基于生物材料的多模態組織工程策略

楊 嘉，王秀梅

(清華大學材料學院 再生醫學與仿生材料研究所，北京 100084)

1 前 言

近年來，隨著人口老齡化加劇、疾病和意外事故頻發，組織和器官的損傷及功能性障礙已成為影響人類生命健康的重要因素。傳統的外科治療策略經歷了切除、修補、替代的過程。近年來，隨著組織工程和再生醫學的快速發展，再生修復被認為是最具前景和挑戰的組織修復策略。再生是指生命體整體或器官受外力作用發生創傷而部分丟失，在剩余部分的基礎上又生長出與丟失部分在形態與功能上相同的結構的過程。然而，眾所周知，絕大部分成體組織的修復和再生能力極為有限，尤其是在嚴重創傷后，由于大量細胞丟失、凋亡，和細胞外基質環境的破壞，使組織再生變得尤為困難，組織工程策略應運而生。20世紀90年代，國際著名學者，美國麻省理工學院教授Langer和Vacanti[1]提出組織工程的概念，即應用生命科學、工程學與其它學科的原理與技術，在正確認識哺乳動物正常及病理兩種狀態下組織結構與功能關系的基礎上，研究和開發用于修復或維護人體各種組織/器官損傷后的功能和形態的生物替代物。作為組織再生修復的“金標準”，自體移植始終是一種“拆東墻補西墻”的修復策略，存在供體來源有限，給患者帶來二次手術傷害等問題。雖然異體或異種移植物也展示出了優秀的再生修復能力，但仍然存在眾多挑戰，例如免疫原性以及可能存在的倫理問題等。因此，人工合成出理想的生物替代物，修復損傷組織或器官，成為組織工程和再生醫學的核心任務。

組織工程基本原理包括生物材料、細胞和調控因子三要素。其中，生物材料在組織損傷修復中起著至關重要的作用[2]。生物材料不僅可作為支架填補組織缺損區以保持受損部位的結構完整性，提供物理結構支撐并促進細胞附著和生長[3]，同時，生物材料還可以被設計為生物活性物質的遞送載體，如干細胞[4]、藥物[5]、生長因子[6]、外泌體[7]、小分子核糖核酸[8]等，以調控組織再生修復進程。然而，近年來越來越多的研究證明生物材料的作用不限于此。隨著“干細胞微環境”概念的提出，生物材料在組織再生修復中承擔著“再生微環境”的作用，即調控干細胞、免疫細胞、組織特異性細胞的細胞行為并激活組織再生潛能。生物材料所具備的本征理化特性(結構、力學、表面化學、基質成分、親疏水性等)、生物活性(基因、蛋白、多肽、藥物等)，以及傳遞的外源刺激(聲、光、電、磁等)等不同模態的材料學信號均可調控細胞行為，激活基因表達，進而誘導組織再生。鑒于天然組織的復雜性，應用組織工程策略再生修復損傷組織離不開多種不同類型細胞和活性因子在不同時空的協同作用。可見，通過加載單一模態的再生調控信號無法重建較為完整的組織結構和功能。基于此，利用生物材料加載多種模態的再生調控信號，發揮協同作用，調控多種細胞行為，模擬復雜的組織生態位，進而激活受損組織的再生潛能，有望成為未來組織工程和再生醫學領域的重要發展方向。鑒于此，本文綜述了多種材料信號對于調控細胞行為的重要作用，并提出了一種基于生物材料的多模態組織工程策略。此外，以神經組織工程為例，闡明了遞送多模態信號的生物材料在促進組織再生修復中的重要性。

2 生物材料在組織工程和再生醫學中的重要地位

組織工程與再生醫學的最終目標是實現損傷組織和器官的再生與替代，從而恢復它特有的結構與功能。然而，組織再生過程是基于一系列復雜的生理活動，尤其是細胞與細胞外基質之間、細胞與細胞之間的動態相互作用。組織損傷后，修復過程啟動。各類炎癥細胞和免疫細胞貫序進入損傷區，清除壞死的細胞和組織，分泌炎癥因子，激活修復過程。受損部位組織細胞和多能干細胞被激活，開始增殖和分化，以補充受損細胞。與此同時，這些細胞會在損傷部位分泌和合成細胞外基質，以支持細胞本身的粘附、生長和分化，最終發育為新生的組織結構。然而，由于損傷區細胞依賴的基質環境缺失，且損傷微環境逐漸惡化，細胞通常面臨著“孤掌難鳴”的困境，從而使再生過程變得尤為困難。因此，最初的生物材料被設計為一種臨時的可為細胞附著和生長提供支持的生物支架，其降解速率應匹配組織再生速度，以完成“功成身退”的使命。然而，近年來，隨著對促進組織修復的生物材料研究的日漸深入，生物材料的功能已得到充分拓展，不止作為新生組織的模板，更作為一種指導生命活動的智能組件，以最大限度地激活內源性再生潛力促進組織重塑。因此，基于仿生設計原則，解碼天然細胞外基質的材料學信號并揭示它對細胞行為的調控作用和分子機制，指導多功能生物材料的設計，誘導組織再生修復，已成為組織工程和再生醫學研究的共性科學問題。

3 基于生物材料的多模態組織工程策略

材料誘導組織再生修復是基于“材料-細胞”的相互作用而實現的[9]。設計生物功能性材料為細胞遞送“促再生”信號，是生物材料設計中最為重要的一環。然而，由于組織再生修復的生理復雜性以及各類調控因素中固有的交叉對話作用，材料負載的單一模態的信號很難達到理想的修復效果。因此，破譯細胞生態位中的特定物理、化學、生物學等因素的作用，探索材料靶向調控組織損傷修復的多線索協同作用，為指導生物材料設計指明了方向。本文提出了一種基于生物材料的多模態組織工程策略，即設計開發“All-in-One”多功能生物材料，遞送多模態的物理、化學、生物學調控信號和外部刺激，實現對細胞命運的精準、貫序調控，并建立多模態信號與組織再生的多級構效關系和協同增效機制(圖1)。這里，“All”代表與特定組織再生修復密切相關的各類多模態再生調控信號；“One”代表多功能集成的再生生物材料，該材料可實現多模態調控信號可控遞送和協同增益。基于此，設計開發的新一代“All-in-One”多功能生物材料將以一種更為靶向、精準的方式服務于組織再生修復。本節將重點介紹生物材料負載的模態類型及其特征信號對于調控細胞生命活動、促進組織再生修復的重要作用。

圖1 基于生物材料遞送的多模態再生調控信號示意圖

3.1 化學信號

生物材料固有的化學信號對于指導生物材料植入后的細胞行為等具有重要作用[10]。材料的化學信號不僅通過本體特征影響細胞行為，還通過其表面化學、親疏水作用、表面能等調控細胞與材料的相互作用[11]。從化學成分角度而言，天然來源的生物材料通常具有類似于原生細胞外基質的化學信號，參與并指導細胞活動[12]。例如，作為細胞外基質的重要組成成分，透明質酸可以與細胞表面受體相互作用，介導運動相關受體(RHAMM)和分化簇(CD44)，促進細胞形態發生[13]。此外，已被證明不同分子量的透明質酸對于組織的免疫反應具有截然不同的調節作用[14]。細胞與生物材料發生相互作用的界面通常位于生物材料的表面。因此，生物材料的表面化學性質可強烈影響細胞的粘附、形態發生、增殖及分化等細胞行為。Ren等[15]研究發現，表面化學基團影響神經干細胞(neural stem cell，NSC)行為；培養于帶正電的—NH2表面的NSC展現出最顯著的粘附和遷移行為，同時向神經元方向分化；然而，培養于帶負電的—SO3H表面上的NSC在單細胞水平雖表現了最大的接觸面積，但更傾向于分化為少突膠質細胞。另外，生物材料的表面親疏水性可影響細胞粘附與蛋白質吸附[16]。有研究報道，疏水性表面更容易吸附蛋白質，且結合的蛋白質的種類、濃度、相互作用強度以及結合后的蛋白質構象均會影響細胞行為[17，18]。然而，不同類型的細胞對于親疏水性界面的傾向性不同，一般而言，為了平衡界面能，親水性細胞傾向于粘附在親水性表面，反之，疏水性細胞則易于粘附于疏水性表面[19，20]。另外，據Hotchkiss等[21]和Abaricia等[22]的報道，親水性界面抑制了促炎標志物的表達，并大大增強了抗炎標志物的表達，這表明生物材料的親疏水性對免疫反應也有一定的調控作用。

3.2 物理信號

利用生物制造技術，例如靜電紡絲、立體光刻、3D打印等，可以將生物材料制作成具有一定結構特征的3D支架，3D支架除了為受損組織提供足夠的機械支持外，還可充當臨時的細胞生長代謝的活動場所，最終逐漸被降解并被細胞所分泌的新生的細胞外基質所替代[23，24]。在此過程中，細胞通過粘附在支架上感知外部環境的物理特性，細胞膜受體整合素會將微環境中的物理信號轉移至細胞內信號通路，使得細胞增殖、分化、遷移或凋亡[25]。因此，生物支架的物理參數例如表面的納米拓撲結構[26]、幾何尺寸與空間結構[27，28]、生物力學特征[29]等以物理信號的形式調控細胞微環境，從而指導細胞行為，使支架作為再生組織的生長模板，促進組織整合，實現可控再生。

對于生物材料的表面形貌特性(例如支柱、凹坑、管、纖維)設計，通常包括微米及納米尺度，微米級尺寸影響細胞遷移，而納米級尺寸決定受體分子的感知行為，從而影響細胞命運[30]。Fu等[31]通過選擇性激光熔化與堿熱處理方法使鈦表面形成有序微米和無序納米形貌結構，結果表明，細胞通過整合素α5和整合素β1感知材料的各向同性和各向異性線索，并通過觸發Wnt/β-catenin信號通路誘導核定向，證明該結構成功誘導間充質干細胞成骨分化。另外，生物材料的三維空間組織結構對于組織修復尤為重要。首先，生物材料的宏觀空間結構應與組織缺損適配，其次，微觀結構應為細胞提供廣泛粘附空間。Lian等[32]通過低溫沉積建模打印與冷凍干燥技術制造開發了一種具有分層多孔結構的海綿支架，該支架的特點在于高孔隙率與孔連通性以及一定的表面粗糙度，結果證明該3D多孔支架可以高效地包載間充質干細胞并顯著增強其旁分泌作用，且體內實驗結果證實該3D支架的多孔結構有效促進了血管再生。生物材料攜帶的多樣化的力學信號例如剛度、粘彈性會向細胞傳遞機械信號，細胞將機械信號轉導為與功能相關的下游信號通路與分子調節器，并調節新生細胞外基質的類型與排列，促進組織重塑[33，34]。另外，機械性能適配性的生物支架移植后表現出更理想的宿主整合效果[35]。

3.3 生物活性信號

天然的組織再生過程是一個復雜的生理事件，涉及一系列具有時空調制屬性的、多種生化信號操縱的多細胞主導的生命活動[36]，因此，解碼組織損傷后再生調控網絡中的重要靶點信息，設計具有生物活性信號的生物材料精準調控細胞行為是決定修復效果的關鍵因素之一。

常見生物活性信號包括可溶性因子、細胞外泌體、核酸小分子、活性多肽和蛋白質等，可通過化學綴合或物理負載的方式將生物活性信號與基體生物材料組裝為新型功能化生物材料[37]，靶向調控與損傷相關的任一或多個具有時間序列屬性的生理事件，如炎癥、衰老、瘢痕、干細胞募集、血管化等，由此促進組織損傷修復。例如，Zhu等[38]設計了一種具有干細胞歸巢作用的自組裝多肽水凝膠，并采用該凝膠遞送與骨關節衰老基因相關的微小核糖核酸，用以抑制軟骨細胞衰老并創造骨關節再生微環境，從而促進受損軟骨的組織修復及功能重建。Li等[39]將具有抗菌作用的多肽和長骨生長肽通過生物正交反應結合到聚醚醚酮材料表面，以獲得具有宿主防御和組織修復雙重作用的生物活性材料。Kwak等[40]研發了一種新型的負載M2型巨噬細胞(抗炎型巨噬細胞)外泌體的水凝膠系統，用于維持體內持續釋放高劑量的外泌體，以促進損傷區局部微環境內的巨噬細胞由M1型(促炎型巨噬細胞)向M2型轉變，加速局部急性炎癥消退，提高傷口愈合的速率。基于生物活性信號的靶向性及個性化屬性，設計具備生物活性信號的生物材料是否可以精準調控損傷修復微環境，是否可以加速損傷修復的關鍵。

3.4 外部刺激信號

天然組織是一個不斷產生并解碼動態線索以維持正常生理功能的系統，因此在組織再生過程中重現動態線索，例如組織中由壓電信號或細胞間信號轉導產生的電場、應變和剪切力等，具有重要意義[41]。常見外部刺激信號例如光刺激、電刺激、磁場刺激、超聲刺激、機械刺激等環境物理信號已被證實可以通過調控細胞行為驅動組織再生[42，43]。特別是，外部電刺激已在臨床上用作脊髓損傷后促進神經再生和功能恢復的輔助手段[44]。然而，由于損傷區的組織丟失或壞死，損傷區缺乏有效的信號轉導介質，因此使用外部刺激作為獨立療法具有一定的局限性。現階段研究表明，外部刺激聯合智能化響應性的生物材料可以提高信號的傳導效率。在組織修復進程中，接收了外部刺激信號的響應性生物材料在損傷組織處對信號進行翻譯并轉導為對內源性細胞有觸發意義的信號，使細胞將接收的外部刺激信號轉化為生化輸出，從而實現外部刺激精準調控細胞行為[45]。例如，Yun等[46]研究發現，包載磁性納米材料的聚己內酯支架與靜磁場聯合應用顯著增強了成骨細胞的體外堿性磷酸酶活性和成骨相關基因和蛋白質的表達。另外，成骨細胞的分化在體外提高了內皮細胞的血管生成調節相關因子表達。在體內實驗中，磁性支架與外部刺激的聯合應用加速了小鼠顱骨缺損的體內骨形成。Lei等[47]報道了一項電刺激與導電水凝膠結合用于治療深層傷口修復的研究，研究表明，原位移植到損傷區的導電水凝膠不僅可以接收并傳導內源性電流，還可以響應外部電刺激信號，促進細胞增殖并遷移至損傷深處，促進血管生成和傷口愈合。另外，通過設計異質性的響應性生物材料或編碼外部刺激參數可實現信號轉導的時間及空間可控性，達到信號按需釋放，以協調復雜的組織再生行為[48]。

4 基于生物材料的多模態組織工程策略在神經損傷修復中的應用

神經系統由中樞神經系統和周圍神經系統組成，中樞神經系統包括腦和脊髓，而周圍神經系統則包括除中樞神經系統以外的所有神經。中樞神經損傷后的再生能力極其有限，目前臨床上仍缺乏確切有效的治療方案。周圍神經損傷后雖然具有一定的再生能力，但仍有許多挑戰亟待解決，比如長距離、粗直徑、混合神經的缺損、神經瘤的形成等。神經損傷后的再生修復涉及一系列復雜的病理生理過程，一直是組織工程與再生醫學領域研究的重點難點之一。

近年來，用于神經組織工程的生物材料支架為神經損傷修復帶來了新的思路。研究表明，各類可移植生物材料支架可以填充神經損傷后形成的空腔或缺損，為細胞提供適合生長粘附的基質和適宜生存的微環境，并通過與細胞的相互作用對細胞命運施加影響，進而促進神經再生。而在促進神經再生的過程中，通過設計生物材料的物理、化學、力學、生物學等性質，進而實現“定制化設計”的生物材料-細胞相互作用是至關重要的。基于此設計策略，作者課題組在前期工作中設計了一系列“All-in-One”的多模態生物功能材料，發揮多模態再生調控信號的協同作用用于神經損傷修復。

纖維蛋白是天然細胞外基質的成分之一，在術中止血、傷口修復以及組織工程等領域有著廣泛的應用[49]。纖維蛋白的生物相容性好，降解產物無毒且具有一定促進損傷修復的作用[50]。此外，纖維蛋白表面有很多蛋白質、生長因子和細胞的結合位點，在理化性質方面具有很大的改性潛力，為實現多模態信號的生物材料支架構建提供了可能[50]。考慮到纖維蛋白材料在組織損傷修復中展現的優越性，作者課題組[51]在前期研究中利用液態接收靜電紡絲技術創新地制備了一種多級定向納米纖維蛋白水凝膠(hierarchically aligned fibrin nanofiber hydrogel，AFG)生物支架，并將該支架用于神經損傷修復。AFG具有從納米、微米到厘米尺度上的高度定向排列的拓撲結構，可為軸突的再生提供生物物理信號引導(圖2)。

同時，AFG還具有類似天然神經組織的軟力學性能，可通過力學信號的傳導影響干細胞的分化命運。作者課題組[51]前期研究中發現，AFG所提供的定向結構信號和力學信號對促進人臍帶間充質干細胞的神經源性分化具有協同作用，并可促進大鼠背根神經節神經元的快速定向排列延伸。此外，在大鼠T9背側半切脊髓損傷模型中植入AFG后，觀察到了再生的神經軸突沿AFG纖維的定向延伸，表明AFG可有效促進脊髓損傷的修復。

研究表明，血管組織可以為新生神經提供必要的營養物質。因此，在前期基礎上，作者課題組[52]聚集“神經血管再生微環境”的仿生構建，通過分子自組裝技術將各類促血管和神經營養因子的短肽，如血管內皮生長因子、腦源性神經營養因子與AFG水凝膠結合，使該水凝膠進一步功能化，得到了可協同遞送結構信號、力學信號和生物活性信號的自組裝多肽-纖維蛋白多模態功能水凝膠支架(aligned fibrin/self-assembling peptide multimodal functionalized hydrogel scaffolds，AFG/fSAP)(圖3)。

圖3 負載多模態信號的定向纖維蛋白/功能化自組裝多肽水凝膠的構建及功能示意圖[52]

體外細胞實驗表明，多模態水凝膠AFG/fSAP與單獨提供血管內皮生長因子或腦源性神經營養因子模擬肽活性信號的支架相比，能有效促進雪旺細胞的髓鞘化以及血管內皮細胞的粘附和增殖[53]。進一步的動物實驗中，免疫熒光染色、定量逆轉錄聚合酶鏈式反應和生物信息學分析結果均表明，多模態水凝膠AFG/fSAP可通過多模態信號的遞送促進神經軸突和血管的協同再生，有效實現了大鼠T9脊髓半橫斷損傷和長距離周圍神經損傷(15 mm)后的神經組織再生以及運動功能的恢復[52，54]。

除了“神經血管再生微環境”外，越來越多的研究表明，“干細胞機械力學微環境”對于調控干細胞的命運起到關鍵作用，這對于提升基于干細胞的神經損傷組織工程療法的治療效果具有重要意義。N-鈣粘蛋白是一種存在于天然中樞神經系統的糖基化跨膜蛋白，是NSC細胞間粘附的識別位點，并影響NSC分化譜系。因此，作者課題組[55]聚焦“干細胞機械力學微環境”，通過生化結合技術將N-鈣粘蛋白結合至AFG水凝膠進行功能化，得到N-cadherin-Fc修飾的多模態纖維蛋白水凝膠(aligned fibrin nanofiber hydrogel modified with N-cadherin-Fc，AFGN)支架，并將該水凝膠支架用于遞送NSC治療脊髓損傷。體外實驗結果顯示，與未經修飾的AFG支架相比，AFGN支架可通過釋放N-鈣粘蛋白生物活性信號，增強NSC對AFGN支架定向納米纖維結構和軟基質的機械力學感應，有效促進NSC在AFGN支架上的粘附、沿支架纖維方向的細胞骨架延伸以及神經元方向分化(圖4)。體內實驗結果顯示，AFGN可通過遞送多模態協同調控信號為移植的NSC“量身定制”生長微環境，精準調控移植NSC的命運，促進移植NSC在脊髓損傷區域的駐留、長期存活、免疫調節和向神經元方向分化并與宿主整合，在大鼠脊髓全橫斷損傷模型中取得了良好的治療效果。

圖4 N-cadherin-Fc修飾的多模態纖維蛋白水凝膠(AFGN)調控神經干細胞命運[55]：(a)AFGN水凝膠的制備，(b)AFGN水凝膠顯著促進神經干細胞粘附，(c)AFGN水凝膠顯著促進神經干細胞的力學傳感相關基因表達，(d)AFGN水凝膠促進神經干細胞分化為神經元與星形膠質細胞，(e)AFGN水凝膠顯著上調神經干細胞的神經元相關基因表達

設計具有多模態調控信號的生物材料可精準調控神經再生過程，而外部刺激信號也可以作為多模態信號的一部分，與生物材料聯合應用起到“協同增效”的作用。例如，磁刺激信號具有無痛、無創和深部穿透的特點，且具有調節神經細胞行為、神經保護和促進損傷后軸突再生等作用[56]。因此，作者課題組[57]聚焦“磁響應再生微環境”，在靜電紡絲的過程中使AFG內部嵌入均勻的磁性納米顆粒，開發了一種磁響應性定向納米纖維水凝膠。動物實驗結果表明，在大鼠脊髓全橫斷損傷區域移植磁響應性定向納米纖維水凝膠并在局部施加外部磁場后，該水凝膠可有效響應外部磁場信號的刺激，促進脊髓全橫斷大鼠損傷后的神經血管協同再生及運動功能重建，證實了這種多模態信號協同遞送的神經組織工程療法的優越性。

5 結 語

隨著生物醫用材料科學與工程進入“納米”、“生物”和“智能”時代，組織工程與再生醫學領域正在發生革命性變化。新一代生物醫用材料向著功能化、個性化、智能型和再生型的趨勢發展。生物材料在組織工程與再生醫學領域應用中的核心作用在于為組織/細胞構建適宜的“再生微環境”，提供必要的指導性細胞調控信號，引導組織的再生重塑過程。基于生物材料的多模態組織工程策略可通過遞送多重協同調控信號，實現對損傷區微環境和再生過程相關細胞命運的精準有序調控，激活組織再生潛能，具有廣闊的應用前景。

天然組織/器官的生長發育和損傷修復過程都是一個多種細胞參與的、具有鮮明時空調制屬性的復雜過程。因此，在損傷后組織/器官再生的過程中，巧妙利用生物材料復現組織或器官生長發育的動態過程和關鍵調控靶點，使損傷組織按照“正確”的方向進行修復，避免無功能或病理性新生組織的形成，進而實現損傷后組織的精準再生與功能重建。目前，設計并優化生物材料，使該材料負載具有時間和空間雙重異質性的調控信號，從全周期組織再生修復的視角精準調控細胞的動態行為，進而促進組織重塑，是未來組織工程和再生醫學研究的重要方向，仍存在巨大挑戰。

近年來，基于對天然組織細胞微環境和發育生物學理解的不斷深入，解析并仿生組織形成過程中細胞所處環境的關鍵信息，可以為多模態組織工程材料的設計提供靈感。生物材料為組織再生修復營造“多功能集成式的再生微環境”，例如神經血管營養微環境、免疫微環境、抗衰微環境、力學微環境等。顯而易見，新的策略勢必增加了生物材料設計的“復雜性”，因此解析并篩選出關鍵的再生調控信號，并揭示單一調控信號的作用機制尤為重要。不僅如此，實現多模態再生調控信號在生物支架材料上的有效整合和協同作用，也是研究的重要內容。

除此以外，生物3D打印技術在多模態組織工程支架的制造中展示了不可比擬的優勢和巨大的潛力。3D打印技術可以實現異質性成分和結構的精準控制，更好地實現多模態信號的集成，有望構建高度仿生智能化生物材料，并推動組織工程技術向著更高效、更先進、更智能的方向發展。同時，載細胞打印有助實現仿“生活”組織的制造，進一步實現“細胞微環境”和“非細胞微環境”的協同。

總之，基于生物材料的多模態組織工程策略將充分發揮生物材料的生物學效應，實現生物材料對干細胞、免疫細胞、組織特異性細胞的功能調控，協同促進組織再生修復和功能重建。未來有望在諸如神經等復雜組織的再生修復中發揮積極作用，甚至復雜器官的重建也將成為可能。