanosphaera與pH值呈現出正相關性,與堿度和氫氣產量呈現出負相關性。Methanocorpusculum與氨氮和甲烷產量呈現出極強的正相關性(R=1***)。這表明norank_f__norank_o__norank_c__Dojkabacteria、norank_f__W27、Fastidiosipila的豐度與產氫能力呈現正相關,Methanocorpusculum的相對豐度與產甲烷能力呈現正相關。綜合圖11、12可說明,接種物中的細菌和古菌微生物與原料的產氫和產甲烷潛力有關系。由細菌和古菌在屬水平上的網絡關系圖13、14可以進一步直觀地看出微生物與接種物的基本特性之間的關系。厭氧消化系統中TVFA影響厭氧消化過程中Gallicola等19種細菌和Methanothermobacter等2種古菌的豐度,產氫潛力與Turicibacter等10種細菌和Methanosphaera等2種古菌豐度的有關。產甲烷潛力受Proteiniphilum等17種細菌和Methanocorpusculu等9種古菌的影響。這說明接種物中有多種的細菌和古菌共同分工協作,對加入到接種物系統中的原料的產氫和產甲烷潛力共同起作用。

圖11 細菌與接種物特性相關性熱圖

圖12 古菌與接種物特性相關性熱圖

圖14 古菌網絡

3 結論

不同接種物中加入不同原料后其產氫烷速率和產氫烷潛力有明顯不同,接種物消化同源原料效果更好。廚余-CN和玉米秸稈-NF組的最高產甲烷和產氫速率分別為42.4和26.5 mL·g-1VS·d-1。玉米秸稈-NF組的累積甲烷產量最高,為80.9 mL·g-1VS,分別比青稞稈-ZY、青稞稈-CN和廚余-CN組高出54.5%、255.4%和18.1%。玉米秸稈-NF組在產甲烷和產氫氣方面均為最優,其次是廚余-CN組。

細菌Firmicutes和Bacteroidota在門水平上的相對豐度分別為35.3%～53.2%和11.6%～36.5%。NF接種物屬水平上的優勢細菌種為Proteiniphilum、Turicibacter、Fermentimonas和Lysinibacillus,相對豐度分別為16.2% 、12.6%、10.4%和9.0%。Euryarchaeota和Halobacterota在門水平上的相對豐度占總相對豐度的96.95%～99.95%。Methanosphaera和Methanocorpusculum、Methanobrevibacter分是CN和NF接種物中的優勢菌種,相對豐度分別為98.2%和80.5%、18.6%。

不同接種物在屬水上的細菌和古菌之間均存在較大顯著性差異。產氫潛力受Turicibacter等10種細菌和Methanosphaera等2種古菌豐度的影響。產甲烷潛力與Proteiniphilum等17種細菌和Methanocorpusculu等9種古菌的相關。