低濃度銅鉛脅迫對1 齡青海湖裸鯉組織中抗氧化指標的影響

李梓瑄，金文杰，李長忠

（青海大學生態環境工程學院，青海 西寧 810016）

青海湖位于青藏高原東北部，海拔3 196 m，面積4 583 km2，是中國最大的內陸半咸水湖。其獨特的地理位置和生物多樣性使周邊環境處于特殊類型的生態系統中，具有重要的生態科學研究和保護價值。青海湖裸鯉（Gymnocypris przewalskii）是青海湖中的野生珍稀魚類，對青海湖生態系統的動態平衡起重要作用。研究分析青海湖裸鯉的水環境狀況可為更好地保護青海湖裸鯉提供理論依據[1]。近年來，生態風險評價發現，青海湖及其支流水環境中存在重金屬離子，雖然整體上未達到污染水平，但有少部分區域土壤和水質污染嚴重[2-8]。重金屬對生物體有巨大影響，當其濃度超過一定范圍時對魚類有毒性作用，影響其生長發育、繁殖和代謝，甚至引起死亡[9]。目前，有關青海湖流域重金屬的研究主要集中在總量調查，包括湖泊及主要入湖河流沉積物[10,11]、河流水體、土壤、植物[12]和環湖土壤[2]等多種介質中的重金屬分布及污染分析，顯示湖泊、河流和土壤中重金屬的整體污染程度較低，污染程度依次為Cd＞Pb＞As＞Cu＞Zn＞Ni＞Cr，且來源多以自然源為主。每年青海省漁業監測站都會對青海湖區域的水質進行檢測，根據2011—2021 年監測到的數據，青海湖區域Cu 和Pb 含量均處于未檢測到的水平，青海湖區域內各重金屬含量均處于很低的水平。

重金屬脅迫使魚類會發生不同程度的氧化應激反應，形成活性氧及自由基，引發細胞脂質過氧化，破壞細胞膜的完整性，影響細胞功能[13]。重金屬脅迫會改變魚類抗氧化酶活性、谷胱甘肽系統以及誘導脂質過氧化，其中T-AOC、TP、SOD、CAT、GSH和GSH-PX 活性及MDA 含量等酶和非酶類抗氧化指標是研究中經常分析測定的參數[14,15]。魚類在重金屬脅迫下，以上指標均表現出不同程度的響應，重金屬毒害與抗氧化酶活性的變化密切相關[16,17]。魚體中多種酶活性的變化能分別反映出重金屬毒物所引起的器官及組織損傷，所以，魚體特定酶活性的變化也是檢測環境狀況簡單、直觀的指標[18,19]。在水生動物受到重金屬污染之前，生物標記物是重要的“早期預警系統”，且重金屬誘導的氧化應激反應具有組織和物種特異性差異，不同重金屬與各個氧化應激標志物之間存在差異相關性[17]。魚類的組織，特別是肝臟和腎臟，含有一些抗氧化系統，以保護機體免受由重金屬等毒害作用引起的氧化損傷[20-22]。重金屬可能通過三種吸收途徑進入生物體：由鰓、消化道和體表這三個部位直接吸收，其中鰓是魚體從水中直接吸收重金屬的重要部位[23]。

重金屬如銅（Copper，Cu）、鎘（Cadmium，Cd）、鐵（Ferrum，Fe）和鉛（Lead，Pb）等形成的螯合物在脂質過氧化反應及后續激活致癌活性過程中發揮了重要作用[24]。目前，重金屬脅迫對魚類影響的相關研究主要集中在單一種類高濃度處理后機體變化的分析[25-27]，而對低濃度復合重金屬脅迫魚類的報道較少。有研究顯示，即使在低濃度銅處理下也會導致魚體產生一定程度的毒性效應[28-31]，由此，本研究選擇低濃度Cu2+和Pb2+單一及復合脅迫后，測定青海湖裸鯉鰓、肝臟以及腎臟組織中抗氧化系統中的酶類與非酶類指標T-AOC、TP、SOD、CAT、GSH、GSH-PX 和MDA 的變化，分析不同濃度重金屬作用不同時間下對青海湖裸鯉抗氧化功能的影響，為青海湖裸鯉的人工增殖及其生活環境質量檢測提供理論依據，為了解青海湖裸鯉抗氧化應激作用機制提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究用1 齡青海湖裸鯉取自青海湖裸鯉救護中心恒溫養殖車間，體長（12.12±1.34）cm，體質量（17.18±2.23）g，先暫養于方形魚缸（1 206 mm×838 mm×910 mm）中。魚缸提前用高錳酸鉀（KMnO4）消毒浸泡2 d，然后用自來水清洗干凈，注入曝氣3 d 的自來水。暫養期間，水中的溶解氧為（7.5±0.4）mg/L，水溫（16±0.3）℃，pH（7.0±0.2），鹽度為零，每兩天換水一次，持續曝氣，實時監測水體中的各項指標。暫養期間未出現死亡，實驗前一天停止投喂及換水。暫養7 d 后開始實驗。

1.2 方法

1.2.1 實施方案及取樣

將小型水族箱（500 mm×300 mm×445 mm）用高錳酸鉀（KMnO4）消毒浸泡2 d 后，用自來水清洗干凈，注入曝氣3 d 的自來水，隨機放入暫養的魚，每個缸中15 尾，另設置兩組平行，處理4 d 后。經MS-222 麻醉，取鰓、腎臟、肝臟液氮速凍后轉移到-80 ℃冰箱中保存，用于測定抗氧化相關指標。

稱取11.172 mg CuSO4·5H2O 加入300 mL 蒸餾水配制成10 mg/L 的Cu2+母液。將母液稀釋100 倍后得到0.01 mg/L 的Cu2+溶液（溶液1）。稱取23.962 mg Pb（NO3）2加入300 mL 蒸餾水配制成50mg/L 的Pb2+母液。將母液稀釋1 000 倍后得到0.05 mg/L 的Pb2+溶液（溶液2）。在上述相同規格的小型水族箱中注入30 L 自來水，分別加入1.2 mL 溶液1，6 mL 溶液1，30 mL 溶液1，1.2 mL 溶液2，6 mL溶液2，30 mL 溶液2，1.2 mL 溶液1 和1.2 mL 溶液2，6 mL 溶液1 和6 mL 溶液2，30 mL 溶液1 和30 mL 溶液2。

實驗開始時，將暫養魚隨機放置在9 個低濃度重金屬脅迫組，分別為Cu2+0.000 4 mg/L、0.002 mg/L、0.01 mg/L 和Pb2+0.002 mg/L、0.01 mg/L、0.05 mg/L 及Cu2++Pb2+=0.000 4 mg/L+0.002 mg/L、Cu2++Pb2+=0.002 mg/L+0.01 mg/L、Cu2++Pb2+=0.01 mg/L+0.05 mg/L 的小型水族箱中，每個濃度設置三個平行，每個缸中15 尾魚。在以上條件下脅迫0 h、6 h、12 h、24 h 和48 h 后取樣，每個平行取3 尾魚。經MS-222 麻醉，取鰓、腎臟、肝臟液氮速凍后轉移到-80 ℃冰箱中保存，用于測定抗氧化相關指標。

1.2.2 抗氧化相關指標的測定

將低濃度重金屬脅迫后的魚鰓、腎臟和肝臟制備組織勻漿液，采用南京建成生物工程研究所的試劑盒測定了T-AOC（A015-3-1）、TP（A045-3）、CAT（A007-1-1）、SOD（A001-3）、GSH-PX（A005-1）和GSH（A006-1-1）活力及MDA（A003-1）含量等抗氧化指標。

1.2.3 數據分析

實驗數據以平均值±標準差（±SD）表示，采用IBM SPSS Statistics 26 中的One-way ANOVA 進行單因素方差分析，使用LSD 檢驗不同濃度重金屬離子組之間的差異性，P ＜0.05 表示差異顯著，并使用Origin 2021 做柱形圖。將三種濃度、三種處理脅迫后不同時間青海湖裸鯉三種組織中抗氧化能力相關指標的測定數據應用HemI 1.0.3.7 軟件進行分析作圖。

2 結果與分析

2.1 裸鯉幼魚鰓、腎臟和肝臟組織中相關的抗氧化指標

裸鯉幼魚鰓、腎臟和肝臟組織中T-AOC、TP、過CAT、SOD、MDA、GSH-PX、GSH 等指標的檢測結果如圖1 所示。青海湖裸鯉幼魚正常狀態下鰓、腎臟和肝臟組織中T-AOC 含量大小依次為肝臟＞腎臟＞鰓（P＜0.05）；TP 含量大小依次為腎臟＞肝臟＞鰓（P＜0.05）；CAT 活性高低依次為鰓＞腎臟＞肝臟（P＜0.05）；SOD 活性高低依次為鰓＞肝臟＞腎臟（P＜0.05）；MDA 含量大小依次為鰓＞肝臟＞腎臟（P＜0.05）；GSH-PX 活性高低依次為肝臟＞鰓＞腎臟（P＜0.05）；GSH 含量多少依次為肝臟＞鰓＞腎臟（P＜0.05）。

圖1 青海湖裸鯉幼魚鰓、腎臟和肝臟組織中相關抗氧化指標的檢測結果Fig.1 Antioxidant indices in gills,kidneys and liver tissues of juvenile G.przewalskii

2.2 不同低濃度Cu2+、Pb2+及兩者復合脅迫后不同時間青海湖裸鯉幼魚鰓、腎臟和肝臟組織中抗氧化能力相關指標含量

三種低濃度Cu2+、Pb2+及兩者復合脅迫6 h、12 h、24 h 和48 h 后青海湖裸鯉幼魚鰓、腎臟和肝臟組織中抗氧化能力相關指標的測定結果以熱圖（HemI）方式呈現（圖2）。熱圖中不同的顏色來表示各個測定結果相對于對照組測定值的增減、高低，可直觀地看出青海湖裸鯉幼魚三種組織中抗氧化能力相關指標在三種濃度、三種處理脅迫后不同時間的變化趨勢。青海湖裸鯉幼魚鰓、腎臟和肝臟組織中T-AOC、TP、CAT、SOD、MDA、GSH-PX、GSH 等指標在三種濃度、三種處理脅迫后不同時間呈現出一定的變化趨勢，其中，鰓、腎臟和肝臟組織中的TP、GSH 均顯著升高而以TP 的升高更為明顯；鰓、腎臟和肝臟組織中的CAT、SOD、GSH-PX 升高的幅度小于TP、GSH 的升高幅度，且在三種組織中升高的幅度各異；鰓、腎臟和肝臟組織中的T-AOC、MDA 均大多數明顯降低，極少部分變化幅度不大。

圖2 三種濃度、三種處理脅迫后不同時間青海湖裸鯉幼魚三種組織中抗氧化能力相關指標的熱圖分析Fig.2 Heat map analysis of antioxidant capacity related indices in juvenile G.przewalskii exposed to three concentrations at different time

3 討論

不同種類不同濃度的重金屬在魚類體內引起的抗氧化應激反應有所不同，而多種重金屬復合存在與單一重金屬條件下機體抗氧化應激后的指標變化情況也有所不同[32]。重金屬復合的毒性效應隨重金屬濃度和種類的不同而顯現出不同的表象[33]。不同重金屬同時存在時會產生不同的作用方式，包括協同作用、拮抗作用和加和作用[34]。在正常的生理條件下，細胞受到抗氧化防御系統的保護，可免受自由基產物和過氧化物等引起的氧化破壞。抗氧化防御系統可以分為兩類，即酶類和非酶類。酶類包括SOD、CAT、GSH-Px 和谷胱甘肽巰基轉移酶（Glutathione-s-transferase，GST）等主要的抗氧化應激與抗衰老酶。非酶抗氧化防御系統主要包括GSH和氧化型谷胱甘肽（Oxidized glutathione disulphide，GSSG）等[35,36]。

機體中存在多種抗氧化的大分子、小分子及酶類，清除由外部應激體內產生的各種活性氧，阻止機體的氧化應激反應，保護機體免受損傷。魚類的生長依賴于蛋白質的持續合成，總蛋白也在魚體中起著維持滲透壓平衡、運輸代謝物及解除毒性和發揮免疫功能的作用。當機體受到外界環境因子影響時，SOD 將過氧化物離子歧化為O2和H2O2，以清除有害的ROS，維持機體的穩定[37]。氧化物可以激活CAT 的表達，將超氧化物轉化為H2O 和O2，防止過氧化物轉化為羥基自由基有毒性的ROS[38]。機體通過酶系統與非酶系統產生氧自由基，氧自由基可以攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引發脂質過氧化作用形成MDA，放大ROS 的作用，因此機體內MDA 的含量可以反映出機體內脂質過氧化的程度，間接反映出細胞損傷的程度。SOD 活力的高低間接反映了機體清除氧自由基的能力，MDA 的高低又間接反映了機體細胞受自由基攻擊的程度。GSH 作為一種低分子清除劑可以清除O2-、H2O2和LOOH，衡量機體抗氧化能力，缺乏GSH 會促使化學物質或環境因素產生中毒作用或加重中毒作用。GSH 是GSH-Px 的底物，GSH-Px 可以催化H2O2與GSH 生成H2O 及GSSG，保護細胞膜結構和功能的完整性。本實驗中不同濃度重金屬復合脅迫下，T-AOC、TP、SOD、CAT、GSH、GSH-PX 和MDA 活性及含量都發生了不同的變化，表明青海湖裸鯉在實驗條件下受到不同程度的重金屬毒害作用。以往研究表明，在重金屬脅迫下，魚類的抗氧化系統指標都有不同程度的變化[39]，鯉（Cyprinus carpio）[40]、金魚（Carassius auratis）[41]、斑馬魚（Danio rerio）[42]和南亞野鯪（Labeo rohita）[43]中也有類似的報道。以上表明，重金屬脅迫致使魚類活性氧增多，機體為削減活性氧造成的損害，其體內抗氧化酶系統相關指標變化以清除過多活性氧。

在本研究中，比較青海湖裸鯉不同組織內同一指標的分布情況發現，SOD、CAT 和MDA 均在鰓中分布最廣，其中SOD 和MDA 在鰓、腎臟和肝臟組織中的分布情況均為鰓＞肝臟＞腎臟。SOD-CAT為抗氧化系統的第一道防線，鰓是魚體直接接觸水體的器官，所以在鰓中分布自然廣泛[44]。GSH 和GPx 則在肝臟組織中分布最廣，T-AOC 也在肝臟中最強，可能是肝臟作為魚體最重要的解毒器官，也是碳水化合物、脂質和蛋白質許多代謝反應代謝的重要部位[45]。因此，鰓中重金屬的含量反映了魚體生活水體的濃度，而肝臟中重金屬的含量代表了其在水體中儲存下的濃度[46]。

本實驗結果顯示，在低濃度Pb2+及Cu2++Pb2+脅迫下顯著抑制CAT 活性。短期低濃度重金屬復合脅迫會抑制CAT 的活性，與高濃度單一重金屬對CAT的影響相同[19]。本實驗結果中，各組別重金屬脅迫下青海湖裸鯉鰓中T-AOC 均高于空白對照組，6 h、12 h 和24 h 后鰓中SOD 均升高，在48 h 時輕微降低。12 h 和24 h 時腎臟組織中高于空白對照組，復合脅迫下肝臟中SOD 整體活性低于單一脅迫。MDA 與SOD 聯系緊密。本實驗結果發現，復合脅迫下MDA 含量較高，受損傷程度更嚴重，且在腎臟組織中隨著時間的變化表現出先升高后逐漸降低的趨勢。GPx 在不同重金屬脅迫不同時間后也表現出先升高后抑制的趨勢，作為底物的GSH 同樣存在以上變化趨勢。銅離子濃度對水生動物抗氧化酶活性的影響表現為低濃度誘導，高濃度抑制，這與其他重金屬離子對抗氧化酶活性的影響相類似[47]。而魯雙慶等[48]則認為，低濃度的Cu2+誘導細胞產生大量的自由基，導致抗氧化酶活性的升高，高濃度Cu2+會增加自由基反應速度，使得那些未被及時清除的自由基損害細胞并破壞其結構，加速細胞的衰老，最終導致抗氧化酶的活性降低。汞低濃度、短期暴露下抗氧化酶活性升高，但是，隨著暴露時間的延長，酶活性降低，甚至被抑制[49]。這種現象被定義為生物的“毒物興奮效應”[50]，大量研究表明[51,52]，同種重金屬在不同濃度條件下對同一生理反應會產生相反的效應，即低濃度的重金屬對機體正常生理生化代謝有一定的促進作用，而高濃度的重金屬則會抑制正常的生理生化過程。這可能是由于生態因子的綜合作用所導致。這種生態因子的綜合作用會影響重金屬離子在魚體內的吸收、積累和毒性作用[53-55]。

總之，重金屬復合污染與各種重金屬在環境中的濃度及其組合關系、生物的種類、部位和暴露方式等因素密切相關，機理極為復雜，不僅僅是簡單的協同、拮抗或加和作用。重金屬復合脅迫的機理也不可能是簡單的對各重金屬單獨脅迫下機理的加和，不同區域水環境的化學參數、水生生物的種類和年齡等因素均可改變重金屬聯合毒性的影響[56-58]。

低濃度Cu2+、Pb2+復合脅迫青海湖裸鯉各組織中含有的抗氧化相關指標不同。TP 在腎臟中分布最豐富，CAT、SOD 和MDA 在鰓中分布最豐富，T-AOC、GSH 和GPx 在肝臟組織中分布最豐富。總體而言，抗氧化系統主要在魚體鰓和肝臟組織中發揮更大作用。低濃度Cu2+、Pb2+復合脅迫不同時間后對青海湖裸鯉抗氧化防御系統產生影響，引起體內各組織中指標的變化，總的來說在低濃度脅迫下SOD、MDA、GSH 和GPx 先被誘導升高隨后逐漸降低，TP 和CAT 總體下調，T-AOC 升高，抗氧化系統被激活以應對重金屬的毒害作用。單一Cu2+與Pb2+脅迫與復合脅迫相比，復合脅迫下組織損傷程度更嚴重，Cu2+-Pb2+存在協同作用。各抗氧化指標在鰓、腎臟和肝臟中均表現出不同程度的響應，共同發揮作用，抵御重金屬對機體產生的不利影響。

實際環境中重金屬很少會以單元素形式存在，一般均為兩種或兩種以上重金屬共存，即多種元素形成的化合物或金屬螯合物。目前對單一重金屬毒性作用機理已有較深理解，但對多種污染物聯合毒性的作用及其機理的研究還不深入。兩種或兩種以上重金屬同時作用于魚類時，常常可能導致與單一重金屬毒害作用不相同的毒性效應。青海湖地區及其支流近年來生態環境良好，水域重金屬含量均遠遠低于國家漁業水質標準（GB11607-89）規定的臨界值。低劑量重金屬脅迫下對分子毒理學進行研究不僅能揭示魚類的解毒機制，還能篩選出環境退化的早期預警分子——生物標志物。研究重金屬離子影響下各類應答基因的表達，可為青海湖裸鯉的保護和人工繁育提供保障，為漁業養殖水體的安全監測提供理論參考。