微RNA-24過表達對缺血性腦梗死大鼠的腦保護作用及對神經細胞凋亡的影響

陳輝，趙春水，張春偉，劉欣

缺血性腦梗死（ischemic cerebral infarction，ICI）是常見的腦血管疾病，致死率、病死率均較高，且發病率逐漸升高［1］。目前超早期溶栓是治療ICI的最佳方式，但其受治療時間窗限制，且易并發腦出血，臨床應用受到限制［2］。因此，探尋更為有效的ICI治療方式備受關注，而基因治療被認為是該病有希望的治療途徑之一。ICI的治療原則在于保護缺血半暗帶神經細胞，減少其凋亡，以盡早恢復缺血區域供血，挽救瀕死腦組織，故基因抗凋亡成為ICI實驗研究熱點之一［3］。微RNA（miRNA/miR）是由18～25個核苷酸構成的內源性非編碼RNA，其不編碼蛋白質，通過調控基因轉錄后水平參與蛋白表達，從而促進mRNA降解或抑制蛋白翻譯過程。目前已經發現miRNA在多種中樞神經系統疾病如ICI中發揮著重要作用［4］。有學者指出，miR-24在急性腦梗死病人中低表達，且可作為該病進展的生物標志物，為ICI基因治療提供了思路［5］。2020年1月至2022年1月，本研究通過建立ICI大鼠模型，分析miR-24過表達對其腦保護作用及對神經細胞凋亡的影響，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 45只SPF級SD雄性大鼠，6周齡，體質量（200±10）g，購自北京科宇動物養殖中心，動物生產許可證號：SCXK（京）2018-0010，動物使用許可證號：SYXK（豫）2020-0002。自由進食、飲水，溫度22～26 ℃，12 h/12 h明暗交替，適應性飼養1周。本研究符合一般動物實驗倫理學原則。

1.1.2 主要試劑和儀器 含有miR-24激動劑miR-24 agomir、miR-24抑制劑miR-24 antagomir、陰性對照（negative control，NC）序列的pcDNA 3.0質粒（蘇州吉瑪基因股份有限公司）；SYBR Green熒光定量染料法試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司）；2% TTC染色液（上海信帆生物科技有限公司）；兔抗鼠神經元核抗原（neuronal nuclei antigen，NeuN）、B細胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相關X蛋白（Bax）一抗（美國Abcam公司）。

StepOne Puls實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRT-PCR）儀（美國Applied Biosystems公司）；Synergy-HD顯微鏡（日本Toshiba公司）；Mini Protean 3 Cell小型垂直電泳（美國伯樂公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組及立體定向注射 45只大鼠以隨機數字表法分為健康組（8只）、腦梗死組（9只）、腦梗死過表達組（9只）、腦梗死低表達組（9只）、腦梗死NC組（10只）。選取接近腦缺血半暗帶皮質位置、距離腦梗死內緣0.5～1.0 mm處注射。戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，將其固定于立體定向儀上，消毒腦部頂部皮膚并清除毛發，在兩耳中點向后3 cm切口，逐層分離皮下組織，暴露前囟、矢狀縫、右側顱骨表面，選取兩個注射點，注射點1：前囟前1.7 mm，矢狀縫右側3.8 mm，深2.8 mm。注射點2：前囟后3.3 mm，矢狀縫右側3.8 mm，深2.3 mm。用胰島素針吸取腺病毒，在腦梗死過表達組、腦梗死低表達組、腦梗死NC組兩個注射點分別注射miR-24 agomir、miR-24 antagomir和miR-24陰性對照序列，注射速度1 μL/min，總量10 μL。注射完成后撤出針頭，采用骨蠟將顱骨孔道封閉，縫合頭皮。健康組與腦梗死組同法、同位置、同量注射生理鹽水。

1.2.2 模型建立［6］立體定向注射后24 h采用改良Longa線栓法建立ICI模型。戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，鈍性分離右側頸部肌群，分離、結扎右頸總動脈、頸外動脈與分支。距離頸總動脈1 cm位置采用1 mL注射液針頭將右頸總動脈上壁分離刺破，將尼龍線從頸總動脈插入內動脈，感受到阻力停止，深度18～20 mm，線栓即到達并阻塞大腦中動脈開口處，扎緊動脈殘端，常規縫合、消毒。健康組將阻塞線插入頸內動脈深度約5 mm，其余步驟同上。大鼠清醒后單籠飼養，采用Zea-longa神經功能評價方法評價神經功能，評分范圍為0～4分，1、2、3分提示建模成功，0、4分剔除。最終各組均納入8只。建模成功后1、3 d采用Zea-longa神經功能評價方法評價大鼠神經功能。

1.2.3 組織取材 神經功能評價完成后，戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，剪開胸廓，鑷子輕固定心臟，輸液針頭插進左心室，剪開右心房，迅速推注多聚甲醛至大鼠右心房流出無色液體。脫頸處死，剝離顱骨，將腦組織迅速取出，清除血污，4只置于冰上用于TTC染色；4只取腦組織中動脈供血區域，分成2份，1份保存于液氮中，1份固定于4%多聚甲醛中。

1.2.4 qRT-PCR檢測腦組織miR-24 mRNA表達取液氮保存腦組織，轉錄得互補DNA（cDNA），鑒定后試劑盒說明書要求設定反應體系（總反應體系20 μL：SYBR Green Mix 11 μL，正、反向引物各1 μL，DNA模板1.0 μL，雙蒸水7.0 μL）及反應條件（95 ℃35 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s），重復40次，72 ℃延伸4 min。以U6為內參基因，2-ΔΔCt法計算。實驗所用引物：miR-24正向：5′-TGACGCTTACGTGAACTCCACCAC-3′，反向：5′-GTACCACGCTGCACGGACGTGCAC-3′；U6正向：5′-GTGCACGCACGTGTGTCCAACCAC-3′，反向：5′-GTGCACCTACCACGCACGTGCTGC-3′。所有實驗重復3次取平均值。

1.2.5 TTC染色法檢測腦梗死體積 取冰上保存腦組織，-20 ℃中存放30 min取出，沿冠狀面從前腦額部向后連續切成2 mm薄片，迅速置入磷酸緩沖鹽溶液（PBS）溶液中（含2% TTC染色液），37 ℃避光孵育30 min，每5分鐘輕晃1次容器，4%多聚甲醛固定12 h，取出后PBS充分洗滌，拍照后經Image Pro Plus 6.0分析圖像。正常腦組織為鮮紅色，梗死灶為蒼白色。測量每片梗死面積、總面積，梗死體積=層厚×梗死面積乘積，總梗死體積為各層梗死體積之和。

1.2.6 免疫組織化學染色檢測腦皮質NeuN表達取4%多聚甲醛固定的腦組織，病理切片機切成厚度5 μm切片；二甲苯Ⅰ、Ⅱ溶液中脫蠟10 min；3%H2O2溶液溫箱中孵育25 min使內源性酶失活，PBS緩沖液沖洗；常溫孵育微波修復抗原，冷卻后5%胎牛血清封閉，加入兔抗鼠NeuN一抗（1∶400），4 ℃孵育過夜；PBS溶液搖床洗滌切片，加入辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶800），常溫孵育60 min；PBS洗滌，滴加DAB顯色液，乙醇脫水干燥，中性樹膠封片。光學顯微鏡下隨機選取5個不相鄰切片觀察、計數缺血半暗帶被染成棕褐色的神經元數量，Image J2x軟件分析。

1.2.7 蛋白質印跡法檢測腦組織Bcl-2、Bax蛋白表達 取40 mg液氮保存腦組織，眼科剪剪碎，勻漿后移至離心管，RIPA裂解液提取蛋白，BCA試劑盒定量。取50 μg樣本與上樣緩沖液按比例混合，沸水浴5 min使蛋白變性，離心取上清，恒壓電泳后濕轉至膜上，封閉液封閉2 h，加入兔抗大鼠Bcl-2、Bax一抗（1∶400），4 ℃搖床孵育過夜，等滲緩沖鹽溶液（TBST）洗膜，加入山羊抗兔IgG二抗（1∶1 000），室溫孵育120 min，TBST洗膜，電化學發光法（ECL）顯色劑顯色、曝光，以Bcl-2、Bax/內參甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）灰度值表示蛋白相對表達量，凝膠成像系統分析結果。重復3次取均值。

1.3 統計學方法 采用軟件SPSS 19.0進行數據的統計及分析，以表示計量資料，組內比較采用配對t檢驗，組間多樣本資料的檢驗方式為單因素方差分析，再以LSD-t行兩兩比較。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 神經功能評價 與腦梗死組比較，建模后1、3 d腦梗死過表達組Zea-longa神經功能評分降低，腦梗死低表達組升高（P＜0.05）；腦梗死組、腦梗死NC組Zea-longa神經功能評分比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；腦梗死組、腦梗死過表達組、腦梗死低表達組、腦梗死NC組建模后3 d Zea-longa神經功能評分均低于建模后1 d（P＜0.05）。見表1。

表1 各組腦梗死大鼠神經功能評分比較/（分，）

表1 各組腦梗死大鼠神經功能評分比較/（分，）

注：①與腦梗死組比較，P＜0.05。②與腦梗死過表達組比較，P＜0.05。③與腦梗死低表達組比較，P＜0.05。④與同組建模后1 d比較，P＜0.05。

建模后3 d 1.72±0.19④0.82±0.09①④2.36±0.21①②④1.65±0.17①②③④108.97＜0.001組別腦梗死組腦梗死過表達組腦梗死低表達組腦梗死NC組F值P值鼠數8 8 8 8建模后1 d 2.06±0.25 0.98±0.11①2.71±0.24①②1.94±0.21①②③92.43＜0.001

2.2 腦組織miR-24表達 健康組、腦梗死組、腦梗死過表達組、腦梗死低表達組、腦梗死NC組腦組織miR-24 mRNA相對表達量分別為0.56±0.12、0.21±0.03、1.38±0.26、0.06±0.01、0.22±0.04（F=133.94，P＜0.001）；與健康組比較，腦梗死組腦組織miR-24 mRNA表達降低（LSD-t=8.00，P＜0.001）；與腦梗死組比較，腦梗死過表達組腦組織miR-24 mRNA表達升高（LSD-t=12.64，P＜0.001），腦梗死低表達組miR-24 mRNA表達降低（LSD-t=13.42，P＜0.001）；腦梗死組、腦梗死NC組miR-24 mRNA表達比較，差異無統計學意義（LSD-t=0.57，P=0.581）。

2.3 腦梗死體積 腦梗死組、腦梗死過表達組、腦梗死低表達組、腦梗死NC組腦梗死體積分別為（40.31±5.30）mm3、（21.25±4.93）mm3、（50.56±6.14）mm3、（41.04±4.62）mm3（F=43.32，P＜0.001）；與腦梗死組比較，腦梗死過表達組腦梗死體積縮小（LSD-t=5.89，P＜0.001），腦梗死低表達組腦梗死體積增大（LSD-t=2.83，P=0.022）；腦梗死組、腦梗死NC組腦梗死統計比較，差異無統計學意義（LSD-t=0.23，P=0.822）。

2.4 腦梗死皮質區存活神經元密度 健康組、腦梗死組、腦梗死過表達組、腦梗死低表達組、腦梗死NC組腦梗死皮質區NeuN陽性表達神經元數目分別為（501.00±63.71）個/視野、（292.20±35.60）個/視野、（385.20±45.13）個/視野、（154.40±17.91）個/視野、（285.80±32.59）個/視野（F=75.82，P＜0.001）；與健康組比較，腦梗死組減少（LSD-t=5.61，P=0.001）；與腦梗死組比較，腦梗死過表達組增加（LSD-t=3.62，P=0.007），腦梗死低表達組減少（LSD-t=7.73，P＜0.001）；腦梗死組、腦梗死NC組比較，差異無統計學意義（LSD-t=0.30，P=0.774）。

2.5 腦組織Bcl-2、Bax蛋白表達 與健康組比較，腦梗死組腦組織Bcl-2蛋白表達降低，Bax蛋白表達升高（P＜0.05）；與腦梗死組比較，腦梗死過表達組腦組織Bcl-2蛋白表達升高，Bax蛋白表達降低，腦梗死低表達組Bcl-2蛋白表達降低，Bax蛋白表達升高（P＜0.05）；腦梗死組、腦梗死NC組腦組織Bcl-2、Bax蛋白表達比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖1，表2。

圖1 蛋白質印跡法檢測各組大鼠腦組織Bcl-2、Bax蛋白表達

表2 各組大鼠腦組織Bcl-2、Bax蛋白表達比較/

表2 各組大鼠腦組織Bcl-2、Bax蛋白表達比較/

注：Bcl-2為B細胞淋巴瘤-2，Bax為Bcl-2相關X蛋白。①與健康組比較，P＜0.05。②與腦梗死組比較，P＜0.05。③與腦梗死過表達組比較，P＜0.05。④與腦梗死低表達組比較，P＜0.05。

Bax 0.10±0.01 0.52±0.06①0.36±0.04①②0.69±0.07①②③0.50±0.07①②③④64.34＜0.001組別健康組腦梗死組腦梗死過表達組腦梗死低表達組腦梗死NC組F值P值鼠數4 4 4 4 4 Bcl-2 0.74±0.08 0.13±0.02①0.54±0.07①②0.05±0.01①②③0.14±0.03①②③④144.17＜0.001

3 討論

ICI是由腦供血障礙引起的一種以嚴重意識障礙、感覺和運動功能障礙為主要特征的神經退行性疾病。研究表明，年齡、高血壓、高脂血癥、長期失眠、不良生活習慣、遺傳等均是ICI發生的危險因素［7-8］。越來越多的報道指出，miRNAs與神經系統發育及神經功能關系密切，在大腦特異性表達功能的調節中發揮重要作用，為ICI的基因治療提供了新的可能［9-11］。本課題組選擇與血脂代謝、高血壓、血管內皮細胞、血管炎癥反應均有明顯關聯的miR-24作為本研究的重點。

ICI發生后，在正常腦組織與缺血中心不可逆壞死區域之間，存在處于低灌注狀態、可觀察到典型細胞凋亡特征的缺血半暗帶。細胞過度凋亡是DNA損傷后細胞程序化死亡的晚期病理現象，隨著缺血半暗帶的縮小，神經細胞遲發性死亡及其所致的不可逆性損傷病灶持續擴大，推測主要是通過細胞凋亡來實現的，且可能對最終腦梗死體積具有決定性作用。本研究結果顯示，miR-24過表達可降低Zea-longa神經功能評分，縮小腦梗死體積，增加梗死皮質區NeuN陽性表達神經元數目，miR-24低表達則作用相反，提示miR-24對ICI大鼠具有腦保護及抗神經元凋亡作用。miR-24廣泛表達于全身血管組織及心、肺、腦、肝等器官中，參與調控細胞增殖及凋亡，炎癥性疾病及腫瘤發生等過程。Sun等［12］研究顯示，缺氧將抑制SHR-SY5Y細胞中miR-24表達，采用miR-24模擬物干預后在缺氧條件下可抑制細胞凋亡，誘導細胞周期及細胞增殖。此外，Jiang等［13］研究發現，miR-24可降低腦梗死大鼠血清血脂水平及腦梗死面積百分比，抑制腦組織細胞凋亡。結合本研究推測，miR-24在神經元細胞凋亡中起關鍵作用，且是缺血性腦病的潛在治療靶標。

既往報道顯示，腦梗死后神經元凋亡的主要途徑是線粒體損傷介導的細胞凋亡信號傳導［14-15］。Bcl-2、Bax分別是Bcl-2基因家族最重要的凋亡抑制、凋亡誘導基因。Bcl-2與Bax可形成異源二聚體，減少或阻斷釋放線粒體細胞色素C，從而抑制下游的凋亡級聯反應。當Bcl-2高表達時，Bax二聚體解離為穩定性更強的Bcl-2/Bax復合物，從而延長細胞生存周期。當Bax高表達時，Bax二聚體數量明顯增加，刺激細胞凋亡。Liu等［16］研究發現，急性腦梗死外周血中Bax高于健康受試者，而Bcl-2低于健康受試者，經溶栓治療后Bax降低，而Bcl-2升高，且與梗死面積密切相關，提示兩者參與該病發生、發展。本研究結果顯示，miR-24過表達可提高腦組織Bcl-2蛋白表達量，減少Bax蛋白表達，miR-24低表達則相反，提示miR-24過表達對ICI的治療作用可能與調節腦組織Bcl-2、Bax蛋白表達有關。

綜上所述，miR-24過表達可改善ICI大鼠神經功能，縮小腦梗死體積，減少神經元凋亡，可能通過調節腦組織Bcl-2、Bax蛋白表達來實現。然而，miR-24生理功能是否受細胞中其他信號轉導分子的調控，以及其對ICI的治療作用是否受劑量影響等，仍有待進一步研究。