基于數字減影血管造影的VX2肝癌兔靶向藥物治療模型的建立

含笑，胡茂能，王國亮，祁磊，趙毛毛

國內外的多項臨床隨機對照研究證實經導管動脈化療栓塞術（transcatheter arterial chemoemboli-zation，TACE）在原發性肝癌治療中的顯著有效性，TACE已成為無法切除的原發性肝細胞肝癌（hepatocelluar carcinoma，HCC）的首選治療方式［1-2］。HCC是一種典型的富血供腫瘤，不論是腫瘤的早期還是晚期，血管的生成都是腫瘤進展或轉移的重要原因［3-4］。現有研究同樣認為TACE術后病人復發的原因和HCC新生血管有關［5］。貝伐單抗（Bevacizumab， Bev）是當前公認具有顯著療效的抗血管生成藥物［6-7］。目前文獻報道貝伐珠單抗主要與阿替利珠單抗、索拉非尼等聯合應用可顯著改善HCC病人生存［8］。VX2肝癌是Shop病毒在兔皮膚上誘發的一種鱗癌，經過傳代后可作為兔移植性腫瘤，并且在肝臟的移植成功率較高［9-10］。但目前關于VX2兔肝癌在數字減影血管造影（DSA）設備引導下實施介入治療，尤其是以Bev為代表的靶向藥物介入治療研究尚不多見。因此，采用VX2兔建立一種穩定的肝癌靶向藥物治療模型具有重要的實踐意義。2019年11月至2022年6月，本研究通過總結建立基于DSA的VX2兔肝癌靶向藥物治療模型的相關經驗，同時分析影響實驗兔死亡的危險因素，為VX2肝癌實驗兔進行介入診療提供經驗借鑒。

1 資料與方法

1.1 一般資料 荷瘤兔1只和新西蘭大白兔（實驗兔）44只由南京云橋璞瑞生物科技有限公司，實驗動物合格證號：202254638，實驗動物使用許可證號：SYXK（蘇）2021-0016。荷瘤兔，雄性，體質量2.05 kg。實驗兔，雌、雄各22只，體質量（2.35±0.40）kg，范圍為1.80～2.85 kg。使用隨機數字表法將實驗兔隨機等分為兩組，各22只，分別行常規TACE治療和Bev聯合TACE治療。本研究獲合肥市第三人民醫院倫理委員會批準（批號2019LLW020）。

1.2 腫瘤移植與傳代 使用10%水合氯醛以3 mL/kg劑量腹腔內注射進行麻醉。以外科手術剝離荷瘤兔背部瘤體，切取魚肉狀瘤組織，置于20 000 U慶大霉素注射液+50 mL生理鹽水的混懸液中，然后使用眼科剪將瘤塊剪成直徑1～2 mm的碎塊以備腫瘤移植和傳代使用。將實驗兔使用上述同樣方法麻醉后進行開腹直接穿刺接種法腫瘤移植：常規備皮、消毒后，于實驗兔劍突下正中偏左作一縱向切口，長度約2 cm，逐層打開腹腔直至暴露肝臟左內葉，以4F規格的空心穿刺針直視下斜行輕柔刺破肝包膜，插入深度約為肝包膜下5 mm，用其內芯推入3～5個瘤塊，隨后以相應規格的明膠海綿顆粒4～5粒沿穿刺針推送，封堵穿刺通道后拔出穿刺針，分層縫合腹部切口。最后，用注射器抽取1 mL（含上述組織塊8～10塊）經21 G穿刺針注入健康新西蘭兔雙側后肢皮下以保種傳代。術后連續3 d予以實驗兔后肢肌肉注射青霉素鈉注射液800 000 U/d進行常規抗感染。

1.3 腫瘤的介入治療

1.3.1 設備與造影方法 機器型號為美國GE品牌3100IQ數字減影血管造影機，所有實驗兔在介入治療前均行經微導管股動脈-肝動脈造影，所有手術均由同一名實驗員完成。實驗兔右側腹股溝區備皮、常規消毒鋪巾，輕觸股動脈搏動區，于該區作一縱行切口，鈍性分離至完全暴露股動脈，于股動脈下穿4號縫合線置于近心端，隨后提緊縫線用以暫時阻斷血流，使用眼科剪將股動脈遠心端剪一小斜行切口，將3F微導管經小切口直接插入股動脈，透視下將微導管置于腹腔干開口處進行造影，采用路圖技術超選擇插管進入肝總動脈，連接高壓注射器行DSA檢查［11］。造影劑（碘佛醇，規格為320 mgI/mL，江蘇恒瑞醫藥股份有限公司）流速為2～3 mL/s，總量為6 mL。術畢拔管，結扎右側股動脈，逐層縫合切口，包扎傷口。

1.3.2 介入治療 常規TACE組：將罌粟乙碘油（江蘇恒瑞醫藥股份有限公司）0.3 mL/kg+阿霉素（瀚暉制藥有限公司）2 mg/kg充分乳化制成混懸液，經3F微導管將混懸液緩慢注入靶血管內。Bev聯合TACE組：超選擇插管至腫瘤血管供血動脈后，首先經微導管緩慢注入Bev（安維汀，羅氏制藥有限公司）10 mg/kg，然后行TACE治療（方案同常規TACE組）。

1.4 觀察指標 手術后第14天對實驗兔進行CT平掃+增強檢查評估腫瘤情況，同時抽取靜脈血了解實驗兔肝腎功能，對于術后14 d內死亡的實驗兔認為建模失敗。觀察可能影響手術效果的相關指標，包括性別、體質量、術中出血量、手術前后靜脈血血清谷丙轉氨酶（GPT）、谷草轉氨酶（GOT）及總膽紅素水平、尿素氮、血肌酐水平。

1.5 統計學方法 使用SPSS 26.0軟件進行分析。正態分布計量數據用表示；計數數據使用率或構成比進行描述。連續性變量的差異采用兩獨立樣本t檢驗，分類資料的單因素分析采用χ2檢驗。多因素分析采用非條件二分類logistic回歸分析。受試者操作特征曲線（ROC曲線）分析相關因素的診斷價值，使用Delong法比較曲線下面積（AUC）之間的差異。P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 基線資料 A、B兩組實驗兔介入治療前靜脈血肝腎功能、體質量、性別等基線資料差異無統計學意義（均P＞0.05），見表1。

表1 兩組實驗兔肝癌介入治療前基線資料比較

2.2 影響術后死亡的單因素分析 兩組實驗兔均移植成功，未出現廣泛性腹腔轉移及腹腔積液，造影顯示40只（占比90.91%）腫瘤呈典型富血供病灶。介入手術后第7天，所有實驗兔均采集靜脈血檢查肝腎功能。根據實驗兔手術后生存時間分為死亡組（存活時間＜14 d）和存活組（存活時間≥14 d），其中死亡組為10只，存活組為34只。分別比較相關因素在組間的差異。見表2。

表2 影響實驗兔肝癌介入治療術后死亡的單因素分析

2.3 影響術后死亡的多因素分析 將上述單因素分析差異有統計學意義的變量（體質量、GPT、GOT、總膽紅素）作為自變量，再以是否出現實驗兔術后短期內死亡（出現為1，未出現為0）作為因變量，進行非條件二分類logistic回歸分析，采用逐步向后法擬合優化模型進行分析，結果顯示：體質量低、術后總膽紅素高是實驗兔介入術后短期內死亡的獨立影響因素（均P＜0.05），見表3。

表3 影響實驗兔肝癌術后死亡的多因素logistic回歸分析

2.4 影響因素對死亡事件的預測效能 采用ROC曲線進行診斷效能分析，顯示術前體質量、總膽紅素以及兩者聯合預測的AUC分別為0.90（0.81，0.99）、0.89（0.80，0.99）和0.96（0.90，1.00），靈敏度分別為90.0%、91.0%和90.0%，特異度則分別為76.5%、73.5%和91.2%。此時體質量和總膽紅素的最佳臨界值分別為2.44 kg和4.84 μmol/L。進一步比較AUC之間的差異，顯示AUC體質量比AUC總膽紅素（Z=0.15，P=0.877）；AUC聯合比AUC體質量（Z=1.83，P=0.067）；AUC聯合比AUC總膽紅素（Z=0.07，P=1.833）。

3 討論

HCC的腫瘤組織具有豐富的血供以及較多的新生血管，前者對TACE的良好療效提供了理論基礎，而后者則對腫瘤的快速生長和轉移起到了重要作用［12-13］。2017年，歐洲一項研究認為，對于原發性肝癌病人而言，傳統的TACE仍然是二期肝切除以及降期治療后肝移植的一線治療策略及可能的標準治療方法，并且可以顯著提高病人生存質量［14］。國內一項大樣本回顧性分析研究顯示經TACE治療的原發性HCC病人的1、2、3年累積生存率分別為73.90%、40.20%和22.20%［15］。而梁彥玲等［16］研究報道TACE治療原發性肝癌的并發癥情況，顯示TACE治療的安全可行性。目前，鑒于肝癌發生時常出現的富血供、多發病灶甚至病灶較大等情況，TACE在HCC介入治療中仍然有著重要的地位［17-18］。

本研究中44只實驗兔均成功實施了開腹移植腫瘤，并在DSA設備引導下完成了不同的介入治療，顯示了基于DSA對VX2兔肝癌靶向藥物治療的模型建立較為穩定和可靠。同時本研究還發現，在完成介入手術治療后14 d內還發現實驗兔具有一定死亡率，進一步行非條件二分類logistic回歸分析顯示術前較低的體質量和介入治療后較高的總膽紅素是實驗兔介入治療后死亡的獨立危險因素。ROC曲線分線顯示兩個危險因素均具有較高的診斷效能，在截斷值分別為2.44 kg和4.84 μmol/L時，均有著較高的靈敏度和特異度。將術前體質量和術后總膽紅素進行聯合預測時，比較顯示3種診斷曲線的AUC之間差異無統計學意義，可能和樣本量相對較小有關，雖然聯合診斷靈敏度無明顯變化，但特異度較單獨預測時均明顯提高，顯示聯合預測可能有著更好的診斷效能。

目前，DSA已成為介入治療尤其是肝癌介入治療最重要的引導設備之一［19-21］。雖然DSA引導下的VX2兔肝癌靶向治療建模成功率較為穩定，但本研究顯示實驗兔體質量≤2.44 kg時，對實驗兔術后死亡的預測效能最高。既往一項關于肝動脈、門靜脈雙介入的VX2兔肝癌模型研究中發現，實驗兔體質量＜2.5 kg時容易在建模后死亡［11］，本研究與其基本一致。究其原因，可能是較小體質量的實驗兔血容量較少、耐受性較差。此外，體質量較小的實驗兔其血管較細，很多時候需要反復穿刺，增加了創傷性。

本研究還顯示，實驗兔術后肝功能狀態同樣能影響建模的成功率。單因素分析顯示GPT、GOT以及總膽紅素在存活組和死亡組之間均差異有統計學意義，顯示無論行TACE還是TACE聯合Bev治療，術后實驗兔肝功能均有一定程度受損。而多因素分析則顯示總膽紅素為實驗兔死亡的獨立危險因素，也進一步提示實驗時應適當減少栓塞劑的用量，嘗試保護肝功能藥物的應用，以減輕肝功能受損程度。

本研究尚有一定的局限性，一方面，樣本量相對較少，有一定的選擇性偏倚；另一方面，實驗人員的熟練程度也在一定程度上影響著建模的成功率。

綜上所述，在DSA設備引導下行VX2兔肝癌介入治療模型建立具有較高的可靠性，可以為肝癌的微創治療提供更好的實驗基礎，值得推廣應用。