圍生期缺血缺氧性腦病的微RNA生物標(biāo)志物篩選研究

曾浩，陳玉霞，司文

圍生期缺氧缺血性腦病（HIE）主要是指因多種原因共同作用導(dǎo)致的缺氧窒息，繼而引起部分或完全缺氧或（和）腦血流減少導(dǎo)致的腦缺氧缺血性損害［1］。病兒主要表現(xiàn)特征涵蓋意識障礙、原始反射異常以及肌張力改變等，可能伴有多臟器的不同程度損傷，預(yù)后不良［2］。因此，如何有效早期診斷HIE具有極其重要的意義。既往，臨床上主要是通過核磁共振以及腦電圖等手段實現(xiàn)對HIE的診斷，但均存在耗時較長的缺陷，可能導(dǎo)致病兒的最佳治療時期錯過［3］。因此，利用病兒臍血進(jìn)行快速、準(zhǔn)確、無創(chuàng)的生物標(biāo)志物檢測無疑是最佳的解決方案。目前，高通量測序以及檢測技術(shù)得到顯著的發(fā)展，若能通過上述技術(shù)篩查出臍帶血血液中和缺氧狀態(tài)相關(guān)的生物標(biāo)志物，并結(jié)合高通量自動快速檢測設(shè)備檢測分子標(biāo)志物可有效提高HIE診斷的準(zhǔn)確性［4］，繼而為醫(yī)療手段或神經(jīng)保護(hù)藥物的使用時機和藥物劑量提供依據(jù)。本研究通過HIE的微RNA（miRNA）生物標(biāo)志物的篩選，為臨床治療提供支持。

1 資料與方法

1.1 一般資料 通過動態(tài)隊列研究法獲取深圳市龍華區(qū)中心醫(yī)院2020年1月至2021年1月144例HIE病兒作為受試者。將其根據(jù)病情嚴(yán)重程度的差異分作輕度HIE組42例、中度HIE組62例以及重度HIE組40例，另取同期該院50例健康新生兒作為對照組。各組基線資料差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），可比性較高，見表1。入組標(biāo)準(zhǔn)：（1）HIE病兒均符合中華醫(yī)學(xué)會兒科學(xué)會新生兒組修訂的新生兒HIE診斷標(biāo)準(zhǔn)［5］；（2）均為足月單胎妊娠；（3）娩出后24 h內(nèi)入院接受診治。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并敗血癥或（和）腦膜炎等并發(fā)癥；（2）伴有先天性畸形或遺傳性疾病；（3）正參與其他研究。本研究獲深圳市龍華區(qū)中心醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（批號2019-072-02），病兒監(jiān)護(hù)人或近親屬對研究方案簽署知情同意書。

表1 各組新生兒基線資料對比

1.2 研究方法 （1）臍帶血采集及處理：在受試者娩出之后，分別采集200 μL的臍帶血保存在無RNA酶EP管內(nèi)，滴加1 mL的Trizol LS［賽默飛世爾科技（中國）有限公司］充分混勻，保存至-80 ℃冰箱中備用。（2）總RNA提取：首先將標(biāo)本進(jìn)行冰上溶解處理，滴加200 μL的氯仿混勻，進(jìn)行時長為10 min的靜置處理，之后開展時長為15 min的12 000 r/min離心處理。采集上層水相400 μL并放置在無RNA酶的EP管內(nèi)，繼續(xù)滴加400 μL異丙醇混勻。冰上靜置10 min后以14 000 r/min為離心條件離心15 min。之后去除上清液，取沉淀物加入乙醇清洗后12 000 r/min離心5 min。吸去乙醇，晾干后，加入10 μL去酶水，液氮速凍RNA溶液，樣品用干冰運輸交給公司進(jìn)行二代測序。（3）二代轉(zhuǎn)錄組測序及差異表達(dá)基因分析：通過第二代測序技術(shù)實現(xiàn)，并篩選reads數(shù)＞2的差異基因，閾值為FDR（false discovery rate）＜0.05，log2FC ［fold change （condition 2/condition 1）for a gene］＞2或log2FC＜-2，根據(jù)以上條件得出差異表達(dá)的miRNA。（4）候選miRNA關(guān)聯(lián)性分析：篩選出與HIE分度正相關(guān)或負(fù)相關(guān)的候選miRNA，通過兩變量關(guān)聯(lián)性分析方法進(jìn)行分析每個miRNA與HIE分度的相關(guān)性，將HIE臨床分度為有序分類變量并設(shè)為x，臨床分度Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分別對應(yīng)為值1、2、3，將miRNA的reads數(shù)作為連續(xù)定量變量，設(shè)為y。因雙變量中含有一有序分類變量，因此SPSS應(yīng)采用Spearman關(guān)聯(lián)性分析方法進(jìn)行分析其相關(guān)性。根據(jù)其秩相關(guān)系數(shù)rs篩選出3～5個-1≤rs≤-0.5或1≥rs≥0.5，且P≤0.05的miRNA，作為預(yù)測HIE的miRNA生物標(biāo)志物。（5）分組方式：將所有HIE病兒按照是否合并臟器損傷分為合并臟器損傷組102例以及未合并臟器損傷組42例。（6）血清誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）、內(nèi)皮素-1水平檢測：檢測方式均為酶聯(lián)免疫吸附測定，操作以試劑盒（購自上海西唐生物科技有限公司）說明書為準(zhǔn)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)處理軟件選擇SPSS 22.0。以表示計量數(shù)據(jù)，開展正態(tài)性檢驗及方差齊性檢驗，符合正態(tài)分布，兩組比較行兩獨立樣本t檢驗。多組間對比行單因素方差分析。計數(shù)資料以例（%）表示，開展χ2檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 芯片檢測結(jié)果分析 miRNA芯片通過掃描、分析以及標(biāo)準(zhǔn)化處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miRNA芯片共檢測miRNA達(dá)921種。相較于對照組，HIE病兒血漿中有29種miRNA表達(dá)異常升高，26種miRNA表達(dá)異常下降，選擇差異有統(tǒng)計學(xué)意義的miRNA實施生物學(xué)信息分析，發(fā)現(xiàn)了miR-4472、miR-5195-3p以及miR-6794-5p可能具有潛在的預(yù)測HIE作用。

2.2 各組新生兒miR-4472、miR-5195-3p以及miR-6794-5p表達(dá)對比 重度HIE組miR-4472、miR-5195-3p以及miR-6794-5p表達(dá)水平均高于對照組和輕度HIE組以及中度組，且輕度HIE組、中度HIE組miR-4472、miR-5195-3p以及miR-6794-5p表達(dá)水平均高于對照組，中度HIE組miR-4472、miR-5195-3p以及miR-6794-5p表達(dá)水平均高于輕度HIE組（均P＜0.05），見表2。

表2 各組新生兒miR-4472、miR-5195-3p以及miR-6794-5p表達(dá)對比/

表2 各組新生兒miR-4472、miR-5195-3p以及miR-6794-5p表達(dá)對比/

注：HIE為缺氧缺血性腦病。①與對照組相比，P＜0.05。②與輕度HIE組相比，P＜0.05。③與中度HIE組相比，P＜0.05。

miR-6794-5p 0.47±0.11 0.89±0.15①1.46±0.20①②2.24±0.24①②③16.40＜0.001組別對照組輕度HIE組中度HIE組重度HIE組F值P值例數(shù)50 42 62 40 miR-4472 0.20±0.04 0.37±0.08①0.55±0.09①②0.71±0.12①②③10.53＜0.001 miR-5195-3p 0.78±0.15 0.92±0.18①1.45±0.23①②2.34±0.28①②③14.29＜0.001

2.3 HIE病兒病情嚴(yán)重程度和miR-4472、miR-5195-3p、miR-6794-5p表達(dá)的關(guān)系分析 HIE病兒病情嚴(yán)重程度和miR-4472、miR-5195-3p、miR-6794-5p表達(dá)均呈正相關(guān)關(guān)系（均P＜0.05），見表3。

表3 HIE病兒病情嚴(yán)重程度和miR-4472、miR-5195-3p、miR-6794-5p表達(dá)的Spearman相關(guān)性分析

2.4 HIE病兒合并臟器損傷和miR-4472、miR-5195-3p、miR-6794-5p表達(dá)的關(guān)系分析 合并臟器損傷HIE病兒miR-4472、miR-5195-3p、miR-6794-5p表達(dá)水平均高于未合并臟器損傷組（均P＜0.05），見表4。

表4 HIE病兒合并臟器損傷和miR-4472、miR-5195-3p、miR-6794-5p表達(dá)的關(guān)系分析/

表4 HIE病兒合并臟器損傷和miR-4472、miR-5195-3p、miR-6794-5p表達(dá)的關(guān)系分析/

注：HIE為缺氧缺血性腦病。

組別合并臟器損傷組未合并臟器損傷組t值P值miR-6794-5p 1.70±0.31 1.37±0.23 6.22＜0.001例數(shù)102 42 miR-4472 0.60±0.09 0.46±0.03 9.84＜0.001 miR-5195-3p 2.05±0.18 1.58±0.12 15.54＜0.001

2.5 兩組血清iNOS及內(nèi)皮素-1水平對比 HIE組血清iNOS及內(nèi)皮素-1水平均高于對照組（均P＜0.05），見表5。

表5 兩組血清iNOS及內(nèi)皮素-1水平對比/

表5 兩組血清iNOS及內(nèi)皮素-1水平對比/

注：HIE為缺氧缺血性腦病，iNOS為一氧化氮合酶。

組別對照組HIE組t值P值內(nèi)皮素-1/（ng/L）34.58±9.28 241.93±32.15 44.89＜0.001例數(shù)50 144 iNOS/（U/mL）21.05±3.16 47.11±6.23 28.31＜0.001

3 討論

臨床表現(xiàn)、影像學(xué)檢查和腦電圖檢查是目前臨床上廣泛用以診斷HIE的手段，但其無法判斷腦缺氧缺血后的損傷實質(zhì)，且靈敏度以及特異度均較低，對后續(xù)治療用藥影響較大，存在一定的局限性［6-8］。隨著高通量測序技術(shù)的日益發(fā)展，大規(guī)模人群樣本的疾病相關(guān)生物標(biāo)志物篩選得以實現(xiàn)［9-10］。生物標(biāo)志物可反映生理狀態(tài)或疾病過程中細(xì)胞變化情況，包括miRNA、細(xì)胞代謝物以及蛋白質(zhì)等小分子，可用于預(yù)測患病概率、輔助診斷以及預(yù)后評估中。其中miRNA主要是指一類約由20個核苷酸組成的非編碼RNA，其可通過和靶mRNA的互補序列特異性結(jié)合，繼而調(diào)控相關(guān)靶基因的表達(dá)，進(jìn)一步參與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展過程［11-12］。有研究報道顯示，miRNA與人類癌癥、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病以及心血管疾病均有密切相關(guān)，可能是多種疾病診斷、治療以及預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物［13-14］。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相較于對照組，HIE病兒血漿中有29種miRNA表達(dá)異常升高，26種miRNA表達(dá)異常下降。這在既往相關(guān)研究報道中得以佐證，說明了存在一部分miRNA和HIE的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。然而，另有研究報道發(fā)現(xiàn)miRNA-210在HIE中存在異常表達(dá)［15］，而在本研究中并未檢測到該miRNA的異常改變。導(dǎo)致上述差異發(fā)生的原因可能和醫(yī)療技術(shù)的飛速發(fā)展以及醫(yī)療條件的日益完善有關(guān)；此外，實驗過程中難免存在一定的偏倚，從而導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)偏頗。此外，miR-4472、miR-5195-3p以及miR-6794-5p可能具有潛在的預(yù)測HIE作用，且上述3種miRNA在HIE病兒中均存在異常高表達(dá)，并隨著HIE病兒病情的加重，其表達(dá)升高。提示了miR-4472、miR-5195-3p、miR-6794-5p可能是HIE的miRNA生物標(biāo)志物。究其原因，上述3種miRNA可通過調(diào)控下游靶基因的表達(dá)，進(jìn)一步參與HIE的發(fā)生、發(fā)展過程。然而，關(guān)于其具體作用機制有待進(jìn)一步研究明確，亦為我們今后的研究提供了新的方向以及思路。另外，合并臟器損傷HIE病兒合并臟器損傷和miR-4472、miR-5195-3p、miR-6794-5p表達(dá)水平均高于未合并臟器損傷組。分析原因，可能是上述3種miRNA參與了HIE各臟器損傷的病理過程［16-17］。這反映了上述3種miRNA表達(dá)水平的檢測可能有助于臨床預(yù)測HIE病兒的合并臟器損傷情況，可為已出現(xiàn)多臟器功能不全趨勢但尚未出現(xiàn)顯著表現(xiàn)病人提供早期預(yù)警指導(dǎo)，繼而為臨床診治提供指導(dǎo)依據(jù)，達(dá)到改善預(yù)后的目的。然而，miRNA在心肌缺氧缺血損傷以及其他多種情況下降均可能出現(xiàn)異常表達(dá)［18-19］，因此，需開展進(jìn)一步試驗明確各臟器組織特異相關(guān)的miRNA表達(dá)。此外，本研究所檢測的樣本為臍帶血，其中miR-4472、miR-5195-3p、miR-6794-5p表達(dá)可能受多種因素的干擾，今后的研究可以考慮采集多種不同類型標(biāo)本進(jìn)行試驗，提高數(shù)據(jù)的可信度。HIE組血清iNOS及內(nèi)皮素-1水平均高于對照組。考慮原因，可能是iNOS和內(nèi)皮素-1在HIE的發(fā)生、發(fā)展過程中具有調(diào)節(jié)平衡作用。

綜上所述，miR-4472、miR-5195-3p、miR-6794-5p可能是HIE的潛在miRNA生物標(biāo)志物，上述miRNA表達(dá)水平和病兒病情嚴(yán)重程度以及臟器損傷有關(guān)，可能有助于輔助診斷HIE以及預(yù)測臟器損傷發(fā)生情況，值得臨床重點關(guān)注。然而，本研究尚且存在一定的有待完善之處，在今后的相關(guān)研究中，應(yīng)增加樣本量，以獲取更為準(zhǔn)確、可靠的數(shù)據(jù)。