葡萄果實成熟軟化機制研究進展※

●朱紹坤 喬 軍 馬 麗※※

（1.遼寧省果樹科學研究所 遼寧 營口 115009；2.遼寧農業職業技術學院 遼寧 營口 115009）

葡萄屬于典型的非呼吸躍變型果實[1]。果實軟化發生時間比呼吸躍變型果實要早，且由于其為漿果，果實皮薄，汁多，在食用、運輸貯存過程中易發生破裂、腐爛等問題。因此，果實軟化程度已成為判斷鮮食葡萄果實新鮮程度的一個重要指標。隨著葡萄果實成熟軟化，果實質地發生一系列變化，當前研究普遍認為果實成熟軟化是由多種細胞壁水解酶、調節蛋白相互作用引發的。不同葡萄品種間果實質地存在較大差異，脆肉型品種一直備受關注，現已成為重要的育種材料及目標品種[2]。然而造成不同品種間質地差異的機制還不清楚。因此，了解葡萄果實成熟軟化調控機制，對于葡萄綜合品質改良有著非常重要的意義。本文介紹了葡萄細胞壁中果膠組成及其分子結構，綜述了葡萄軟化過程中果膠、纖維素和半纖維素等成分的含量變化，歸納了葡萄果實軟化時細胞壁降解酶基因表達水平變化，總結了轉錄組和QTL 定位在果實軟化方面的應用進展，以期為葡萄新品種選育及保鮮貯運研究提供參考。

1 果實成熟軟化與細胞壁結構和組分關系

軟化是果實成熟的主要特征之一，直接影響果品的貯運品質和貨架期，不同樹種和品種的果實都需要一定程度的軟化，然而過度軟化則會造成采收后腐爛甚至失去商品性[3]。果實在軟化過程中，細胞壁組分和結構發生了復雜的變化[4]。肉質果實初生壁主要由35%的果膠、25%的纖維素、20%的半纖維素和10%的結構蛋白組成[5]。從結構上看，纖維素微纖絲構成了細胞壁的剛性骨架，果膠、半纖維素和糖蛋白組成的矩陣多糖嵌入在骨架中，各組分間相互聯系，使細胞壁成為一個非常復雜的動態復合體。果實在成熟軟化過程中各組分降解，復合體結構發生改變，細胞間隙變大。細胞壁內部結構的破壞是導致果實軟化的直接原因[6]。

1.1 纖維素和半纖維素

纖維素是植物細胞壁的主要成分，它通過纖維素合酶復合體在細胞質膜上形成，大約2000個纖維素分子可通過鏈間氫鍵組成一個微纖絲，再通過木糖-纖維素微纖維構成細胞壁的網絡骨架[7]。半纖維素也是初生壁的主要成分，是由木糖、阿拉伯糖和半乳糖等不同類型單糖以共價鍵、氫鍵、醚鍵和酯鍵連接構成的異質多聚體，各種單糖又形成不同的主鏈和側鏈。有研究認為纖維素與果實成熟軟化有關，但并非關鍵因子，而半纖維素結構變化與果實軟化密切相關，是果實質地變化的重要因子[8]。張群等[9]研究發現葡萄在采后貯藏過程中的自溶軟化與細胞壁代謝密切相關，纖維素和半纖維素含量顯著降低，內果皮的超微結構被破壞。

1.2 果膠

果膠是植物細胞壁的重要組成部分之一，是細胞壁網絡骨架之間的交聯物，發揮著細胞緩沖的功能。果實成熟軟化過程中，果實中的果膠物質由難溶的原果膠降解為可溶性果膠，其形態、組分發生了明顯變化，細胞間的黏著力下降，果實質地變軟。管雪強等[10]研究發現葡萄果實成熟軟化時，果膠發生降解，可溶性果膠含量增多，而共價結合、離子型果膠含量減少。

2 果實成熟軟化與細胞壁降解酶的關系

果實細胞壁是一個動態的網絡結構，果實在成熟軟化過程中，細胞壁水解酶單獨或與蛋白質協同作用，引發中性糖損失，木葡聚糖解聚，細胞壁松弛[4]。參與細胞壁降解的酶主要包括果膠酶、纖維素酶和半纖維素酶，研究表明至少有30余種酶參與果實的成熟軟化過程。

2.1 果膠甲酯酶

果膠甲酯酶（PME）是植物中廣泛存在的第八類碳水化合物酯酶家族，參與眾多的生理生化活動。果膠甲酯酶可去除果膠半乳糖醛酸殘基C-6 酯化基團，從而生產帶負電荷的果膠酸。帶負電的果膠酸又以2 種形式調控細胞壁代謝：第一種形式，細胞壁中富含Ca2+，果膠酸與Ca2+相互作用，形成果膠鈣，從而改變細胞壁的結構和理化性質，抑制其他果膠酶對其進行水解作用；第二種形式，果膠酸不與Ca2+作用，而直接成為PG、PL 酶的作用底物，果膠降解，細胞壁結構改變，果實軟化[11]。近年來，有關葡萄果實軟化與果膠甲酯酶活性及基因表達關系已有報道。Balic 等研究發現脆肉型葡萄品種“NN107”在果實發育P1（轉色期）、P2、P3 時期PME 活性一直處于較高水平，P4（成熟期）迅速降低，軟肉型品種“湯姆遜無核”在P1-P3 時期PME 活性逐漸升高，在P4 降低，且脆肉“NN107”中PME 活性一直高于“湯姆遜無核”中的活性，并結合2個品種細胞壁中鈣含量，推測脆肉品種中較高的PME 活性有利于增加鈣橋的形成，提高果實硬度[12]。Deytieuxbelleau 等[13]發現在“赤霞珠”葡萄果實生長發育過程中PME 酶活性與PME 基因表達不同步，PME 隨著果實成熟表達量增加，得出PME 基因可能通過去甲酯化增加了其他細胞壁降解酶接觸底物的機會，促進果實成熟。

2.2 多聚半乳糖醛酸酶

多聚半乳糖醛酸酶（PG）是第一個在番茄中利用轉基因方法檢測的水解酶，也是較早被發現在果實軟化過程中對細胞壁降解起作用的水解酶[14]。它可以催化斷裂未酯化的果膠主鏈上α-1，4 糖苷鍵，促使果膠降解，果實軟化。植物PGs 是一個基因家族，根據作用方式不同，可分為內切PG（endo-PG）和外切PG（exo-PG）。內切PG 對底物的特異性較強，主要表現為隨機裂解，而外切PG 對底物的特異性較弱，表現為依次水解聚糖鏈的非還原末端。有關PG 酶如何調節葡萄果實的成熟軟化過程，研究發現軟肉葡萄“湯姆遜無核”果實中PG 酶活性隨著果實成熟逐漸升高，而脆肉果實PG 酶活性呈現相反趨勢，得出PG 活性不同是造成葡萄果實質地差異的重要原因，只是在果實的軟化過程中起到一定作用，但PG 基因誘導果實軟化的機理還不是很清楚，有待于進一步研究[13]。

2.3 果膠裂解酶

果膠裂解酶（PL）是通過β-反式消除作用切割α-1，4 糖苷鍵，降解去甲酯化的果膠產生寡聚糖，參與果實成熟軟化過程[15]。Nunan 等[16]發現葡萄果實中編碼PL 酶基因在果實成熟時顯著高表達，參與果膠多糖溶解，促進果實軟化，認為PL 基因可能是調節果實成熟軟化的一類重要的候選基因。

2.4 β-半乳糖苷酶

β-半乳糖苷酶（β-Gal）是一類糖苷水解酶，在植物中廣泛存在。主要作用于具有半乳糖殘基支鏈的鼠李糖半乳糖醛酸聚糖Ⅰ，切除β-D-半乳糖殘基，從而使細胞壁多糖降解或溶解，果實軟化[5]。近年來，研究者已在很多作物上發現了β-Gal 的同源基因，并對這些同源基因的表達模式進行分析，β-Gal 表達模式大致分為四種：第一種，表達量逐漸升高，果實成熟時達到最高水平；第二種，表達量在發育前期較高，開始成熟后表達量下降；第三種，表達量在果實整個生長發育過程中一直處于較高水平；第四種，表達量一直處于非常低的水平。目前普遍研究認為第一種表達模式的基因與果實成熟軟化關系密切[17]。有關β-Gal 酶在葡萄果實成熟軟化作用，研究者得出β-Gal 活性隨著果實的成熟軟化而增強，活性與葡萄果實硬度負相關，并對果實硬度起到了非常重要的作用[18]。

2.5 果實成熟軟化與擴展蛋白與轉錄因子的關系

植物細胞壁中發現了一種沒有水解酶或轉糖基酶活性的細胞壁定位蛋白，擴展蛋白（EXP）。前人在壓力松弛試驗中發現，擴展蛋白可導致細胞壁松弛[19]。也有研究發現擴展蛋白可以破壞纖維素-半纖維素界面上非共價鍵，解鎖網絡，使細胞壁松弛[20]。Ishimaru 等[21]從“巨峰”葡萄果實中分離出Vlexp1-3 三種擴展蛋白，發現Vlexp3 在果實中特異性表達，且轉色期表達量明顯增加，并推測Vlexp1-3 基因可以與VXET1 協同作用，裂解細胞壁的纖維素-木葡聚糖網絡，使“巨峰”葡萄果實在轉色期變軟。

近年來，有關轉錄因子調控果實成熟軟化的研究也日益增多，研究表明LBD[22]，NAC[23]，MADS-box[24]，ERF[25]，bHLH[26]等 轉 錄 因 子 都 參與了果實的成熟軟化過程。

3 轉錄組測序技術在葡萄果實成熟軟化研究中的應用

RNA-seq 又稱全轉錄組鳥槍法測序，是以高通量測序技術為基礎的，可以便利地從整體水平上獲得基因表達情況的測序方法。RNA-seq已經成為生命科學中研究基因表達水平最常用的方法，現幾乎應用于植物科學的各個領域[27]。Wong 等[28]以果實硬度存在差異的“梅鹿輒”果實為試材，通過轉錄組分析發現17 個與細胞壁降解相關的基因在大果型“梅鹿輒”中較在小果型中顯著高表達，推測這可能是造成大果型葡萄的軟化速率高于小果型的主要因素。Balic 等[12]對“湯姆遜無核”葡萄不同發育時期果實進行轉錄組測序，發現隨著果實的成熟與軟化，細胞壁降解相關的基因表達水平顯著提高，認為果實硬度降低可能與這些基因的高表達有關。Wei 等[29]對“夏黑”及其早熟芽變“天工墨玉”5 個不同發育時期果實進行轉錄組測序，篩選到多個可能加速果實成熟軟化的關鍵基因。

4 QTL 定位在葡萄果實成熟軟化及質地研究中的應用

葡萄果實成熟軟化后的質地是影響果實品質的關鍵因素，近年來有關葡萄果實質地的QTL 定位已有一些報道，但相對其他性狀而言，研究進展較慢。Carreno 等[30]分別以2 個分離群體構建圖譜，首次定位到與果實硬度相關7 個QTL 位點，分別位于第1，4，5，9，10，13 和18 號連鎖群上，這些位點中，最高可解釋19?8%的表型變異，所有QTL 位點共解釋44?5%的表型變異。Correa 等[31]以“紅寶石無核”和“無核白”雜交的137 株后代構建遺傳圖譜，鑒定到2 個與果實硬度相關的QTL 位點，分別位于第8 和第18號連鎖群上，2 個QTL 位點共同解釋表型變異的27?6%，置信區間為10 cM，其中位于LG8 的QTL位 于 標 記UDV125 和VMCNG2H2?2 之 間，解 釋表型變異的15?6%，LG18 上的QTL 位于VVIN16標記和VVCSIE103N17FMI 標記之間，可解釋表型變異的15?6%。Ban 等[32]在第3 和第10 連鎖群上發現了2 個與果實硬度相關的QTL 位點，3號連鎖群的QTL 位于VMC2E7 標記附近，解釋表型變異的15?7%，10 號連鎖群上的QTL 位于標記VVIH01 和標記UDV073 的中間區域，解釋表型變異的14?4%，經連續四年鑒定發現3 號連鎖群上的QTL 位點比10 號連鎖群上的位點更加穩定。Jiang 等[33]利用區間作圖法在18 號連鎖群上鑒定到了3 個與果實硬度相關的QTL 位點，命名為qBF18-2016，qBF18-2017 和qBF18-2018， 分別解釋了22?3%、21?5%和28?6%的表型變異。

5 總結

葡萄果實軟化程度是衡量其鮮食品質的一個重要指標，同時也是重要的育種指標，然而果實軟化及不同質地形成是個非常復雜的生理生化過程，與細胞壁組分及細胞壁降解酶活性密切相關，是由多基因控制的數量性狀，不僅受基因型和遺傳因素影響，也與環境因素密切相關。在今后研究中，要針對不同軟化類型果實進行軟化機制研究，應從組學入手，篩選與果實成熟軟化及果實質地形成相關的基因及代謝通路，發掘相關的候選基因，開發分子標記，為今后葡萄品質育種和貯藏保鮮技術研究提供理論參考。