乳酸菌發酵轉化人參皂苷Rg3工藝研究

嚴建剛,陸路,付少委,方磊,王雨晴,張新雪*

1(完美(廣東)日用品有限公司,廣東 中山,528400) 2(中國食品發酵工業研究院有限公司,北京市蛋白功能肽工程技術研究中心,北京,100015)

人參(PanaxginsengC.A.Meyer)為五加科多年生草本植物人參的根,是我國傳統的名貴中草藥,主要產于東北三省、河北、河南、湖北、云南等省份[1]。人參皂苷(Ginsenoside,GS)是人參皂苷元與糖基相連形成的三萜類化合物,主要分為原人參二醇型皂苷、原人參三醇型皂苷、齊墩果酸型人參皂苷[2]。作為人參生理活性的主要物質基礎,人參皂苷具有多種生理功能,尤其是稀有人參皂苷(rare ginsenosides)具有極高的藥用價值[3]。研究發現,稀有人參皂苷CK具有抗老化、護肝、抗炎、抗血栓等作用[4-5];稀有皂苷 Rh1具有增強記憶力、腦皮層神經細胞缺氧保護、抗過敏、降血糖等作用[6-8];稀有皂苷Rg3的分子式為C42H72O13,研究發現Rg3對肺癌實體瘤細胞具有較強的毒性作用,可以通過抑制肺癌細胞的增殖和轉移起到抗腫瘤的作用[9],Rg3還在調節中樞神經系統、降血糖、抗炎等方面有良好效果[9-10]。人參總皂苷含量約為4%[2],其中Ra1、Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rf、Rg1的含量占比超過95%,稀有皂苷含量極低[11],Rg3含量僅為0.000 3%～0.03%[3]。人參皂苷中的原有皂苷含量較高,但是不易被人體消化吸收,需要經過腸道菌群轉化為稀有皂苷才能發揮生理功能,因此國內外學者多采用化學法(酸解法、堿解法)[12-13]、生物法(酶解法、微生物轉化法)[14-15]將原有人參皂苷轉化為稀有人參皂苷,其中微生物轉化法具有成本低、綠色高效、副產物少等優點,備受關注。

乳酸菌是(lactic acid bacteria,LAB)是一類利用碳水化合物發酵產生大量乳酸的細菌,是人體腸道內重要的益生菌群,能夠維持腸道菌群平衡[16]、提高機體免疫力[17]、抑制膽固醇的吸收[18]。乳酸菌常用作酸奶、乳酪、泡菜及其他發酵食品的發酵劑,具有綠色高效、安全、副產物少等優點,在發酵制品領域應用非常廣泛,如已有研究者利用乳酸菌發酵枸杞汁、柿子、樹莓等[19-21]。乳酸菌也已經廣泛應用于稀有人參皂苷的轉化,劉濤[2]利用乳酸菌發酵人參,將原有皂苷轉化為稀有皂苷并探究其抗氧化能力,朱珺等[22]從78株植物乳桿菌中篩選具有人參皂苷轉化能力的菌株。目前植物乳桿菌是最常用的乳酸菌發酵劑。研究發現,乳酸菌能夠產生β-葡萄糖苷酶,β-葡萄糖苷酶能夠水解人參皂苷的β-葡萄糖苷,從而改變人參皂苷分子結構中所連接的糖苷配基,將原有皂苷轉化為活性更高、功能更強的稀有皂苷,提高稀有皂苷的含量,改善人參發酵產品風味,增強人參的生理功能,促進腸道吸收[3,23-24]。

本研究選擇唾液乳桿菌B19 WI2401、戊糖片球菌B06 WI2702、副干酪乳桿菌B16 WI2101、戊糖片球菌G16 WI7101、副干酪乳桿菌B16 WI2110、副干酪乳桿菌B16 NY2106、植物乳桿菌B16 NJ2201、副干酪乳桿菌B04 WI2501、副干酪乳桿菌B16 NY2107共9株菌對人參進行發酵,通過定向微生物轉化將人參原有皂苷轉化為稀有人參皂苷,以稀有人參皂苷Rg3含量為評價指標進行發酵工藝的優化,確定最適宜的發酵工藝,并分析發酵過程中人參皂苷生物轉化可能途徑,以期為人參發酵產品的開發和利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人參,完美(中國)日用品有限公司;菌株,中國食品發酵工業研究院有限公司;人參皂苷標準品,北京索萊寶科技有限公司;小麥水解蛋白(純度>95%),中國食品發酵工業研究院有限公司;乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純),默克股份兩合公司;乙酸銨(色譜級),上海阿拉丁生化科技股份有限公司;其他試劑均為分析純。

HZQ-211C恒溫培養箱,上海一恒科學儀器有限公司;1300 SERIES A2生物安全柜,賽默飛世爾科技(中國)有限公司;IKA T25勻漿機,德國IKA公司;pH211型精密pH計,HANNA公司;LC-MS/MS 8060—三重四級桿液質聯用儀液相色譜質譜聯用儀,日本島津公司;BLBIO-5GJ發酵罐,上海百侖生物科技有限公司;GZ-5高速離心機,德國Sigma離心機有限公司;KQ-250DE超聲儀,昆山市超聲儀器有限公司;LX-B50 L型滅菌鍋,合肥華泰醫療設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 人參原料基本指標檢測

采用GB 5009.5—2016測定蛋白質含量,GB 5009.6—2016測定脂肪含量,SN/T 4260—2015測定粗多糖含量,GB 5009.7—2016滴定法測定還原糖含量,GB 5009.88—2014測定總膳食纖維含量,GB 5009.4—2016測定原料灰分,GB/T 19506—2009測定人參總皂苷含量,采用pH211型精密pH計測定人參原料的pH值。

1.2.2 菌株培養

菌種保藏于-80 ℃,室溫解凍,以1%(體積分數)的接種比例接種于液體培養基中,(36±1) ℃條件下培養24 h,活化2代待用。

1.2.3 人參前處理

稱取一定量的人參,按照1∶20(g∶mL)的料液比添加100 ℃沸水浸泡后,溫度自然冷卻過夜。用剪刀將人參剪成2 cm小段,破碎打漿3 min,添加0.1%(質量分數)小麥水解蛋白粉作為氮源,蔗糖作為碳源,檸檬酸和碳酸鈣調整pH,115 ℃下滅菌20 min。

1.2.4 人參發酵

于生物安全柜中按照1%(體積分數)接種比例接種,置于30 ℃下發酵14 d,發酵結束后于沸水浴中滅菌30 min終止發酵,3 000 r/min離心10 min,取上清液待用。

1.2.5 人參皂苷HPLC定量方法建立

樣品制備:取人參上清液,用0.22 μm的過濾膜過濾,用50%(體積分數)甲醇水溶液稀釋50倍后待測。

方法建立:色譜柱為ACQUITY UPLC?HSS T3(2.1 mm×100 mm, 1.8 μm),流動相A為水溶液,B為5 mmol/L乙酸銨乙腈溶液。梯度洗脫程序:0～5.0 min,30%～50% B;5.0～8.0 min,50%～100% B;8.0～10.0 min,100% B;10.00～10.01 min,100%～30% B;10.01～12.00 min,30% B;流速0.4 mL/min;進樣體積1 μL;柱溫40 ℃。質譜條件:電噴霧離子源(electrospray ionization, ESI),負離子掃描模式;離子噴霧電壓為+4.5 kV;霧化氣流速為氮氣3.0 L/min;加熱氣流速為氮氣10 L/min;干燥氣流速為氮氣10 L/min;接口溫度250 ℃;加熱器溫度400 ℃;離子源溫度300 ℃。利用多反應監測(multiple reaction monitoring,MRM)進行Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rf、Rg1、Rg3、Rh1、Rh2、CK、F2 12種人參皂苷的參數優化。

標準曲線的確定:分別精密稱取12種人參皂苷標準品,用50%甲醇溶液溶解配制成10 μg/mL混合溶液,將該混合液稀釋成156.25、312.5、625、1 250、2 500、5 000、10 000 μg/L,以峰面積和標準品濃度做標準曲線。

樣品處理:取發酵前及終止發酵離心后的人參上清液,用0.22 μm膜過濾,稀釋50倍待測。

實驗方法精密度及穩定性:通過對同一濃度的樣品重復進樣和相同間隔時間段(8 h)分別進樣,計算各組數據的相對標準偏差(relative standard deviation,RSD,%),評價該方法的精密度和穩定性。

1.2.6 菌株篩選

單一菌株篩選:根據自有菌庫情況,選擇唾液乳桿菌B19 WI2401、戊糖片球菌B06 WI2702、副干酪乳桿菌B16 WI2101、戊糖片球菌G16 WI7101、副干酪乳桿菌B16 WI2110、副干酪乳桿菌B16 NY2106、植物乳桿菌B16 NJ2201、副干酪乳桿菌B04 WI2501、副干酪乳桿菌B16 NY2107共9株菌進行單一菌株篩選實驗,所選乳酸菌均為兼性厭氧菌。蔗糖添加量為2%(質量分數),初始pH值為5.62,添加0.1%(質量分數)小麥水解蛋白粉作為氮源,接種量為1%(體積分數),于30 ℃下發酵12 d。

復配菌株篩選:根據單一菌株發酵后Rg3的含量,選擇發酵效果最好的3株菌株,進行復配實驗研究。分別設計2個菌株復配和3個菌株復配共4組實驗,蔗糖添加量為5%(質量分數),初始pH值為5.62,添加0.1%小麥水解蛋白粉作為氮源,接種量為1%(體積分數)(菌種比例為1∶1或1∶1∶1),于30 ℃下發酵12 d,選擇發酵后Rg3的含量最高的菌株復配組合,確定發酵終點。

1.2.7 發酵工藝研究

1.2.7.1 單因素試驗

設計單因素試驗探究初始pH值、發酵溫度(℃)、蔗糖添加量(%,質量分數)對發酵工藝的影響,以發酵后Rg3的含量為評價指標,具體實驗參數如下:

設計接菌量為1%,接菌比例為1∶1,蔗糖添加量為5%,發酵溫度為30 ℃,pH值分別為3、4、5、6、7,探究初始pH值對于發酵效果的影響;

設計接菌量為1%,接菌比例為1∶1,蔗糖添加量為5%,pH值為6,發酵溫度為25、30、35、40、45 ℃,探究發酵溫度對發酵效果的影響;

設計接菌量為1%,接菌比例為1∶1,pH值為6,發酵溫度為30 ℃,蔗糖添加量為3%、5%、7%、9%、11%探究蔗糖添加量對發酵效果的影響。

1.2.7.2 響應面優化實驗

在單因素試驗的基礎上,以初始pH值、發酵溫度、蔗糖添加量為考察因素,采用Box-Benhnken中心組合設計3因素3水平的響應面實驗,以人參發酵后Rg3含量為響應值,分析影響人參發酵各因素的交互作用,確定最佳工藝條件。中心組合實驗水平如表1所示。

表1 中心組合實驗水平表

1.3 數據分析

采用Design Expert 12進行響應面分析,Origin 8.5和SPSS 18.0進行數據處理和分析,每個處理3組平行,實驗數據表示為平均數±標準偏差。

2 結果與分析

2.1 人參原料基本成分分析

稱取一定量的人參原料,破碎磨粉,過80目篩,測定基本成分,結果如表2所示。其中總皂苷含量為(3.12±0.58) g/100 g,約為3.12%;稀有皂苷Rg3含量為(0.012±0.006) g/100 g,約為0.012%。研究發現,人參總皂苷含量約為4%,其中Rg3含量約為0.000 3%～0.03%,說明本原料中稀有皂苷Rg3含量極低,乳酸菌的轉化作用對于稀有皂苷Rg3含量的提升十分重要。測得人參原料前處理的pH值為5.60±0.24,乳酸菌適合生長繁殖的pH值在4～6左右,這說明人參原料前處理后的pH值適合乳酸菌生長,可用于菌株篩選實驗研究。本研究中采用的乳酸菌最適pH值將在工藝實驗中進行確定。

表2 人參原料基本成分 單位:g/100 g

2.2 人參皂苷定量及方法驗證

測定人參發酵前后的Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rf、Rg1、Rg3、Rh1、Rh2、CK、F2共12種人參皂苷,根據標準品保留時間、前體離子和產物離子信息進行定量分析。選取156.25、312.5、625、1 250、2 500、5 000、10 000 μg/L共7個質量濃度繪制標準曲線,確定線性范圍。選擇混標中的同一質量濃度(5 000 μg/L)進行重復進樣(n=6),計算RSD,用于評價方法的精密度;選擇混標中的同一質量濃度(5 000 μg/L)進行相同間隔時間段(8 h)的重復進樣(n=6),計算RSD,用于評價方法的穩定性,結果如表3所示。本研究方法的精密度良好,在48 h內保持穩定。

表3 十二種人參皂苷定量方法參數及驗證

2.3 菌株及其復配方案篩選結果

2.3.1 菌株篩選

本研究中采用唾液乳桿菌B19 WI2401、戊糖片球菌B06 WI2702、副干酪乳桿菌B16 WI2101、戊糖片球菌G16 WI7101、副干酪乳桿菌B16 WI2110、副干酪乳桿菌B16 NY2106、植物乳桿菌B16 NJ2201、副干酪乳桿菌B04 WI2501、副干酪乳桿菌B16 NY2107共4種菌種9個菌株進行單一菌株篩選,以Rg3含量為評價指標,結果如圖1所示。結果顯示,隨著發酵時間的延長,Rg3含量升高,說明所選菌株均有轉化作用,能夠提高Rg3含量。發酵第8～10天時,菌株B16 NY2107和B04 WI2501發酵液中Rg3含量明顯高于其他組,發酵第12天時,菌株B16 NY2107、B16 WI2110和B04 WI2501發酵液中Rg3含量最高,分別達到(915.03±100.42)、(895.94±17.62)、(871.59±88.28) μg/L,且三者之間無顯著性差異,這說明本研究中副干酪乳桿菌B16 NY2107、B16 WI2110、B04 WI2501對人參稀有皂苷Rg3的轉化效果最好。劉濤[2]以市售人參提取物(易溶于水)為原料,選用植物乳桿菌GIM1.648、嗜酸乳桿菌GIM1.731、干酪乳桿菌GIM1.204、副干酪乳桿菌BNCC195633和發酵乳桿菌GIM1.985共5種菌種進行人參皂苷生物轉化及發酵工藝研究,發現植物乳桿菌GIM1.648產生β-葡萄糖苷酶的活性最高,其轉化人參稀有皂苷F2、Rg3、CK能力最強。張倩等[25]總結了植物乳桿菌、發酵乳桿菌、腸膜明串珠菌、鼠李糖乳桿菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種和德氏乳桿菌乳亞種生物轉化人參有效成分的能力,發現不同菌株對人參皂苷轉化效果不同,同一菌株對不同來源的人參原料中皂苷轉化效果也不同,這說明菌株的轉化能力及原料來源具有差異性。本研究選擇Rg3轉化效果最好的副干酪乳桿菌B16 NY2107、B16 WI2110和B04 WI2501進行后續菌種復配研究。

2.3.2 復配實驗結果

人參皂苷分子結構中連接的糖苷配基不同,皂苷種類也不同。乳酸菌轉化人參皂苷的能力取決于其產生β-葡萄糖苷酶的能力,β-葡萄糖苷酶能夠水解人參皂苷的β-葡萄糖苷,從而將原有皂苷轉化為稀有皂苷[3,23-24]。單一菌株轉化人參皂苷的能力取決于單一菌株產生β-葡萄糖苷酶的能力,而復合菌株轉化人參皂苷的能力則取決于復合菌株之間的協同作用。復合菌株之間協同,可以促進反應體系中酶的多樣化和互補性,充分分解、溶出和利用人參組織中的有效成分和營養物質,從而提高稀有皂苷轉化能力。LEE等[26]利用釀酒酵母、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、短乳桿菌、枯草芽孢桿菌組合菌發酵轉化人參稀有皂苷Rh1、F2、Rg3、CY,發現轉化率最高可分別達127.3%、63.5%、255.8%、226.6%[26]。AH等[27]利用植物乳桿菌KK-1和發酵乳桿菌KK-2混合發酵,發現復合菌株比單一菌株發酵效果更好,混合發酵轉化率達41%。但是菌株之間也會存在拮抗作用,不同菌株生長過程中產生競爭性抑制,皂苷轉化能力下降,薛兢兢[28]研究發現復合菌(乳桿菌+酵母菌)發酵效果不如單一乳桿菌株,這說明復合菌株發酵要綜合考慮菌株生長之間的協同作用和拮抗作用。

根據單一菌株發酵后稀有皂苷Rg3含量,對所選擇的B16 NY2107、B04 WI2501、B16 WI2110進行復合菌發酵,復配組合分別為B16 NY2107+B04 WI2501、B16 NY2107+B16 WI2110、B04 WI2501+B16 WI2110、B16 NY2107+B04 WI2501+B16 WI2110。蔗糖添加量為5%,接種量為1%(體積分數)(菌種比例為1∶1或1∶1∶1),于30 ℃下發酵12 d,確定發酵終點和復合方案,結果如圖2所示。隨著反應時間的延長,B16 NY2107+B04 WI2501、B16 NY2107+B16 WI2110、B04 WI2501+B16 WI2110實驗組呈現先上升后下降趨勢,這可能是因為發酵過程中,部分原有皂苷轉化為Rg3的同時,Rg3也在發生降解,Rg3定量是綜合原有皂苷轉化作用和降解作用后的含量。B16 NY2107+B04 WI2501在發酵第9天,Rg3含量最高,達到(1 784.81±61.62) μg/L;B16 NY2107+B16 WI2110和B04 WI2501+B16 WI2110復配組合發酵第9天和第10天無顯著性差異,發酵后Rg3含量分別達到(1 410.15±84.3)、(1 384.06±48.96) μg/L和(1 425.96±71.46)、(1 496.21±21.75) μg/L。而3個菌株復合組B16 NY2107+B04 WI2501+B16 WI2110發酵后,Rg3含量呈現逐漸上升趨勢,發酵12 d時含量達到最高,為(1 260.39±41.60) μg/L,這可能是由于3個菌株生長過程中的抑制作用,產生β-葡萄糖苷酶的能力下降,稀有皂苷Rg3轉化能力下降。綜上,最終復合菌株方案選擇分離自乳制品的副干酪乳桿菌B16 NY2107和分離自動物源固體飲料的副干酪乳桿菌B04 WI2501,發酵時間為9 d。

圖2 復配菌株發酵后Rg3含量

2.4 發酵工藝單因素試驗優化結果

2.4.1 初始pH值對發酵效果的影響

研究發現,乳酸菌在較酸環境下可以正常生長繁殖,最適于中性環境或者弱酸環境[29]。利用碳酸鈣和檸檬酸調整人參發酵液的初始pH值為3、4、5、6、7,探究初始pH值對人參稀有皂苷Rg3轉化作用的影響,結果如圖3所示。隨著pH值的增加,Rg3含量呈現先上升后下降的趨勢,pH值在4～6時發酵效果較好。乳酸菌在發酵過程中產生乳酸的含量是衡量乳酸菌發酵程度的重要指標[20],而乳酸含量是影響反應體系pH值最主要的因素,當反應體系偏中性或堿性時,乳酸菌產生的乳酸主要用于中性和堿性環境,乳酸菌生長較為緩慢;當pH值過低時,酸性環境會抑制乳酸菌的生長,也會抑制β-葡萄糖苷酶的活性,人參皂苷轉化效果較差。因此,選擇初始pH值為3～5進行響應面實驗優化發酵工藝。

圖3 初始pH值對發酵后Rg3含量的影響

2.4.2 發酵溫度對發酵效果的影響

選擇發酵溫度為25、30、35、40、45 ℃,探究發酵溫度對乳酸菌轉化Rg3能力的影響,結果如圖4所示。隨著發酵溫度的升高,Rg3含量呈現先上升后下降的趨勢,發酵溫度為40 ℃時,Rg3含量最高,為(1 428.48±20.19) μg/L。研究發現,發酵溫度對微生物的新陳代謝十分重要,溫度高低直接影響菌體活性[30],且會影響發酵產品的風味和口感[21],因此,選擇35～45 ℃的發酵溫度進行響應面實驗優化發酵工藝。

圖4 發酵溫度對發酵后Rg3含量的影響

2.4.3 蔗糖添加量對發酵效果的影響

碳源是乳酸菌生長繁殖的必要條件,蔗糖添加量影響乳酸菌的生長繁殖,進而影響人參稀有皂苷的轉化效果。選取蔗糖添加量為3%、5%、7%、9%、11%探究蔗糖添加量對乳酸菌轉化人參皂苷Rg3能力的影響,結果如圖5所示。隨著蔗糖添加量的增大,Rg3含量呈現先上升后下降的趨勢,當蔗糖添加量為7%時,Rg3含量最高,達到(1 768.29±75.64) μg/L。蔗糖添加量是微生物生長繁殖的重要影響因素,蔗糖添加量過低時,營養物質缺乏,乳酸菌生長緩慢,發酵終點延長;蔗糖添加量過高時,會導致反應體系滲透壓增高,進而影響乳酸菌的生長和代謝[20]。此外,研究發現蔗糖添加量也會影響發酵后產品的口感,一般蔗糖添加量為7%～9%時,發酵產品感官評分較高[31],選擇5%～9%的蔗糖添加量進行響應面實驗優化發酵工藝。

圖5 蔗糖添加量對發酵后Rg3含量的影響

2.5 發酵工藝響應面實驗優化結果

根據單因素試驗結果,設計初始pH值、發酵溫度、蔗糖添加量3因素3水平實驗探究各影響因素對Rg3轉化效果的影響。根據Box-Behnken 試驗設計方案,以人參稀有皂苷Rg3含量(Y)為響應值共17個試驗點,實驗設計及結果如表4所示。

表4 響應面實驗結果

采用Design Expert 8.0.6軟件擬合回歸多項參數,得到人參稀有皂苷Rg3含量(Y)對初始pH值(A)、發酵溫度(B)、蔗糖添加量(C)的二次多項回歸模型方程:Y=1 709.96+315.67A-4.83B+195.26C-100.78AB+71.61AC-20.01BC-169.47A2-407.61B2-534.36C2。

對回歸模型進行方差分析,分析結果如表5所示。根據實驗數據得到的回歸模型P<0.01,模型極顯著;失擬項P=0.23>0.05,模型失擬項不顯著;R2=0.945 7,說明本次試驗的模型相關度較好,置信度較高,可以用于分析和預測工藝條件。各項因素中,一次項A對Rg3含量有極顯著影響(P<0.01),C對于Rg3含量有顯著影響(P<0.05);二次項B2、C2均對Rg3含量有極顯著性影響(P<0.01),其他項對發酵后人參稀有皂苷Rg3含量無顯著影響(P>0.05)。綜合F值結果,在所取因素水平范圍內,各種因素對發酵后人參稀有皂苷Rg3含量的影響順序為A(pH值)>C(蔗糖添加量)>B(發酵溫度)。

表5 以Rg3含量為響應指標的回歸模型方差分析

各因素間的交互作用對人參稀有皂苷Rg3轉化效果的響應面圖和等高線如圖6所示。響應面圖中坡度梯度越大,顏色變化越明顯,說明該因素對響應值的影響作用越顯著。隨著發酵溫度、蔗糖添加量的增加,人參稀有皂苷Rg3的含量均呈現出先增加至拋物線最高點再下降的趨勢;而隨著初始pH值的增加,人參稀有皂苷Rg3的含量呈現逐漸上升的趨勢。其中初始pH值和發酵溫度的響應面圖坡度最大,說明這兩個影響因素的交互作用最顯著。各影響因素交互作用的等高線呈現橢圓形或者馬鞍形時,兩因素交互作用顯著,呈現圓形時兩因素交互作用不顯著[32],根據等高線圖可知,初始pH值和發酵溫度、初始pH值和蔗糖添加量的交互作用均強于發酵溫度和蔗糖添加量的交互作用。

a-初始pH值和發酵溫度;b-初始pH值和蔗糖添加量;c-發酵溫度和蔗糖添加量

綜上分析,利用Design Expert 8.0.6軟件得出Rg3含量最高(1 896.98 μg/L)的工藝參數為pH值5.0、發酵溫度39.33 ℃、蔗糖添加量7.51%。但是各條件在有限范圍內進行微調,對Rg3含量影響較小。考慮實際工藝條件,選擇發酵最優條件為初始pH值5.0、發酵溫度39.0 ℃、蔗糖添加量7.5%。在最優參數下進行5組驗證實驗,測得Rg3含量為(1 859.62±63.75) μg/L[即(92.981±3.188) mg/L人參發酵液],與理論值接近,該模型得到的優化參數準確性較高。

2.6 發酵過程中人參皂苷生物轉化可能途徑分析

在最優工藝下,測定人參發酵前后12種人參皂苷含量,所得結果如圖7所示。

圖7 發酵前后人參皂苷的含量

12種人參皂苷中,Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rf、Rg1經過發酵含量均呈現下降趨勢,分別降低68.36%、62.03%、70.94%、63.12%、89.30%、38.01%、80.57%。而Rg3、Rh1、Rh2、CK含量均呈現上升趨勢,其中Rg3和Rh1含量提升最為明顯,提高倍數均高于10倍。人參原料中Rh2、CK、F2含量較低,F2在發酵前后含量變化不明顯。這說明經過乳酸菌發酵作用,有部分原有皂苷轉化成稀有皂苷Rg3、Rh1、Rh2、CK。人參皂苷分子結構中所連接的糖苷配基不同,皂苷種類也不同,稀有人參皂苷和原有皂苷結構相比,C3、C6、C20位置上糖基的類型或數目不同,從而生理活性更強。乳酸菌發酵過程中產生的β-葡萄糖苷酶能夠水解人參皂苷結構中C3、C6、C20位置上的糖基,將原有皂苷轉化為稀有人參皂苷[33]。劉濤[2]發現植物乳桿菌產生的β-葡萄糖苷酶能夠水解C3、C20位置上的糖基,實現原人參二醇型皂苷Rb1/Rb2→Rd→F2→CK和Rb1→Rd→Rg3的轉化,因此Rb1、Rb2、Rd含量降低而Rg3、F2、CK含量升高。此外人參皂苷Rh1是三醇皂苷型Re、Rg1的次級代謝產物之一,故Re、Rg1濃度降低而Rh1濃度升高[2]。這與本研究結果一致。根據二醇型人參皂苷轉化機理,Rh2可以通過Rb1/Rc→Rd→Rg1→Rh2途徑進行轉化[2]。趙彩秀等[34]發現枯草芽孢桿菌產生的β-葡萄糖苷酶能夠斷裂Rb1 C20位上的糖苷鍵生成Rg3。陳玲[35]發現鼠李糖乳桿菌產生的β-葡萄糖苷酶能夠將原人參三醇型皂苷Re的C6、C20位分別脫去一分子鼠李糖和葡萄糖生成Rh1。夏晚霞等[3]利用乳酸菌發酵人參皂苷發現轉化主要為Rb1→CK、Re→CK、Rb1→Rh1、Re→Rh1、Rb1→Rd→F2→Rg3→CK 5種途徑,且該轉化途徑與發酵過程中皂苷含量變化一致。綜上,本研究發酵過程中人參皂苷生物轉化可能途徑為Rb1/Rb2→Rd→Rg3、Rb1/Re/Rg1→Rh1、Rb1/Re→CK、Rb1→Rd→F2、Rb1/Rc→Rd→Rg1→Rh2。

3 結論與討論

本研究選用9株乳酸菌進行人參發酵,以發酵后稀有人參皂苷Rg3含量作為評價指標,篩選出副干酪乳桿菌B16 NY2107、B16 WI2110、B04 WI2501共3株發酵效果較好的單菌株后進行菌株間的復合菌發酵,確定最優復合菌組合為副干酪乳桿菌B16 NY2107和B04 WI2501,發酵時間為9 d,接種量為1%,接種比例為1∶1。利用單因素試驗和響應面實驗進行發酵工藝優化,確定最優發酵工藝為初始pH值5.0,發酵溫度39.0 ℃,蔗糖添加量7.5%,此條件下人參發酵后發酵液中Rg3含量為(92.981±3.188) mg/L,較發酵前含量提高14.86倍,所選擇的乳酸菌及復合方案發酵效果良好,說明菌種及其復配方案、最優條件的選擇對人參皂苷轉化程度非常重要。對本研究發酵過程中人參皂苷生物轉化可能途徑進行分析,人參皂苷生物轉化可能途徑為Rb1/Rb2→Rd→Rg3、Rb1/Re/Rg1→Rh1、Rb1/Re→CK、Rb1→Rd→F2、Rb1/Rc→Rd→Rg1→Rh2。綜上,乳酸菌發酵轉化人參皂苷是一種綠色環保、安全高效的生物轉化方法,具有廣泛的應用前景,未來可進一步進行擴大菌株及其復配方案、最優發酵工藝的選擇,促進乳酸菌發酵技術在人參皂苷轉化領域的應用,同時需加強發酵過程皂苷定量研究,以明確人參發酵過程中皂苷的轉化機理。本研究確定了發酵過程中的菌株、復合方案及發酵工藝,并對可能的生物轉化途徑進行分析,以期為乳酸菌在稀有人參皂苷轉化研究中的利用及人參發酵產品的開發提供參考。