基于UPLC-Q-TOF-MS和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)辨識白芍治療原發(fā)性痛經(jīng)的質(zhì)量標(biāo)志物

李娜 劉孜 李哲 趙藍青青 熊輝

原發(fā)性痛經(jīng)(primary dysmenorrhea,PD)是指生殖器官無器質(zhì)性病變的痛經(jīng),常見行經(jīng)前或月經(jīng)期出現(xiàn)下腹疼痛、墜脹,伴腰酸或其他不適,程度較重可致影響生活和工作[1]。白芍為毛茛科植物芍藥PaeonialactifloraPall.的干燥根,微寒,味苦、酸,具有養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、斂陰止汗、柔肝止痛、平抑肝陽等功效。白芍化學(xué)成分豐富,主要包括萜類類、黃酮類、鞣質(zhì)類等。程天緣[2]等人通過中醫(yī)傳承輔助平臺中的“方劑分析”功能,經(jīng)過篩選與總結(jié),得到治療痛經(jīng)的中成藥配方中常用中藥10味,其中白芍排在第四位。《本草正義》記載“補血,益肝脾真陰,而收攝脾氣之散亂,肝氣之恣橫,則白芍也”“故益陰養(yǎng)血,滋潤肝脾,皆用白芍”,說明白芍正是治療痛經(jīng)的首選中藥。白芍藥效的發(fā)揮與其質(zhì)量密切相關(guān),現(xiàn)行白芍質(zhì)控指標(biāo)主要定位在芍藥苷,指標(biāo)單一,且與有效性和安全性關(guān)聯(lián)性差,無法有效控制白芍質(zhì)量[3]。因此本研究擬采用UPLC-Q-TOF-MS對白芍中的化學(xué)成分進行系統(tǒng)表征,聯(lián)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法和質(zhì)量標(biāo)志物的理論,對白芍的質(zhì)量標(biāo)志物進行預(yù)測。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

SOIENTZ-18N型冷凍干燥機(寧波新芝生物科技股份有限公司);Triple TOFTM5600質(zhì)譜儀(美國AB SCIEX公司);ExionLCTM型超高效液相色譜儀(美國AB SCIEX公司);Analsyt TF 1.6軟件(美國AB SCIEX公司);CPA225D型電子天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司);白芍飲片購自河北荷花池藥業(yè)有限公司(批號:C2232012004),經(jīng)承德醫(yī)學(xué)院蘇占輝教授鑒定為毛茛科植物芍藥PaeonialactifloraPall.的干燥根;屈臣氏飲用水(廣州屈臣氏食品飲料有限公司);甲酸(賽默飛世爾科技(中國)有限公司);乙腈(美國Fisher公司);甲醇(德國Merck公司)。

1.2 供試品的制備

取白芍飲片粉末0.1 g,精密稱定,置于具塞錐形瓶中,精密加入50%甲醇5 mL,稱定重量,超聲處理(800 W,40 kHZ)30分鐘,放冷,再稱定重量,用50%甲醇補足重量,13000 r/min 4℃離心10分鐘,取上清液過0.22 μm有機濾膜,即為供試品溶液。

1.3 色譜條件

色譜柱為Waters ACQUITY UPLC?HSS T3 (2.1×100 mm, 1.8 μm );流動相A為0.1%甲酸水,流動相B為0.1%甲酸乙腈,梯度洗脫見表1;進樣量3 μL;柱溫:30 ℃。

表1 色譜條件

1.4 質(zhì)譜條件

離子源為ESI源,采用正負離子化模式檢測:正負離子模式噴霧電壓為5.5 kV/-4.5 kV,裂解電壓為100 V/-100 V,碰撞能35 eV/-35 eV,霧化氣55 psi,輔助氣55 psi,氣簾氣35 psi。數(shù)據(jù)采用一級和二級結(jié)合的掃描模式(MS/MS2),質(zhì)量范圍均為m/z50～1200,裂解電壓100 V/-100 V,離子源溫度為550 ℃,儀器每隔2小時校正一次質(zhì)量軸。

1.5 化學(xué)成分鑒定

使用MarkerView軟件將質(zhì)譜原始導(dǎo)入。進行保留時間矯正、峰識別、峰提取、峰積分、峰對齊等工作,同時創(chuàng)建復(fù)方中相應(yīng)中藥代謝庫,利用標(biāo)準(zhǔn)品二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(HMDB、Massbank等)、參考文獻及相應(yīng)裂解規(guī)律匹配法對含有MSMS數(shù)據(jù)的峰進行物質(zhì)鑒定。

1.6 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

1.6.1 白芍成分作用靶點預(yù)測 將鑒定得到的化合物根據(jù)OB≥20%或者DL≥0.1篩選出活性成分。在TCMSP中搜索成分,得到對應(yīng)的相關(guān)靶點。未在TCMSP數(shù)據(jù)庫記錄靶點的化合物,通過PubChem搜索得到SMILE號,使用SMILE號在Swiss Target Prediction預(yù)測相關(guān)靶點。

1.6.2 疾病靶點篩選 在Therapeuic Tarrget Database數(shù)據(jù)庫與Comparative Toxicogenomics Database數(shù)據(jù)庫中搜索“primary dysmenorrhea”,將得到的疾病靶點取并集,作為疾病靶點。

1.6.3 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將交集靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫中,進行蛋白—蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析,并導(dǎo)出數(shù)據(jù)。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1軟件,獲得PPI網(wǎng)絡(luò)圖,計算節(jié)點連接數(shù)degree,篩選出大于雙倍平均值作為核心靶點。

1.6.4 GO和KEGG通路富集 將核心靶點導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫,進行白芍治療原發(fā)性痛經(jīng)的基因本體論(gene ontology,GO)與KEGG通路富集分析。篩選條件為FDR≤0.01和P-Value≤0.05。將數(shù)據(jù)按照counts降序排序,分子功能(molecular function,MF)、生物過程(biological process,BP)、細胞組分(cell components,CC)分別取前10,KEGG通路取前20,作為分析對象,并進行可視化繪圖。

1.6.5 候選質(zhì)量標(biāo)志物與核心靶點分子對接分析 利用Cytoscape在“成分—靶點—疾病網(wǎng)絡(luò)圖”中選擇Degree值高的活性成分作為候選質(zhì)量標(biāo)志物,與核心靶點進行分析對接。從PubChem數(shù)據(jù)庫中下載候選質(zhì)量標(biāo)志物小分子SDF格式文件,使用Chem3D軟件將SDF文件轉(zhuǎn)化為mol文件。從PDB數(shù)據(jù)庫獲得核心靶點的蛋白結(jié)構(gòu)。運用AutoDockTools1.5.6軟件對蛋白結(jié)構(gòu)進行優(yōu)化,找到蛋白活性口袋。使用AutoDock Vina和Python腳本進行分子對接,得到結(jié)果數(shù)據(jù)。在Protein-Ligand Interaction Profiler網(wǎng)站進行驗證。然后使用PyMOL對小分子和蛋白結(jié)合模式進行可視化,并分析關(guān)鍵結(jié)合位點。

2 結(jié)果

2.1 基于UPLC-QTOF-MS/MS的白芍化學(xué)成分識別

共鑒定得到64種化合物(表2和表3),在PeakView軟件中導(dǎo)出基峰色譜圖(如圖1,圖2),將64個化合物標(biāo)在相應(yīng)位置上。這些化合物主要包括有機酸類、單萜苷類、黃酮類化合物等。有機酸類化合物有檸檬酸、丹皮酚等。單萜類化合物主要有芍藥內(nèi)酯苷、牡丹皮苷F、羥基芍藥苷、芍藥苷亞硫酸酯等。黃酮類有柚皮素、兒茶素、表兒茶素,鞣質(zhì)有沒食子酸、沒食子酸乙酯等。以芍藥內(nèi)酯苷為例進行成分表征闡述,如圖2,二級質(zhì)譜有m/z77.0387、m/z121.0284、m/z283.0817、m/z479.1542四個峰。根據(jù)參考文獻推斷,m/z479.1542為[M-H]-準(zhǔn)分子離子峰,特征離子峰m/z283為[M-H-CO2-C7H5O2]-,其中CO2為內(nèi)酯環(huán)斷裂失去酯基,m/z121.0287是分子源內(nèi)裂解形成的苯甲酸負離子。

圖1 在正負離子模式下采集白芍飲片的基峰色譜圖

圖2 在負離子模式下推斷的芍藥內(nèi)酯苷二級裂解機制

表2 負離子模式下鑒定白芍飲片的化學(xué)成分信息

表3 正離子模式下鑒定的白芍化學(xué)成分信息

2.2 活性成分靶點與疾病靶點預(yù)測

篩選得到活性成分36個,在TCMSP與Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫檢索到對應(yīng)的靶點697個。Therapeuic Tarrget Database與Comparative Toxicogenomics Database數(shù)據(jù)庫搜索到疾病靶點1693個。共有靶點去除重復(fù)后結(jié)果表明,36個有效成分與原發(fā)性痛經(jīng)有共同靶基因76 個。將白芍活性成分、原發(fā)性痛經(jīng)及其共同靶點導(dǎo)入Cytoscape進行可視化得到成分—靶點—疾病網(wǎng)絡(luò)圖(圖3)。結(jié)果表明,同一個化合物分子可以對應(yīng)多個靶標(biāo),一個靶標(biāo)基因亦對應(yīng)多個化合物,體現(xiàn)了白芍多成分、多靶點和多通路的作用機制。

2.3 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用String數(shù)據(jù)庫獲得各個核心靶點的Degree值,并進行排序,篩選得到核心靶點10個(圖4),包括腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)、白細胞介素6(interleukin 6,IL-6)、雌激素受體1(estrogen receptor1,ESR1)、前列腺素內(nèi)過氧化物酶合酶2(prostaglandin-endoperoxidase synthase 2,PTGS2)、Bcl-2樣蛋白1(Bcl-2-like protein 1,BCL2L1)、熱休克蛋白90α(heat shock protein HSP 90-alpha,HSP90AA1)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP9)、信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPARG)、血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)使用Cytoscape將蛋白互作網(wǎng)絡(luò)進行可視化(圖5)。

圖4 基于String數(shù)據(jù)庫獲得的核心靶點Degree排序條狀圖

圖5 基于Cytoscape軟件繪制76個核心蛋白靶點互作網(wǎng)絡(luò)和Degree熱圖

2.4 GO分類富集分析

將蛋白靶點互作網(wǎng)絡(luò)中的76靶點蛋白靶點導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫,導(dǎo)出通路分析結(jié)果,篩選FDR≤0.01,且PValue≤0.05的通路,得到BP 55條,CC 16條,MF 19條。根據(jù)Counts值分別取前10條進行GO分析(圖6)。

圖6 基于76個核心靶點富集的排名前10的GO富集分析氣泡圖

2.5 KEGG通路分析

在DAVID數(shù)據(jù)庫導(dǎo)出結(jié)果中,按照counts進行排序,篩選FDR≤0.01,且PValue≤0.05的通路,選取前20條進行分析,結(jié)果如圖7。包括15條通路與人類疾病相關(guān),有癌癥通路、心血管疾病、神經(jīng)變性疾病、病毒性傳染病、細菌性傳染病、內(nèi)分泌和代謝性疾病相同通路;4條為環(huán)境信息處理類,參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo),包括磷脂酰肌醇三羥基激酶—蘇氨酸激酶(phosphoInositide-3 kinase-protein kinase B,PI3K/Akt)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)、低氧誘導(dǎo)因子1(hypoxia induced factor 1,HIF-1)的信號通路;1條為免疫系統(tǒng)相關(guān),是白細胞介素17(interleukin 17,IL-17)信號通路。

圖7 基于76個核心靶點富集的排名前20的KEGG通路氣泡圖

2.6 分子對接

選擇6個核心靶點蛋白BCL2L1、HSP90AA1、MMP9、STAT3、PPARG、VEGFA與對應(yīng)的4個活性成分(柚皮素、牡丹皮苷I、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥內(nèi)酯C)進行分子對接。一般認為結(jié)合能<-5 kcal/mol的對接結(jié)果較為理想,對接結(jié)果均滿足要求,結(jié)合位點視圖如圖7。小分子多用非共價鍵相互作用與蛋白連接,包括氫鍵、離子鍵與π-π堆積作用。如牡丹皮苷I與HSP90AA1的分子對接(圖8 K),有平行π-π堆積作用(PHE-138)、垂直的π-π堆積作用(TRP-162)以及5個氫鍵連接位點(ASN-51、ASN-51、ASP-54、LYS-58、GLY-135)和疏水相互作用(VAL-150)。芍藥內(nèi)酯苷通過離子鍵(ARG-143)與MMP9的連接(圖8B)。

注:A 柚皮素-BCL2L1;B 牡丹皮苷I-HSP90AA1;C 芍藥內(nèi)酯苷-HSP90AA1;D 牡丹皮苷I-MMP9;E 芍藥內(nèi)酯苷-MMP9;F 芍藥內(nèi)酯C-MMP9;G 芍藥內(nèi)酯C-STAT3;H 柚皮素-PPARG;I 柚皮素-VEGFA;J 牡丹皮苷I-VEGFA;K 芍藥內(nèi)酯苷-VEGFA圖8 活性成分與核心靶點分子對接結(jié)合能<-5 kcal/mol的各個對接可視化圖

3 討論

本實驗聯(lián)合UPLC-Q-TOF-MS與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)對白芍治療原發(fā)性痛經(jīng)的質(zhì)量標(biāo)志物進行探究。首先利用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)共鑒定出62種化學(xué)成分,篩選出活性成分36個。在“白芍—成分—靶點—疾病”網(wǎng)路圖中,篩選出高degree值作為關(guān)鍵成分,包括芍藥內(nèi)酯苷、牡丹皮苷I、柚皮素和芍藥內(nèi)酯C。Liu等[4]發(fā)現(xiàn)芍藥內(nèi)酯苷對神經(jīng)病理性疼痛大鼠具有鎮(zhèn)痛作用,其機制可能與調(diào)控中樞核苷酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域,富含亮氨酸重復(fù)序列和含1個Pyrin結(jié)構(gòu)域(nucleotide- binding oligomerization domain, leucine- rich repeat and pyrin domain- containing 1,NLRP1)和核苷酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域,富含亮氨酸重復(fù)序列和含Pyrin結(jié)構(gòu)域3(nucleotide- binding oligomerization domain, leucine- rich repeat and pyrin domain- containing 1,NLRP1)炎癥小體活性以及抑制脊髓膠質(zhì)細胞激活降低白細胞介素1β(interleukin 1β,IL-1β)水平有關(guān)。柚皮素來源豐富,藥理作用廣泛。Arora等[5]研究柚皮素對慢性睡眠剝奪誘導(dǎo)的小鼠機械和熱痛覺過敏的影響,發(fā)現(xiàn)柚皮素對抗痛覺過敏反應(yīng)的同時降低氧化應(yīng)激和炎癥因子的表達水平。Kim等[6]發(fā)現(xiàn)芍藥甘草湯中治療神經(jīng)性疼痛的有效成分包括芍藥內(nèi)酯C、丹皮酚和苯甲酸等,其發(fā)揮作用的機制與調(diào)節(jié)亞油酸代謝、α-亞麻酸代謝和花生四烯酸代謝等途徑有關(guān)。牡丹皮苷I目前尚無藥理學(xué)研究和報道,但從本實驗可以看出與核心靶點親合力強。從以上文獻調(diào)研可以看出芍藥內(nèi)酯苷、牡丹皮苷I、柚皮素和芍藥內(nèi)酯C對原發(fā)性痛經(jīng)具有潛在的止痛效應(yīng)。

通過蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析獲得6個核心靶點,包括BCL2L1、HSP90AA1、MMP9、PPARG、STAT3、VEGFA。將這些核心靶點進行KEGG通路富集分析,涉及PI3K-Akt、MAPK、TNF、HIF-1、IL-17等信號通路。IL-17和TNF信號通路被認為是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵通路,在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎動物模型中發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)內(nèi)注射IL-17可增加TNF-α、IL-1β的表達,誘導(dǎo)痛覺反應(yīng)發(fā)生[7]。MMP9參與IL-17與TNF信號通路的調(diào)節(jié),推測白芍可能通過調(diào)節(jié)體炎癥因子的表達,抑制炎癥反應(yīng),從而起到緩解痛經(jīng)的作用。PI3K/Akt信號通路是調(diào)節(jié)細胞增殖和凋亡的重要通路,該通路中的PI3K、Akt以磷酸化的形式發(fā)生激活后能夠?qū)Φ蛲稣{(diào)節(jié)因子BAX(apoptosis regulator BAX,Bax)、Bcl-2相關(guān)細胞死亡激動劑(Bcl-2 associated agonist of cell death,Bad)等促凋亡基因的表達產(chǎn)生抑制作用而促進Bcl-2等相關(guān)抗凋亡基因的表達。而當(dāng)缺血缺氧、缺血再灌注等病理因素作用于細胞時,PI3K/Akt通路受到抑制并使其抗凋亡作用減弱。Pi等[8]研究發(fā)現(xiàn)在小鼠心臟手術(shù)期間,異氟醚通過PI3K/Akt信號通路減輕疼痛并抑制小鼠心肌細胞凋亡,提示激活PI3K/Akt信號通路,可能緩解疼痛。也有研究顯示單神經(jīng)病理性疼痛的早期發(fā)展階段MAPK信號通路發(fā)揮重要作用,一旦被激活會介導(dǎo)TNF-α引發(fā)痛覺效應(yīng)[9]。有報道激活HIF-1信號通路可減少神經(jīng)病理性疼痛中的機械性痛覺反應(yīng)行為,其通路上的關(guān)鍵靶點VEGFA,可特異性地作用于內(nèi)皮細胞,誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞生長,促進細胞遷移和抑制細胞凋亡[10]。實驗研究發(fā)現(xiàn)原發(fā)性痛經(jīng)患者子宮內(nèi)膜VEGFA的表達顯著高于正常女性子宮內(nèi)膜的表達[11],說明我們篩選出的靶點的可信度較高。STAT3是一種轉(zhuǎn)錄激活因子,STAT3能與HIF-1α結(jié)合促進炎癥因子的釋放,研究發(fā)現(xiàn)STAT3的激活有效減輕大鼠神經(jīng)病理性疼痛和炎癥反應(yīng)[12]。HSP90AA1屬于HSP家族的HSP90亞家族,是最重要的熱休克蛋白之一,在免疫和炎癥中發(fā)揮重要作用。PPARG是一種配體依賴的核轉(zhuǎn)錄因子,可通過調(diào)節(jié)IL-17和TNF信號通路參與免疫炎癥反應(yīng)調(diào)控機體的生理和病理過程[13]。將6個核心靶點與其對應(yīng)的4個活性成分進行分子對接。我們發(fā)現(xiàn)對接結(jié)果均符合結(jié)合能<-5 kal/mol,可認為親和力較強。

質(zhì)量標(biāo)志物需要滿足復(fù)方配伍、質(zhì)量傳遞與溯源、特有性、有效性、可測性的五原則。芍藥內(nèi)酯苷是芍藥屬植物主要的單萜類,就目前所知僅分布于芍藥屬植物,因此是芍藥屬特征性化學(xué)成分。芍藥內(nèi)酯C是來自芍藥的薄荷烷類似物,也屬于白芍特有成分,滿足特有性原則。曾潔等[14]利用高效液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用方法建立測定大鼠血漿中芍藥內(nèi)酯苷含量的分析方法,發(fā)現(xiàn)芍藥內(nèi)酯苷在大鼠體內(nèi)能夠被迅速吸收。另有中藥復(fù)方的藥動學(xué)研究發(fā)現(xiàn),白芍與當(dāng)歸配伍可以顯著增加芍藥內(nèi)酯苷的達峰時間以及末端消除半衰期,延長其在體內(nèi)的滯留時間[15],證明芍藥內(nèi)酯苷能有效傳遞至血液中,滿足傳遞性原則。而牡丹皮苷I和柚皮素來源豐富,特有性較差,不適合作為質(zhì)量標(biāo)志物。結(jié)合芍藥內(nèi)酯苷、芍藥內(nèi)酯C的化學(xué)結(jié)構(gòu)分析可知有紫外吸收,推測其可用于定性定量分析。綜上所述,我們認為芍藥內(nèi)酯苷、芍藥內(nèi)酯C可作為白芍的質(zhì)量標(biāo)志物。

本項目以辨識白芍治療原發(fā)性痛經(jīng)的定向藥效質(zhì)量標(biāo)志物為主要研究目標(biāo),綜合采用UPLC-Q-TOF-MS和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)探究白芍化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)及其作用機制,鎖定白芍治療原發(fā)性痛經(jīng)定向功效的質(zhì)量標(biāo)志物,包括芍藥內(nèi)酯C、芍藥內(nèi)酯苷,為基于定向功效的白芍質(zhì)量有效性評價提供科學(xué)依據(jù)。