子宮腺肌病疼痛與辣椒素受體、P物質及雌激素受體α的相關性研究

劉露 郭紅燕

作者單位：100191,北京大學第三醫院婦科

子宮腺肌病疼痛發生發展的原因尚未明確,而其痛經的表現和嚴重程度存在較大個體差異,且保守治療有一定局限性,因此其治療仍有難度,需要進一步研究疼痛發生發展的機制。

辣椒素受體(transient receptor potential vanilloid 1,TRPV1)是分布于外周傷害性感受器上的受體,構成機體進行溫度、化學或機械感受的物質基礎[1],感受各種內源性和外源性的物理、化學等刺激[2],參與疼痛發生發展等多種生理功能[3]。TRPV1亦可能在子宮腺肌病疼痛的發生發展中起重要作用。P物質作為在初級感覺神經元中表達的“疼痛”神經遞質,與TRPV1可能存在相互作用,這在子宮腺肌病疼痛中的價值值得進一步探索。而既往研究提示,雌激素對子宮腺肌病的發病和疼痛的機制起重要作用,雌激素或許對TRPV1起到一定的促進作用。

目前已有研究探索TRPV1在子宮內膜異位癥疼痛中的表達和作用,但關于TRPV1在子宮腺肌病疼痛的發生發展中的相關作用的研究只有一項,且尚未有研究比較TRPV1、P物質和雌激素受體(estrogen receptor,ER)α在子宮腺肌病中的表達情況,以及分析其和疼痛的相關性及三者之間的相互作用。因此TRPV1、P物質和雌激素受體α在子宮腺肌病中的作用值得進一步探索。

本實驗從mRNA和蛋白水平上對子宮腺肌病和正常對照子宮的ER-α、P物質和TRPV1受體的表達進行檢測,以驗證三者在兩組中的表達差異,并分析三者與疼痛程度之間的關聯性。

對象與方法

1.研究對象：選擇2017年7月—2019年2月在北京大學第三醫院進行了全子宮切除術或子宮腺肌病病灶切除術的51例患者為子宮腺肌病組,選取14例無子宮腺肌病或痛經,因宮頸上皮內瘤變(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)而接受全子宮切除術的絕經前患者作為正常對照組。

對于子宮腺肌病組和正常對照組,分別采集子宮外肌層子宮腺肌病病灶和正常肌層組織0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm。人體組織標本離體后15 min內完成采集,經液氮冷凍處理后放入-80 ℃冰箱中保存。

2.實驗內容及方法

(1)RT-PCR。提取組織總mRNA,實驗步驟按照RNA提取試劑TRIzol(北京普利萊基因技術有限公司)說明書進行。逆轉錄合成cDNA,將得到的cDNA取1 μL,依次加入ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(南京諾唯贊生物科技有限公司)10 μL,上、下游引物各1 μL,滅菌蒸餾水7 μL,總體積20 μL進行PCR反應。使用的StepOne實時熒光定量PCR儀購自美國Thermo Fisher Scientific公司。擴增條件為95 ℃預變性2 min,95 ℃變性10 s,58 ℃延伸30 s,共40個循環。目的基因TRPV1引物、P物質引物、ER-α引物和內參基因actin引物由上海擎科生物科技有限公司合成,引物序列和產物長度見表1。

表1 引物序列和產物長度

(2) Western blot。將電泳分離后的組織總蛋白質從凝膠轉移到聚偏二氟乙烯膜上,依次加入1：1 000多克隆兔抗人TRPV1抗體(美國Abcam)/單克隆兔抗人ER-α抗體(美國Abcam)和1：1 000辣根多氧化物酶結合的鼠抗人IgG(美國Abcam)。按照ECL發光液說明書避光顯色,Chemi Doc XRS成像儀(Bio-Rad)拍照并用軟件Quantity One 掃描光密度值進行半定量分析。

3.統計分析方法：本研究使用Microsoft Excel進行數據錄入和管理。使用SPSS 20.0進行數據統計分析。對數據進行正態分布檢驗,如符合正態分布,則使用(均值±標準差)對數據進行描述,使用t檢驗進行統計學分析,利用Pearson相關系數對兩個變量之間的關聯性進行分析;如不符合正態分布,則使用[中位數(最小值,最大值)]對數據進行描述,使用非參數檢驗(Mann-Whitney U)進行統計學分析,并利用Spearman相關系數對兩個變量之間的關聯性進行分析。當雙側P<0.05,為差異有統計學意義。

結果

1.患者一般情況：兩組患者的一般情況見表2。

表2 患者一般情況 [中位數(最小值,最大值)]

2.正常對照組和子宮腺肌病組中TRPV1的差異表達：子宮腺肌病中TRPV1 mRNA表達高于正常對照組(P<0.01)(見圖1)。TRPV1蛋白亦高于正常對照組(P<0.01)(見圖2)。

圖1 TRPV1、P物質和ER-αmRNA在正常對照組和子宮腺肌病組中的表達(a)TRPV1 mRNA表達在子宮腺肌病組中高于正常對照組;(b)P物質mRNA表達在子宮腺肌病組中高于正常對照組;(c)ER-α mRNA表達在子宮腺肌病組中高于正常對照組;*P<0.01

圖2 TRPV1和ER-α蛋白在正常對照組和子宮腺肌病組中的表達(a)TRPV1蛋白表達在子宮腺肌病中高于正常對照組;(b)ER-α表達在子宮腺肌病組與正常對照組間無明顯差異;(*P<0.01,nsP >0.05);

3.正常對照組和子宮腺肌病組中P物質的差異表達：子宮腺肌病中P物質 mRNA高于正常對照組(P<0.01)(見圖1)。

4.正常對照組和子宮腺肌病組中ER-α的差異表達：子宮腺肌病中ER-α mRNA高于正常對照組(P<0.01)(見圖1)。子宮腺肌病中ER-α蛋白表達與正常對照組無明顯差異(P=0.315)(見圖2)。

5.子宮腺肌病中TRPV1 、P物質和ER-αmRNA表達和疼痛的相關性：子宮腺肌病中TRPV1、P物質和ER-α mRNA表達與疼痛VAS評分存在正相關(Spearman′r=0.548,P<0.01;Spearman′r=0.350,P<0.01;Spearman′r=0.292,P=0.049)(見圖3)。在子宮腺肌病組中,TRPV1和ER-α蛋白表達在無-輕度痛經組和中-重度痛經組中無統計學差異(P=0.921,P=0.921)。

圖3 子宮腺肌病中TRPV1、P物質和ER-α mRNA表達與疼痛程度之間的關聯性分析(a)子宮腺肌病中TRPV1 mRNA表達與疼痛程度之間正相關;(b)子宮腺肌病中P物質mRNA表達與疼痛程度之間正相關;(c)子宮腺肌病中ER-α mRNA表達與疼痛程度之間正相關。

6.子宮腺肌病中TRPV1、P物質和ER-α mRNA的相關性：在子宮腺肌病病灶中,TRPV1 mRNA和P物質mRNA存在正相關性(Spearman′r=0.350,P=0.012),TRPV1 mRNA和ER-α mRNA之間無相關性(Spearman′r=0.274,P=0.051),P物質 mRNA和ER-α mRNA之間同樣存在正相關性(spearman′r=0.559,P<0.01)(見圖4)。

圖4 子宮腺肌病病灶中TRPV1、P物質和ER-αmRNA表達之間的相關性(a)子宮腺肌病病灶中TRPV1和P物質mRNA表達之間呈正相關;(b)子宮腺肌病病灶中TRPV1和ER-α mRNA表達之間無相關性;(c)子宮腺肌病病灶中P物質和ER-α mRNA表達之間呈正相關

討論

本研究發現,TRPV1 mRNA和蛋白在子宮腺肌中的表達高于子宮正常對照,并且TRPV1mRNA和痛經存在正相關,提示TRPV1在子宮腺肌病疼痛有重要作用。已有研究報道TRPV1在內異癥中表達升高,但關于子宮腺肌病中TRPV1的表達和作用機制的研究只有一篇報道。Nie等針對子宮腺肌病中TRPV1受體表達進行了臨床研究,選取50例子宮腺肌病患者及18例正常對照,發現子宮腺肌病病灶中TRPV1的表達顯著增加,且與痛經嚴重程度呈正相關[2]。上述結果提示TRPV1在子宮腺肌病的發病尤其是疼痛發生發展中存在重要作用。TRPV1參與子宮腺肌病疼痛過程的可能機制如下：(1)在子宮腺肌病炎性環境中,組織和神經損傷后釋放多種炎癥介質和神經因子至周圍組織,引起周圍神經元上TRPV1激活后[4],發生鈣離子內流,進而導致了神經末梢釋放神經肽類和興奮性氨基酸,完成傷害性感受的傳遞功能;(2)子宮腺肌病中TRPV1的表達水平增加,其對疼痛的傳遞作用隨之增加;(3)TRPV1是許多炎癥途徑的下游靶點,受到炎癥刺激后的TRPV1激活閾值顯著降低,導致痛覺過敏的發生[5];(4)TRPV1還可以激活多種炎癥介質和神經肽的分泌,這些物質同樣在疼痛的傳導功能中起到作用,并且可以反作用激活TRPV1[3,6]。因此,TRPV1在疼痛中的重要作用為慢性盆腔痛的藥物研究提供了新的方向。目前已進行了TRPV1靶向治療的動物實驗,國內研究者通過建立子宮腺肌病小鼠模型,對TRPV1拮抗劑——槲皮素的疼痛治療效果進行驗證并取得了陽性結果[7]。但臨床藥物試驗尚未開展,TRPV1靶向治療對于人類慢性盆腔痛的治療作用和不良反應尚不明確,還值得進一步探索和研究。

本研究發現,P物質mRNA在子宮腺肌病病灶中表達升高并與痛經程度存在正相關。P物質是廣泛參與各種疼痛過程的重要神經遞質,當外周神經受到刺激后,P物質可在神經末梢釋放并發揮痛覺傳遞作用[8]。有研究顯示將選擇性P物質受體激動劑注射進大鼠體內后,可以產生劑量依賴性痛覺過敏;而向已誘發關節炎的大鼠關節內注射P物質受體拮抗劑,發現P物質表達減少,痛覺過敏也明顯減輕,提示P物質在痛覺過敏的形成和維持中起到重要作用[9]。P物質在子宮內膜異位癥和子宮腺肌病中亦起到重要作用。有研究發現在小鼠內異癥病灶中P物質的表達水平較對照組升高[10]。Li等還發現,子宮炎癥可以增加P物質陽性且特異性支配子宮的脊髓背角神經元數量,這些神經元數量增加可以誘導和加重疼痛的發生發展[11]。Lertvikool等通過檢測P物質表達來代表子宮腺肌病病灶中的神經纖維密度,并發現在子宮腺肌病病灶中,中-重度疼痛組的神經纖維密度要高于輕度疼痛組[12]。這些研究結果均提示P物質可以在子宮腺肌病等疼痛中產生重要作用。

P物質和TRPV1之間存在一定相互促進作用,共同參與子宮腺肌病疼痛的發生發展。既往研究在結腸炎、關節炎等慢性疼痛模型中發現P物質和TRPV1存在相互作用。Lapointe等的研究表明,結腸傳入神經長期暴露于P物質后可能產生TRPV1致敏,并引起結腸急性炎癥后慢性腹痛的發生[13]。TRPV1和P物質相互作用的機制包括兩方面：(1)各種刺激激活初級感覺神經元末梢的TRPV1,引起鈣離子內流,胞質內的鈣離子濃度增高促使神經末梢中P物質的釋放[14];(2)P物質通過阻斷TRPV1的降解通路以及促進其再循環至細胞膜,增加背根神經元細胞膜上TRPV1的表達,引起辣椒素誘導產生的電流幅度顯著增加[13]。而在子宮腺肌病中,并未有研究對P物質和TRPV1之間的相關性進行探索。本研究發現,子宮腺肌病中P物質mRNA和TRPV1 mRNA之間存在正相關性。P物質可以通過和TRPV1的相互作用參與疼痛的發生發展。基于此作用機制,同樣可以對P物質靶向的疼痛治療進行進一步探索。向患有關節炎大鼠的關節內注射P物質受體拮抗劑,發現P物質表達減少,痛覺過敏也明顯減輕[9]。亦有學者提出P物質存在對于TRPV1的誘導激活作用[15]。目前尚無P物質受體拮抗劑在子宮腺肌病模型中的動物實驗。

有研究提出雌激素和TRPV1之間可能存在相互作用。Greaves等發現,經E2或雌激素受體激動劑處理后的感覺神經元中TRPV1 mRNA表達增加[16]。雌激素可以從基因表達和受體功能兩方面來影響TRPV1受體發揮作用：(1)雌激素與ER結合后,通過與TRPV1 DNA上的反應元件結合,促進TRPV1轉錄[17];(2)E2與ER、G蛋白偶聯雌激素受體(GPER)結合后,促進細胞內鈣離子、環磷酸腺苷(Cyclic Adenosine monophosphate,cAMP)增加,激活PKC途徑作用于TRPV1受體[17]。但本研究未發現子宮腺肌病病灶中TRPV1 mRNA和ER-αmRNA之間存在正相關性,可能與研究樣本量偏小有關。此外,盡管在子宮中ER-α表達高于ER-β,但ER-α的表達情況或許并不能完全替代雌激素的作用情況。

在子宮腺肌病中,雌激素亦可能對P物質間存在一定促進作用,共同參與疼痛過程。本研究發現,子宮腺肌病病灶中P物質 mRNA和ER-α mRNA之間存在正相關性。Mowa等提出,雌激素受體和P物質在感覺神經元上共表達,當卵巢去勢大鼠接受外源性雌激素處理后,脊髓背角神經元中的P物質 mRNA合成呈劑量依賴性增加,而這種作用可以被ER阻滯劑阻斷[18]。因此在子宮腺肌病中,除了自身和受體結合發揮作用外,雌激素還可能通過促進P物質表達的方式參與疼痛的發展。

因此,基于TRPV1、P物質和ER-α在子宮腺肌病疼痛發生發展中的協同作用,TRPV1的抑制在治療子宮腺肌病疼痛上可能更具優勢,除了直接抑制外周傷害性感受的傳遞,還可減少外周神經遞質,共同減弱疼痛致敏的發生。此外,雌激素抑制治療,亦能發揮抑制TRPV1的作用。抑制雌激素和TRPV1的雙聯治療,或許能夠顯著的緩解子宮腺肌病患者的疼痛癥狀。

本研究存在一定的局限性：(1)本研究樣本數量較少;(2)由于接受手術的子宮腺肌病患者多數伴有嚴重的痛經,可能存在一定的選擇偏倚。(3)本研究采用VAS評分對患者的痛經程度進行評估,可能存在回憶偏倚,并且對于疼痛的耐受程度,存在個體差異。(4)本研究從mRNA水平發現雌激素受體、P物質和TRPV1受體在子宮腺肌病病灶中表達升高,且和疼痛程度存在正相關性,但尚不能充分證明三者之間的相互作用和調節機制,需要更多對三者的相互調節機制的研究進行補充。

綜上,本研究發現TRPV1、P物質和ER-α在子宮腺肌病病中表達升高,與疼痛程度存在正相關性。子宮腺肌病中高雌激素環境促進P物質表達并增加TRPV1 的表達和敏感性,TRPV1和P物質相互促進,不斷增強傷害性感受器的作用,導致疼痛敏化。三者相互促進協同,參與疼痛的發生發展。上述結果為子宮腺肌病的疼痛相關機制的進一步研究提供了一些依據,并希望能為子宮腺肌病的疼痛治療帶來一些新的切入點。