閾下抑郁動物模型的造模與評價方法研究進展

申鵬云，孫小茁，周勝元

1 天津中醫藥大學研究生院，天津 301617；2 天津中醫藥大學第二附屬醫院治未病中心

抑郁癥（MDD）是一種慢性精神疾病，也是最嚴重的精神疾病之一，其能夠損害人的精神以及軀體功能，已經成為21世紀自殺率上升的重要原因［1］。閾下抑郁（SD）是處于健康和MDD之間的一種狀態，指具有某些抑郁的臨床癥狀，但由于病程或者癥狀不滿足MDD診斷標準的一種狀態或一類個體［2］，具體表現為輕度焦慮、精神緊張、情緒失落、興趣減退、敏感善疑、思維減慢、煩躁失眠等［3］。根據亞健康的定義，SD屬于心理亞健康狀態，具有向疾病或健康狀態轉變的特點［4］，這一觀點也得到了張金鵬等［5］、有明妍等［6］研究的支持。相較于健康人群，SD人群更容易發展為MDD。研究發現，許多SD患者在隨訪中有持續的抑郁癥狀，1/3～1/2的患者報告有中度功能障礙，10%～25%的患者會在幾年內發展成MDD。因此，雖然SD還未達到MDD的程度，但是如果任其發展，將帶來嚴重的后果，是一種不可忽視的疾病［7-8］。SD動物模型的建立對于探索其發病機制具有重要意義，有助于減少其發病并指導其治療。但目前醫學界對于SD的認知還處于起步階段，動物實驗更少，原有的動物模型也幾乎是由MDD動物模型演化而來，更有部分研究直接照搬MDD動物模型，且關于SD模型的評價方法也缺少統一的標準。本文對SD動物模型的造模方法與評價方法作一綜述，為研究者根據實際需求選用合適的造模方法和模型評價方法提供參考。

1 SD動物模型的造模方法

SD屬于心理亞健康狀態，處于健康與疾病之間。在動物實驗中，通常使用小鼠和大鼠模擬SD癥狀，可以通過測量動物的行為表現、神經遞質水平、神經元活動等指標來評估動物是否出現了SD癥狀，并探討其可能的治療方法。由于SD與MDD是平行的兩個概念，而二者之間也存在遞進關系，所以SD與MDD動物模型的造模方法基本一致，都是通過給予模型動物一定應激源，如孤養、空瓶應激、晝夜顛倒等，模擬人類不健康生活和習慣引起的抑郁情緒等。但是，要使實驗動物在研究期間能夠維持SD狀態，還需要進一步研究驗證實驗中的應激源刺激量和造模時間［9］。目前常用的SD造模方法有不完全性慢性不可預知性溫和刺激法、藥物誘導法、閾下社會挫敗應激法、光周期紊亂法、快速眼動睡眠剝奪法、基因突變法等。

1.1 不完全性慢性不可預知性溫和刺激法 在使用這個方法造模過程中，動物會接連受到各種不同類型的應激，如冷水浴、電擊、不規律飲食和水源、孤養、空瓶刺激、光源紊亂等，而且應激的種類和時間都是無法預測的，該模型可以模擬出長期慢性壓力對人們產生的負面影響。一般情況下，MDD動物模型的建立會在28 d內每日施加不規律的刺激，而SD動物模型可以間隔時間給予應激源。孟彥［10］在建立心理亞健康動物模型時，僅在21 d的應激期里每天給予空瓶刺激10 min，再隨機選取其中9 d予以飲食不規律、晝夜紊亂、社會挫敗應激；該造模方法與慢性不可預知性溫和刺激法的模型建立方法完全相同，只不過是在刺激量以及時間上有所縮短，來模擬人類生活中相對較輕的負面影響而形成的SD狀態；經過驗證，該法并未造成大鼠明顯生理病理改變，僅有輕微焦慮、活動減少等表現，也表明了該方法是可行的。

1.2 藥物誘導法 在使用該方法建立的模型中，研究者會使用一些特定的藥物及方法誘發抑郁和焦慮等情緒障礙，常用的藥物有利血平、激素（去甲腎上腺素、氫化可的松、皮質酮、促腎上腺皮質激素）、五羥色氨、苯丙胺、育亨賓、阿樸嗎啡等。其中，利血平誘導法最為常用且成熟，激素誘導僅次于利血平誘導法。使用該方法建立的模型可以幫助研究者更好地理解藥物對情緒障礙的影響機制。在MDD動物模型建立過程中，每天需按體質量注射一定量藥物，誘導時間為10～42 d［11］。目前還沒有研究使用藥物來誘導建立SD模型，但馮飛等［12］研究發現，利血平4 mg/kg是建立MDD模型最為合適的劑量。因此，如果使用該法誘導建立SD模型時可以相對減少藥物劑量以及縮短誘導時間。藥物誘導的動物模型既可預測抗抑郁藥物的治療效果，還能探索抑郁的潛在機制，操作簡便、易行，多用于抗抑郁藥物的初篩。

1.3 閾下社會挫敗應激法 閾下社會挫敗應激法是將實驗動物暴露于反復的社交壓力下，比如在一個競爭性的社交環境中與強壯的同伴對抗［13］。這種持續的社交壓力會導致實驗動物出現多種行為和生理學改變，包括情緒和認知缺陷、代謝障礙、免疫功能受損等。相較于慢性社交挫敗應激模型，該方法降低了刺激強度和刺激周期，引起小鼠輕度快感缺乏和不明顯的社交回避行為，可以模擬現實生活中同輩壓力帶來的情緒失落、敏感善疑等SD表現。當前有研究采用該方法建立動物模型用于檢測小鼠對應激刺激的敏感性［14］，尚未應用在SD動物造模中，仍需進一步研究驗證。

1.4 光周期紊亂法 光周期是調節動物在24 h內生物節律的重要因素之一，光周期紊亂法是指通過改變光照時間和暗度擾亂其生物節律，從而導致其產生抑郁表現的一種方法。光作為外部刺激，可通過視網膜和松果體傳遞到大腦中樞神經系統，導致身體產生一系列激素和神經傳遞物質的變化，并影響到生物鐘的節律。動物如果被暴露在相對較長的黑暗時段中，這種環境可以模擬出季節性情感障礙，即冬季抑郁癥，主要表現為沮喪、焦慮、厭食、失眠以及焦慮等。根據發病機制可以適度調整光周期來建立SD動物模型，這個模型對于理解動物的行為和代謝適應具有重要意義，也可反映環境因素對生物體生理學調節的重要性［15-16］。

1.5 快速眼動睡眠剝奪法 在使用這個方法建立模型時，實驗動物會被隔離在一個新環境中，并且在睡眠時會受到強制性干擾，如輕微電擊等。胡曉輝等［17］使用小平臺水環境法將大鼠放置在高于水面1 cm的水槽中，睡眠時肌張力降低的大鼠會落入水中，從而剝奪其睡眠，導致其出現抑郁樣行為，且發現剝奪時間與抑郁行為的嚴重程度呈正相關關系。相關研究表明，睡眠剝奪可對人體產生較大影響，并引起情緒、行為、學習、記憶等方面的失調，表現出與SD相似的癥狀，而SD患者也常伴隨睡眠方面的問題［18］。該方法簡單易行，變量較少、可控，造模時間短，非常適用于SD動物模型的建立。

1.6 基因突變法 一些基因突變可以導致人類出現情緒障礙，比如MDD和雙相情感障礙等。因此，研究者會使用轉基因技術來建立這類具有基因缺陷的動物模型，以便更好地研究情緒障礙的發病機制。然而，目前發現的遺傳基因位點的可重復性和特異性均較差，仍不能精確建立SD動物模型，尚需進一步對SD的遺傳機制和遺傳位點進行研究，為未來轉基因動物模型的建立提供依據［19］。

2 SD動物模型的評價方法

2.1 行為學評價 常用的行為學評價方法有蔗糖偏好實驗、懸尾實驗、高架十字迷宮實驗、明暗箱實驗、曠野實驗、強迫游泳實驗等，除此之外，還有一些比較少見的評價方法，如休克逃避實驗、顱內自刺激實驗、新奇抑制攝食實驗、灑水實驗、水迷宮實驗等。這些評價方法的操作雖不一樣，但都是為了檢測動物快感缺乏、焦慮恐懼、絕望等情緒變化。

2.1.1 蔗糖偏好實驗 蔗糖偏好實驗能夠反映動物的快感缺乏，而快感缺乏是MDD的核心評價指標，也能夠在一定程度上反映SD的興趣減退等癥狀。既往當大鼠糖水偏愛率＜50%且相對對照組下降＞30%時，被認為MDD造模成功。張瀟等［20］建立的SD大鼠模型糖水偏愛率約為54.0%，對照組約為78.6%，這表明模型動物還未達到MDD的快感缺乏嚴重程度，但是存在一定抑郁癥狀，符合SD的特點。

2.1.2 懸尾實驗 懸尾實驗能夠反映動物的行為絕望狀態，通過尾巴固定將小鼠懸掛6 min，記錄后4 min小鼠靜止不動的時間占比，一般健康小鼠為100 s左右，不動時間越長表明抑郁絕望程度越嚴重。楚玉璽等［21］建造的小鼠抑郁模型不動時間為178 s左右。因此，SD動物模型懸尾實驗的不動時間應當介于MDD模型和健康對照模型之間。

2.1.3 高架十字迷宮實驗 高架十字迷宮實驗能夠反映動物的焦慮狀態，具體操作方法是將動物放置于距離地面一定高度的十字架上，模擬人類在高空時的恐懼、焦慮、不安等心理狀態［22］。十字架一支為有保護區，一支為無保護區，一般記錄動物5 min內在保護區和非保護區的時間占比，用于反映模型動物的焦慮嚴重程度，無保護區停留時間越短提示焦慮程度越嚴重。有研究總結過往實驗中健康對照組無保護區停留時間占比為20%～40%，抑郁模型組無保護停留時間占比＜20%［23］。建造SD模型后使用高架十字迷宮實驗進行評價時，無保護區停留時間占比應為20%左右，且明顯高于抑郁組、低于空白組，可以定義為模型建立成功。

2.1.4 明暗箱實驗 明暗箱實驗是利用動物對明亮地方具有天然的厭惡和好奇傾向而設計出來的，以暗箱中活動時長、穿箱次數、在明暗箱的活動時長以及活動頻次等為檢測指標，通常高焦慮水平的動物在明箱中活動的時間和頻次會明顯低于低焦慮水平的動物［24］。

2.1.5 曠野實驗 曠野實驗是經典的較常用的情緒相關行為學檢測實驗，其基于動物對陌生開放場地的摸索好奇以及慌張畏懼情緒，通過記錄動物首次進入中央區的潛伏期、中央區停留時間、穿行次數、總運動路程、時間、速度、水平爬格次數、垂直站立次數等指標判斷模型動物的抑郁情況［25］。MDD模型的上述指標均低于健康對照模型。由于當前模型動物種類繁多，實驗方法和場地也有差異，因此未能明確指標數值，具體實驗中可參考其他評價指標。

2.1.6 強迫游泳實驗 強迫游泳實驗是將動物放置在狹窄的注水空間中5～6 min，實驗動物最開始會掙扎一段時間，之后會表現出靜止不動的行為絕望狀態，觀察其不動、攀爬和游泳的時間，以此判斷實驗動物的抑郁程度。正常嚙齒類動物的不動時間占檢測時間的30%～80%，不動時間占比越高提示抑郁程度越嚴重。然而SD個體在癥狀上不至于出現絕望或自殺行為，因此SD動物模型的強迫游泳實驗結果與空白對照比較應無明顯差異或差異較小［26］。

2.2 體征觀察、體質量測定 觀察動物皮膚毛色、精神行為狀態、進食情況、體質量變化等，可以反映動物的抑郁情況。正常動物眼睛明亮、性情溫和、鼻唇干凈、皮毛光澤、自主活動多、體質量增長正常。受到應激的SD動物模型會表現出不同程度的攻擊性、精神萎靡、皮毛光澤度下降、自主活動減少、體質量增長異常等。

2.3 臟器指數測定 臟器指數是將動物處死解剖，稱重清洗后的心肝脾肺腎等器官，以此反映動物器官是否有明顯病變，判斷機體是否發生器質性損傷。SD屬于亞健康狀態，病理上不會出現明顯的臟器腫脹、出血、萎縮等變化。因此，臟器指數某種程度上可以從側面客觀評價模型建立是否合理［20］。

2.4 腦成像檢查 SD模型動物也會出現與人類相近的神經影像異常。ACCROMBESSI等［27］建立了青春期SD動物模型，發現其前額葉皮層、運動和軀體感覺皮層、導水管周圍灰色核、紅色核、紋狀體、伏隔核、海馬體、杏仁核、丘腦和小腦均存在不同程度的代謝活動增強，這與人類抑郁患者的腦成像檢查變化相似。

綜上所述，動物模型是開展SD動物實驗的基礎，動物實驗能夠使我們進一步探究SD的內在發病機制，從而為SD的臨床診斷和治療提供更多參考依據。許多情緒疾病的動物模型造模方法及評價方法已有統一的參考標準和專家共識，然而已有的SD動物造模研究較少，多是將MDD造模方法進行修改，減少其應激源刺激量和刺激時間，從而建立SD動物模型。SD造模的精確應激源刺激量、刺激時間或誘導藥物量等均缺乏統一且準確的認識，評價方法也多以MDD動物實驗評價指標作為參考，或者以健康對照組和MDD組之間差異具有統計學意義作為造模成功的標志，這樣的方法無疑是存在爭議的。即便造模成功，SD模型可能向MDD或健康狀態轉變，如何確保建造的動物模型一直處于SD狀態，這也是值得探討的問題。因此，研究者應根據實際需求選用合適的造模方法和模型評價方法，以尋求最佳的實驗結果。