基于AMPK信號通路的附子在不同機體狀態下對神經—內分泌—免疫網絡的生物學效應表達機制研究

王智威 邸松蕊 黃鵬力 謝辰雨 王一帆 張建軍 朱映黎

機體狀態是中藥藥性生物效應表達的載體,機體狀態不同,中藥藥性作用于機體的生物學效應亦不同[1]。神經—內分泌—免疫(neural-endocrine-immune system ,NEI)網絡將神經、內分泌、免疫三大系統相互間的作用作為整體進行研究,以神經遞質、激素、細胞因子等全面系統調控人體功能。研究表明,機體狀態不同,NEI相關指標亦有不同[2-8]。由此表明,NEI網絡對中藥基于不同機體狀態的生物學效應表達發揮著重要作用。

腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activiated protein kinase,AMPK)被稱為細胞的“能量感受器”[9],通過調節下游基因靶點[10]脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FASN)影響中樞神經系統以及神經網絡的結構[11-12];通過調控下游靶點[13]6-磷酸果糖激酶-2/果糖-2,6-二磷酸酶3(6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-biphosphatase 3,PFKFB3)產生細胞因子調節免疫系統功能[14-16];調節下游靶點固醇調節元件結合蛋白1c (sterol regulatory element binding protein-1c,SREBP-1c)[10],而SREBP-1c又能夠進一步調節下游硬脂酰輔酶A去飽和酶1(stearoyl coenzyme A desaturase 1,SCD1)基因表達[17],影響內分泌系統功能[18];除此之外,還可以調節上游靶點[19]胰島素受體底物2(insulin receptor substrate,IRS2)影響物質代謝,在神經、內分泌、免疫系統中均發揮一定調控作用[20-22]。因此,AMPK信號通路可通過作用于IRS2、FASN、PFKFB3、SCD1基因靶點調節機體NEI網絡,是連接NEI網絡的主要信號通路之一。

附子為毛茛科烏頭屬中藥,辛、甘,大熱,可回陽救逆,補火助陽,散寒止痛,為“回陽救逆第一要藥”,臨床常用于治療風寒濕痹疼痛[23]。研究表明,辛熱中藥附子作用于寒熱不同機體狀態會引起NEI網絡相關指標生物效應不同的改變,但基于AMPK信號通路調節NEI網絡相關機制研究尚未見報道。因此,本研究以NEI網絡為切入點,對辛熱中藥附子通過AMPK信號通路調節FASN/PFKFB3/SCD1/IRS2基因作用于寒熱不同機體狀態小鼠的生物學效應表達機制進行研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性KM小鼠84只,體質量(20±2)g,購自維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK(京)2021-0011],飼養于北京中醫藥大學SPF級實驗動物中心。動物房室溫為22～26℃,相對濕度60%～70%,光照周期12小時。

1.2 實驗藥物、試劑與儀器

受試藥由中藥飲片煎煮濃縮制備:附子(四川同創康能藥業有限公司,批號:200701),取500 g附子,10倍量水浸泡1小時,分兩次煎煮,每次1.5小時,濃縮后放于4℃冰箱貯存備用。

氫化可的松琥珀酸鈉(常州四藥制藥有限公司,批號:20210811D1);醋酸地塞米松片(上海上藥信誼藥廠有限公司,批號:501210402)。環腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)試劑盒(批號:L211201973)、環鳥苷酸(cyclic guanosine monophosphatec,cGMP)試劑盒(批號:L211228447),以上試劑盒由北京拜爾迪生物技術有限公司提供。去甲腎上腺素(norepinephrine,NE)試劑盒(批號:E20220720-20570A)、多巴胺(dopamine,DA)試劑盒(批號:E20220720-20273A)、5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)試劑盒(批號:E20220720-24791A)、三碘甲狀腺原氨酸(triiodothyronine,T3)試劑盒(批號:E20220720-20591A)、甲狀腺素(thyroxine,T4)試劑盒(批號:E20220720-20401A)、補體C3(complement 3,C3)試劑盒(批號:E20220720-20210A)、補體C4試劑盒(批號:E20220720-20211A)、免疫球蛋白G(immunoglobin G,IgG)試劑盒(批號:E20220720-20509A)、免疫球蛋白M(immunoglobin M,IgM)試劑盒(批號:E20220720-20513A),以上檢測試劑盒均購自上海酶聯生物科技有限公司。RNA提取液(貨號:G3013),購自Servicebio。

電子天平(型號:PL-203),梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;酶標分析儀(型號:DR-200BS),無錫華衛德朗儀器有限公司;臺式離心機(型號:TGL-16c),上海安亭科學儀器廠;冷凍離心機(型號:neofuge15R),HealForce;全自動生化分析儀(型號:Chemray-240),深圳雷杜生命科技;研磨儀(貨號:KZ-Ⅲ-FP),Servicebio;臺式高速冷凍型微量離心機(貨號:D3024R),DragonLab;熒光定量PCR儀(貨號:CFX),Bio-rad。

1.3 分組與給藥

適應性喂養7天后,84只小鼠按體質量進行編號,再按照隨機數字表法分為7組,每組12只,分別為:空白組、虛熱模型組、虛寒模型組、虛熱附子低劑量組、虛熱附子高劑量組、虛寒附子低劑量組、虛寒附子高劑量組。每日上午(7:00)進行灌胃,虛熱、虛寒附子低劑量組給予附子生藥量10 g/kg,虛熱、虛寒附子高劑量組給予附子生藥量20 g/kg,灌胃劑量為1.2 mL/100 g;空白組、虛熱模型組和虛寒模型組于灌胃等劑量蒸餾水,連續給藥14天。

1.4 造模方法

適應性喂養7 天后,每日下午(16:00)空白組給予等量蒸餾水,虛熱組小鼠灌胃醋酸地塞米松(0.35 mg/kg)、虛寒組小鼠灌胃氫化可的松琥珀酸鈉(35 mg/kg),制備虛熱、虛寒模型,根據體質量調整灌胃劑量,連續造模14天;模型表現同文獻一致[24-26],表示造模成功。

1.5 取材方法

實驗第15天,采用摘眼球取血,室溫靜置2小時,在4℃條件下以3000 r/min離心15分鐘后取上層血清,留存用于血清指標的檢測。冰上取小鼠腎臟稱重后快速放于液氮中,后轉入-80℃冰箱保存,用于指標檢測。

1.6 指標檢測

1.6.1 一般觀察 實驗期間記錄各組小鼠造模給藥后毛發、精神活動狀態以及每3天小鼠體質量的變化。

1.6.2 檢測血清cAMP、cGMP指標 采用酶聯免疫吸附法,按照ELISA 試劑盒步驟操作進行,完成后置于酶標儀測定吸光值,根據標準曲線計算,檢測cAMP、cGMP水平。

1.6.3 血清中神經遞質NE、DA、5-HT檢測 采用酶聯免疫吸附法檢測小鼠血清中去甲腎上腺素NE、DA、5-HT含量水平,完成后置于酶標儀測定吸光值,根據標準曲線算出。

1.6.4 血清T3、T4檢測 根據試劑盒說明書,酶聯免疫吸附法檢測小鼠血清中內分泌物質T3、T4含量水平。

1.6.5 血清C3、C4、IgG、IgM檢測 采用酶聯免疫吸附法檢測小鼠血清中C3、C4、IgG、IgM含量水平,具體操作步驟參考試劑盒說明書。

1.6.6 檢測心臟組織FASN、SCD1、IRS2、PFKFB3的mRNA表達 利用反轉錄—熒光定量PCR法(reverse transcript quantitative PCR,RT-qPCR)測定四種基因mRNA表達。具體引物序列見表1。反應體系包含1.0 μL cDNA、10 μmol/L引物0.3 μL,Premix Taq 5 μL,EvaGreen 0.5 μL,加ddH2O補充至10 μL,95℃ 5分鐘預變性后,95℃10秒→60℃30秒,40個循環。采用2-ΔΔCt分析相對基因表達差異。

表1 引物序列

1.7 統計學方法

2 結果

2.1 附子對虛熱、虛寒機體狀態小鼠一般狀況及體質量的影響

與空白組比較,虛熱模型組小鼠出現毛發偏黃、大便秘結、小便黃、暴躁易怒等現象,虛寒模型組小鼠出現精神萎靡、被毛無光澤、活動減少、抱團等現象。與虛熱模型組比較,附子組小鼠癥狀加重;與虛寒模型組比較,附子組小鼠精神狀態有很大程度改善。

與空白組比較,虛熱模型組和虛寒模型組小鼠體質量在第7天均開始顯著降低(P<0.01,P<0.05);與虛熱模型組比較,虛熱附子低劑量組小鼠體質量在第14天顯著升高(P<0.05),而虛熱附子高劑量組小鼠體質量未有改善,變化趨勢與虛熱模型組相似;與虛寒模型組比較,虛寒附子高劑量組體質量在第14天顯著升高(P<0.05)。結果見表2。

表2 附子對虛熱、虛寒機體狀態小鼠的影響小鼠體質量的影響

2.2 附子對虛熱、虛寒機體狀態小鼠血清環核苷酸水平的影響

與空白組比較,虛熱模型組cAMP、cAMP/cGMP含量顯著升高(P<0.05,P<0.01),虛寒模型組cAMP、cAMP/cGMP含量顯著降低(P<0.01),而cGMP含量顯著升高(P<0.01)。

與虛熱模型組比較,虛熱附子低、高劑量組對cAMP、cGMP、cAMP/cGMP有一定的調整作用,但差異無統計學意義(P>0.05);與虛寒模型組比較,虛熱附子高劑量組cGMP含量顯著降低(P<0.01),而cAMP、cAMP/cGMP含量顯著升高(P<0.01)。結果見表3。

表3 附子對虛熱、虛寒機體狀態小鼠血清環核苷酸水平的影響

2.3 附子對虛熱、虛寒機體狀態小鼠神經遞質的影響

與空白組比較,虛熱模型組NE、DA含量顯著升高(P<0.01),5-HT含量顯著降低(P<0.01),而虛寒模型組NE、DA、5-HT含量均顯著降低(P<0.01)。

與虛熱模型組比較,虛熱附子低、高劑量組對NE、DA、5-HT有一定的調整作用,但差異無統計學意義(P>0.05);與虛寒模型組比較,虛熱附子高劑量組NE、DA、5-HT含量顯著升高(P<0.01),附子低劑量組NE、DA、5-HT含量有升高趨勢,但差異無統計學意義(P>0.05)。結果見表4。

表4 附子對虛熱、虛寒機體狀態小鼠神經遞質的影響

2.4 附子對虛熱、虛寒機體狀態小鼠內分泌水平的影響

與空白組比較,虛熱模型組T3、T4含量顯著升高(P<0.01),而虛寒模型組T3、T4含量顯著降低(P<0.01)。

與虛熱模型組比較,虛熱附子低、高劑量組T3含量顯著降低(P<0.01),虛熱附子低、高劑量組T4含量有降低趨勢,差異無統計學意義(P>0.05);與虛寒模型組比較,虛寒附子低、高劑量T3含量顯著升高(P<0.01),虛寒附子高劑量組T4含量顯著升高(P<0.01),虛寒附子低劑量組T4含量有升高趨勢,差異無統計學意義(P>0.05)。結果見表5。

表5 附子對虛熱、虛寒機體狀態小鼠內分泌的影響

2.5 附子對虛熱、虛寒機體小鼠免疫水平的影響

與空白組比較,虛熱模型組C3、C4、IgG、IgM含量顯著升高(P<0.01),虛寒模型組C3、C4、IgG、IgM含量顯著降低(P<0.01);與虛熱模型組比較,虛熱附子低劑量組C3含量顯著降低(P<0.05),虛熱附子低、高劑量組C4、IgG、IgM有降低趨勢,差異均無統計學意義(P>0.05);與虛寒模型組比較,虛寒附子低劑量組IgG、IgM含量顯著升高(P<0.01),虛寒附子高劑量組C3、C4、IgG、IgM含量均顯著升高(P<0.01),虛寒附子低劑量組C3、C4含量有降低趨勢,差異無統計學意義(P>0.05)。結果見表6。

表6 附子對虛熱、虛寒機體狀態小鼠免疫因子的影響

2.6 附子對虛熱、虛寒機體小鼠FASN、PFKFB3、SCD1、IRS2基因mRNA表達的影響

與空白組比較,虛熱模型組FASN、PFKFB3、SCD1、IRS2的mRNA表達顯著升高(P<0.01,P<0.01,P<0.05,P<0.05),虛寒模型組FASN、PFKFB3、SCD1、IRS2的mRNA表達顯著升高(P<0.01,P<0.05,P<0.01,P<0.05);

與虛寒、虛熱模型組比較,虛寒附子高劑量組FASN、PFKFB3、SCD1、IRS2的mRNA表達均顯著降低(P<0.01,P<0.05,P<0.01,P<0.01),虛熱附子高劑量組IRS2的mRNA表達均顯著降低(P<0.01),而FASN、PFKFB3、SCD1的mRNA表達有降低趨勢,差異無統計學意義(P>0.05)。結果見表7。

表7 附子對虛熱、虛寒機體狀態小鼠Fasn、PFKFB3、SCD1、IRS2基因mRNA表達的影響

3 討論

機體狀態是中藥藥性生物學效應表達的載體,對藥物體內代謝生態環境具有重要作用,寒熱機體狀態不同亦會使同一中藥的生物效應表達也不同[1]。NEI網絡對于中藥基于不同機體狀態的生物學效應表達發揮著重要作用。研究表明,AMPK信號通路是連接NEI網絡的主要信號通路之一。因此,本文對辛熱藥附子作用于寒熱不同機體狀態后NEI網絡生物效應不同進行了探察,并通過AMPK信號通路FASN/PFKFB3/SCD1/IRS2基因靶點對其不同生物學效應表達機制進行了深入研究。

現代研究表明,機體寒熱狀態的產生與神經[2-4]、內分泌[5-6]、免疫[7-8]、環核苷酸水平[27]狀態的異常息息相關。環核苷酸系統cAMP和cGMP作為細胞間信息傳導的第二信使,與物質代謝中密切相關,在維持機體神經—內分泌—免疫網絡的平衡中起重要作用[28]。寒熱不同機體狀態中環核苷酸的表達有明顯的差異,虛熱時,cAMP,cAMP/cGMP升高,虛寒時,cAMP、cAMP/cGMP降低[29],為中醫微觀辨證之一[30]。結果顯示,地塞米松組小鼠癥狀基本符合陰虛(虛熱)表觀診斷指標;氫化可的松組小鼠癥狀基本符合陽虛(虛寒)表觀診斷指標。辛熱中藥附子干預虛寒、虛熱小鼠后,虛寒小鼠cAMP,cAMP/cGMP含量升高,體質量能夠增長至正常水平,狀態恢復;而虛熱小鼠cAMP,cAMP/cGMP仍處于高水平體質量則出現負增長,精神狀態未得到改善。因此表明,附子作用于寒熱不同機體狀態時,環核苷酸差異性表達,且對于體重與精神狀態的改變呈相反趨勢。

同時,機體狀態不同,NEI網絡相關指標亦有不同。研究表明,虛熱狀態下,交感神經興奮,NE和DA含量增加、5-HT含量減少[2];而虛寒狀態下,中樞神經系統被抑制, NE和DA含量減少,5-HT含量增加或減少,其減少原因可能與5-HT系統受到損壞有關[3-4]。而神經遞質水平的異常,則會進一步影響到內分泌與免疫系統。研究表明,虛熱狀態下,內分泌功能亢進,T3和T4含量增加[5],虛寒狀態下,T3和T4含量則會減少[6]。另外,研究發現虛熱狀態下,IgG、IgM、補體C3均升高,免疫功能呈現為相對亢進狀態,其機制可能為陰不制陽,陽氣相對亢進,正氣處于“虛”的相對亢奮狀態[7];虛寒狀態時機體免疫力低下,降低IgG、IgM、補體C3的合成[8]。本實驗中虛熱模型組小鼠神經遞質(NE、DA)、內分泌激素(T3、T4)、免疫因子(C3、C4、IgG、IgM)的含量均升高,神經遞質5-HT含量降低;表明虛熱狀態下小鼠的NEI網絡異常表現為:中樞神經系統亢奮,內分泌激素分泌增加,免疫功能亢奮[7]。虛寒模型組小鼠神經遞質(NE、DA、5-HT)、內分泌激素(T3、T4)、免疫因子(C3、C4、IgG、IgM)含量均降低;表明虛寒狀態下小鼠NEI網絡異常表現為:中樞神經系統抑制,內分泌激素分泌減少,免疫功能低下。

附子作用于寒熱不同機體狀態小鼠后,低劑量附子能使虛寒小鼠的T3、IgG、IgM水平得到恢復,高劑量附子能使糾正虛寒證小鼠神經遞質水平低下、內分泌系統和免疫功能的紊亂;而虛熱證小鼠經附子干預后,小鼠神經遞質、內分泌因子和免疫因子仍處于異常水平,表明附子在寒熱不同機體狀態下對NEI網絡系統具有不同的生物學效應。

AMPK信號通路作為連接NEI網絡的主要信號通路之一,能夠通過FASN、PFKFB3、SCD1、IRS2基因進行調節。研究表明FASN能夠影響中樞神經系統[11],以及神經網絡的結構方面[12],且在甲狀腺功能亢進(虛熱)狀態下被誘導上調[31]。PFKFB3能夠誘導巨噬細胞的糖酵解通量增加,增強M1型巨噬細胞的促炎功能,抗原呈遞MHC復合物高表達,在機體免疫應答過程中發揮重要作用[14-16]。另外,SCD1的表達不僅影響內分泌甲狀腺[18],且參與炎癥反應[32-33]。也就是說,AMPK信號通路通過調節FASN、PFKFB3、SCD1基因靶點參與調控NEI網絡的生理功能,本研究結果顯示,附子能夠顯著抑制虛寒小鼠FASN、PFKFB3、SCD1的mRNA表達,而對虛熱狀態小鼠FASN、PFKFB3、SCD1基因表達無統計學差異。表明,附子作用于寒熱不同機體狀態下通過調控AMPK信號通路上FASN、PFKFB3、SCD1基因表達進而影響NEI網絡的生物學效應的不同。

另外,AMPK信號通路上另一基因靶點IRS2是胰島素發揮作用的重要基因[34],參與了NEI網絡內分泌甲狀腺的正常生理過程[20]。除此之外,IRS2還能夠介導中樞神經系統內胰島素信號級聯效應[21],文獻表明,上調IRS2能夠導致巨噬細胞分泌引起胰島素抵抗的因子,參與神經與免疫相互作用的信號傳導過程,同時影響細胞炎癥反應,在免疫應答中發揮作用[22]。本研究結果表明,無論是虛寒狀態還是虛熱狀態下,附子均能顯著抑制IRS2的mRNA表達,這就提示IRS2可能是附子作用于寒熱不同機體狀態下發揮“效—毒”雙向生物效應的機制之一,值得后續進行深入研究。

綜上,依據“藥性構成三要素”假說,中藥藥性是藥物成分作用于特定的機體狀態,所發生的復雜的、多層次的生物學正負效應的綜合表達。本研究基于辛熱藥性的中藥附子作用于不同機體狀態機體后其神經—內分泌—免疫網絡生物效應表達的機制開展了研究,發現AMPK信號通路上FASN、PFKFB3、SCD1基因位點可能是其“辨證用藥”的關鍵靶點,而IRS2基因可能是附子產生“效—毒”雙向作用的機制,還需進一步研究。