微RNA-194在宮頸癌中的表達及臨床意義

崔桂榮，張金華，劉亞寧，李焱

在我國宮頸癌是一個威脅婦女健康最常見的惡性腫瘤之一，宮頸鱗癌是宮頸癌的主要病理類型［1-2］。近年來，由于宮頸癌篩查工作的廣泛開展和以外科手術、放療、化療和靶向治療等治療技術提高，宮頸癌的臨床預后有了很大的改善，但總體生存率仍有待進一步提高［3］。

微RNA（microRNA，miRNA）是一類能夠調節基因表達的短單鏈內源非編碼RNA（長約18～25個核苷酸），廣泛存在于動物、植物、病毒等多種有機體中，miRNA可通過與互補的mRNA選擇性地結合降解靶mRNA或抑制mRNA翻譯，在轉錄后水平調控基因的表達［4］。miRNA通過調控細胞發育、增殖、分化、凋亡、信號轉導、腫瘤發生和發展等基因的表達參與多種重要的生物學過程［5］。miRNA在各種惡性腫瘤中異常表達，其作用涉及原癌基因的激活與抑癌基因的失活，miRNA在宮頸癌的診斷和治療中有重要作用［6］。研究發現miRNA-194在肺癌、喉癌、胃癌等實體瘤中異常表達［7-11］，大量研究證實miRNA-194與惡性腫瘤的侵襲和轉移存在必然聯系［12］，但是miRNA -194在宮頸癌中的作用目前仍未見明確的報道。

本研究通過回顧性收集宮頸癌組織以及癌旁組織樣本，采用實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測上述樣本中miRNA-194的表達情況，并分析miRNA-194的表達與臨床病理因素的相關性，為研究miRNA-194在宮頸癌中的作用及其機制奠定基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年5月至2016年1月于邯鄲市第一醫院行手術治療的136例宮頸癌病人為研究對象。136例病人中采用分層抽樣法選取58例宮頸癌病人的癌組織及相應癌旁正常組織，其余78例病人僅選取癌組織。癌旁組織取自手術切除殘端，距離癌組織大于2 cm，切緣陰性，所取標本離體后置于液氮罐內迅速冷凍后置-80 ℃保存。納入標準：年齡18～80歲；術前均經病理學檢查確診為宮頸鱗癌；術前未行化療、放療、激素治療以及其他特殊治療；行宮頸癌根治手術；術后病理確診為宮頸鱗癌；病人臨床診療及隨訪資料完整。排除標準：合并其他惡性腫瘤；合并嚴重婦科及心、腦、腎等嚴重內科疾病；隨訪資料不完整；隨訪期間因腫瘤以外因素死亡。136例病人年齡31～69歲，中位年齡為46歲；外生型91例，內生型45例；病理分級低、中和高分化分別為55例、43例和38例；2018國際婦產科聯盟（FIGO）臨床分期［13］：ⅠA期8例，ⅠB期9例，ⅡA期22例，ⅡB期18例，ⅢA期10例，ⅢB期6例，ⅢC期58例，ⅣA期5例；腫瘤長徑（4.12±1.08）cm，范圍為2.8～8.4 cm；淋巴結轉移63例（ⅢC～ⅣA期），無淋巴結轉移73例（ⅠA～ⅢB期）。本研究經邯鄲市第一醫院醫學倫理委員會批準（批號201706F）。

1.2 主要試劑 Trizol總RNA提取試劑盒，逆轉錄酶試劑盒，熒光定量PCR sybrgreen試劑盒，Taqman small RNA Assays，DNA marker等主要試劑購于美國Invitrogen公司和Life Technologies公司。

1.3 qRT-PCR 采用qRT-PCR技術檢測136例宮頸癌組織樣本及58例癌旁組織樣本中的miRNA-194相對表達量。參照說明中所述詳細實驗方法步驟，應用總RNA抽提試劑對上述樣本進行總RNA的提取。用超微量分光光度計檢測總RNA濃度和純度。應用逆轉錄試劑盒將總RNA逆轉錄為互補DNA（cDNA）。依照試劑盒說明書，配制反應液10 μL：總RNA 1 ng，根據總RNA濃度計算出所需體積、5 U/μL Poly A Polymerase 1 μL、RTase Mix 1 μL、5×PAP/RT Buffer 2.5 μL、雙蒸水（RNase/Dnase free）補齊至總反應液為25 μL。控制反應條件為37 ℃60 min，85 ℃ 5 min。miRNA-194正向引物5'-CACGCATGTAACAGCAAC-3'，反向引物5'-CCAGTGCAGGGTCCGAGGTA-3'。所有反應均設置3個復孔，反應條件為95 ℃ 15 min、95 ℃ 10 s、58 ℃ 15 s、70 ℃ 30 s，共30個循環。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內參基因，使用2-ΔΔCt法計算miRNA-194的相對表達量。根據miRNA-194的相對表達量的中位值對136例宮頸癌病人進行分組。

1.4 隨訪 本研究中所有病人的隨訪資料均保存完整，包括家庭地址和聯系方式，隨訪方式為門診、入院復查和電話隨訪，隨訪截止日期為2019年6月。觀察終點為宮頸癌病人死亡，生存時間定義為術后病理確診至因宮頸癌死亡的時間段。全組136例病人中，獲得隨訪132例，失訪4例。所有病人隨訪時間為2～72個月，中位隨訪時間為48個月，死亡49例。

1.5 統計學方法 應用SPSS 19.0 軟件對數據進行統計分析。計量資料以表示，采用t檢驗比較宮頸癌組織和癌旁組織間miRNA-194的表達差異；計數資料以例數表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，采用log-rank檢驗比較miRNA-194高低表達組間的生存差異。采用Cox風險回歸對miRNA-194表達以及臨床病理特征和病人總體生存率之間的關系進行分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miRNA-194在宮頸鱗癌組織中低表達 qRTPCR檢測結果表明136例宮頸鱗癌病人癌組織miRNA-194的相對表達量（1.140±0.655）明顯低于癌旁組織（4.502±1.168）（兩獨立樣本t檢驗t=25.49，P＜0.001），其中58例宮頸鱗癌病人癌組織及其配對的癌旁組織miRNA-194的相對表達量分別為1.471±0.561和4.502±1.168（配對樣本t檢驗t=17.82，P＜0.001）。

2.2 miRNA-194表達與臨床病理特征的關系 本研究根據miRNA-194在宮頸癌組織中的相對表達中位數1.015將136例病人分為miRNA-194高、低表達組各68例。如表1所示，結果表明宮頸癌中miRNA-194相對表達水平與病人的年齡、大體類型、病理分級、浸潤深度、淋巴結轉移無關，與宮頸癌病人的FIGO分期和腫瘤長徑相關，miRNA-194在宮頸癌高FIGO分期（P=0.001）和腫瘤長徑大（P=0.033）的癌組織中相對表達水平較低。

表1 miRNA-194表達水平與宮頸癌病人臨床病理特征的關系/例

2.3 miRNA-194低表達的宮頸癌病人生存期較短 Kaplan-Meier生存分析結果顯示，miRNA-194高表達組病人3年和5年總生存率分別為87.8%和73.2%，低表達組宮頸癌病人的3年和5年總生存率分別為70.2%和51.6%，miRNA-194低表達組病人的生存期明顯低于高表達組［HR95%CI=2.17（1.21，3.90），log-rankP=0.012］。Cox回歸分析結果如表2所示，單因素分析表明FIGO臨床分期、腫瘤長徑、淋巴結轉移情況和miRNA-194表達是影響136例宮頸癌病人生存預后的因素，進一步的多因素分析表明FIGO臨床分期和miRNA-194表達是影響宮頸癌病人預后的獨立因素。

表2 影響宮頸癌136例預后的Cox單因素和多因素分析

3 討論

目前國內外大量研究證實miRNA-194充當抑癌基因作用于多種惡性腫瘤，在腫瘤細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移等生物過程中起關鍵作用［14-15］。然而，miRNA-194在宮頸癌中的作用尚不清楚。研究miRNA-194在宮頸癌中的表達、臨床意義及與預后的相關性，對宮頸癌的診斷、判斷預后及個體化靶向治療具有重要意義。研究表明miRNA-194在非小細胞肺癌組織中低表達與病人生存期短顯著相關，miRNA-194可通過靶向調節hNUDC基因抑制非小細胞肺癌細胞增殖，參與肺癌的發生發展［10，16］。近期，國內學者王純斌等［17］的研究進一步證實了miRNA-194在非小細胞肺癌細胞中低表達，miRNA-194可抑制A549細胞的增殖和克隆形成能力，促進凋亡，其機制與調控JAK2/STAT3信號通路并促進活化的Caspase-3 蛋白表達有關。馬一棟等［18］研究表明miRNA-194在肝癌細胞中的表達明顯低于肝臟正常細胞，過表達miRNA-194可減慢肝癌細胞周期進程，抑制肝癌細胞生長，其機制可能與miRNA-194靶向調節甲基化轉移酶DNMT3A相關。另外有學者研究表明胃癌病人血液中miRNA-194的表達水平明顯低于健康人群，miRNA-194的表達水平與腫瘤分化程度、TNM分期、淋巴轉移呈負相關，該研究提示miRNA-194可作為診斷胃癌的潛在生物標志物［19］。

本研究結果顯示：miRNA-194在宮頸癌組織中的表達明顯低于癌旁正常組織，提示miRNA-194在宮頸癌組織中呈明顯低表達，推測miRNA-194表達水平的下降與宮頸癌的發生、發展密切相關，隨后探討miRNA-194的表達與宮頸癌病人臨床病理特征的關系，結果顯示miRNA-194的表達與宮頸癌病人的FIGO分期和腫瘤長徑具有密切關系，miRNA-194的表達與宮頸癌病人FIGO分期和腫瘤長徑呈反比，提示 miRNA-194的表達與宮頸癌的進展密切相關；miRNA-194低表達者5年總生存率明顯低于miRNA-194高表達者，且miRNA-194表達是宮頸癌病人獨立預后因素，提示miRNA-194表達與宮頸癌預后密切相關，因此我們推測miRNA-194表達可作為一種新型宮頸癌預后和治療靶點應用于臨床。

Zhao等［11］通過收集165例經病理檢查確診的胃癌病人腫瘤組織及鄰近健康組織，應用qRT-PCR檢測胃癌組織中miRNA-194的表達水平顯著低于鄰近組織，miRNA-194在胃癌中的表達與TNM分期、癌細胞分化程度和淋巴結轉移密切相關，體外實驗表明過表達miRNA-194可顯著抑制胃癌細胞的增殖和遷移。miRNA-194在喉部鱗狀細胞癌中呈明顯低表達，miRNA-194低表達喉癌病人的總生存時間和無進展生存時間明顯低于miRNA-194高表達病人，miRNA-194表達與臨床分期成反比關系［8］。此外，miRNA-194在膀胱癌、鼻咽癌、腎透明細胞癌、黑色素瘤等腫瘤中均有低表達，其表達水平的降低與預后不良密切相關，miRNA-194可通過一系列信號通路參與腫瘤生長和轉移［7，20-22］。

miRNA-194在惡性腫瘤的化療敏感性中也起到重要作用。miRNA-194可通過靶向Wee1在喉鱗狀細胞癌中發揮抑癌作用，過表達miRNA-194可以抑制喉鱗狀細胞癌細胞的增殖、遷移、侵襲和耐藥性［8］。過表達miRNA-194通過調節HMGA2抑制結直腸癌細胞的存活和上皮-間質轉化，同時增加結直腸癌細胞對鉑類和伊立替康治療的敏感性［9］。miRNA-194通過抑制FOXA1調節非小細胞肺癌細胞對鉑類化療敏感性，miRNA-194在順鉑耐藥的非小細胞肺癌細胞系中表達下調，過表達miRNA-194可增加順鉑治療的敏感性［12］。上述研究結果提示，miRNA-194抑制腫瘤細胞的增殖和轉移，并可逆轉腫瘤細胞對多種化療藥物的耐藥。

綜上所述，miRNA-194在宮頸癌中呈明顯低表達，且與宮頸癌臨床分期、腫瘤長徑及預后密切相關，檢測miRNA-194的表達可為宮頸癌的診斷和預后提供依據，其在宮頸癌進展中的具體作用機制值得進一步深入研究。