UPLC-Q-Orbitrap-MS結合網絡藥理學探討當歸四逆湯治療關節炎及痛經“異病同治”機制分析

儲煙闐 匡艷輝 嚴曾豪 王德勤 郭海彪 張偲偲 劉曉秋

當歸四逆湯來源于《傷寒論》[1],具有溫經散寒、養血通脈的作用,主治血虛寒厥證,臨床上常用于治療類風濕性關節炎、原發性痛經等疾病見上述證候者,具有“異病同治”的療效特色。其中,類風濕性關節炎是一種慢性免疫性疾病,其具體表現為關節炎癥及疼痛,其作用機制復雜,病因不明。原發性痛經是指月經前后及行經期間出現下腹疼痛、墜脹等。兩者嚴重影響患者生活質量。

中藥復方因其處方中藥味多化學成分復雜,在經典名方開發全面質量控制過程中,明確處方中化學成分組成尤為重要。超高效液相色譜串聯四級桿—靜電場軌道阱高分辨質譜技術(UPLC-Q-Orbitrap-MS)技術具有高分辨率、高靈敏度、高選擇性等特點,在化學成分解析、藥物代謝研究中應用廣泛,對于定性分析復雜基質特別是中藥復方中的多種組分來說是一個強有力的分析工具。網絡藥理學利用網絡可視化展現成分—靶點—疾病之間的相互作用關系,廣泛應用于中藥復方預測機體生物網絡的作用機制,但單一網絡藥理學研究存在針對性不強、預測精度低的短板。本研究擬利用現代中藥分析UPLC-Q-Orbitrap-MS技術結合網絡藥理學分析其在類風濕性關節炎及原發性痛經中的作用機制,以提高網絡藥理學預測精度,探討中醫“異病同治”的科學內涵。

1 材料與方法

1.1 藥物

當歸四逆湯流膏(批號:210405S),由廣州白云山和記黃埔中藥有限公司現代中藥研究院自制,為棕褐色流膏,處方配比:當歸(9 g)、桂枝(9 g)、白芍(9 g)、細辛(9 g)、木通(6 g)、甘草(6 g)、大棗(24 g),按照《傷寒論》原文記載煎煮,濃縮至流膏狀作為供試品。

1.2 試劑

乙腈、乙酸均為色譜純(德國默克公司);超純水由實驗室純水儀自制。

1.3 儀器

賽默飛三合一高分辨質譜儀(Thermo Fisher Scientific Orbitrap Fusion Lumos,美國Thermo Fisher公司);Ultimate 3000超高效液相色譜系統(美國Thermo Fisher Scientific公司)、電噴霧離子源(ESI),CP225D十萬分之一電子分析天平(賽多利斯科學儀器有限公司);BSA224S-CW萬分之一電子分析天平(賽多利斯科學儀器有限公司);LDZ4-0.8離心機(北京醫用離心機廠);Genie U12超純水儀(上海樂楓生物科技有限公司)。

1.4 供試品制備

稱取批號為210405S的當歸四逆湯流膏0.5 g,精密稱定,移取25 mL超純水溶解,超聲30分鐘,12000 r/min離心15分鐘,取上清液作為供試品。

1.5 色譜條件

ACQUITY UPLC?BEH C181.7 μm (2.1×100 mm)色譜柱,流動相乙腈(A)-0.1%乙酸水(B),梯度洗脫:0～2.36分鐘;3%A,2.36～3.75分鐘;3%～5 %A,3.75～4.00分鐘;5%～8%A,4.00～6.50分鐘; 8%～10%A,6.50～10.67分鐘;10%～14%A,10.67～13.73分鐘;14%～17%A,13.73～15.00分鐘;17%～18%A,15.00～17.20分鐘;18%～21.5%A,17.20～18.20分鐘; 21.5%～25%A,18.20～20.50分鐘;25%～30%A,20.50～22.00分鐘;30%～40%A,22.00～24.00分鐘;40%～45%A,24.00～26.00分鐘;45%～55%A,26.00～28.00分鐘;55%～80%A,28.00～30.00分鐘; 80%～90%A,30.00～40.00分鐘;90%～100%A,體積流量0.6 mL/min,柱溫:25 ℃,進樣量2 μL。

1.6 質譜條件

電噴霧離子源(ESI);離子噴霧空載電壓+3 KV/-2.8 KV;正、負離子檢測模式;一、二級質譜條件為掃描范圍m/z100～1000;毛細管溫度300℃;源加熱溫度350℃;鞘氣壓力:45 arb;輔助氣壓力:8 arb。

1.7 液質聯用數據處理

1.7.1 質譜數據處理 將采集的正負總離子流圖導入Xcalibar 2.0 軟件進行可視化操作,根據一級質譜提供的精確相對分子質量,計算可能的分子式(根據誤差范圍±5.0×10-6剔除無關推測),與搜集的自建化合物成分數據庫中已有的分子式進行比對預測可能的化合物,再將未知化合物的二級碎片離子與文獻報道的對照品,有機小分子生物活性數據庫(Pubchem)、質譜數據庫(MassBank)、中藥成分高分辨質譜數據庫(OTCML),文獻報道提供的裂解碎片進行比對,尋找特征峰及特征裂解碎片,進一步確定未知化合物的分子式及結構。并根據二級碎片離子推導化合物的質譜裂解路徑。

1.7.2 同分異構體化合物處理 同分異構體的區分鑒別,可通過與對應對照品比對或裂解路徑的不同進行區分;對于裂解規律一致的同分異構體,主要采用 ChemDraw 19.0 軟件給出的有機化合物疏水常數(ClogP)對極性進行判斷,在同一洗脫條件下極性小的化合物出峰時間要晚于同分異構體中極性稍大的未知化合物,同時結合已報道文獻中化合物的保留時間先后順序(tR)進行推測。

1.8 網絡藥理學分析

1.8.1 當歸四逆湯活性成分及靶點收集 以液質聯用確定的化學成分,采用TCMSP數據庫篩選(口服生物利用度OB≥30%),進行成分查詢及靶點收集。對于TCMSP未收錄的其余成分,借助PubChem數據庫(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov) 查詢成分相應SMILES號,進一步采用SwissTargetPrediction數據庫 (http://www.swisstarget prediction.ch/)檢索對應SMILES號進行靶點預測補充。

1.8.2 類風濕性關節炎及痛經疾病靶點收集 在Drugbank (https://go.drugbank.com/)、OMIM (https://www.omim.org/)和Genegards (https://www.genecards.org/)數據庫中,以“類風濕性關節炎”、“原發性痛經”為檢索詞檢索相關靶點,去除重復和假陽性靶點,構建疾病靶點數據集。分別構建“成分—靶點”和“疾病—靶點”網絡模型,運用Cytoscape 3.7.2軟件將2個網絡合并,去除無關聯節點,得到當歸四逆湯抗炎、鎮痛的活性成分及主要靶點,借助Uniprot (https://www.uniprot.org) 規范對應靶點的基因名。

1.8.3 蛋白—蛋白相互作用 (protein-protein interaction,PPI) 網絡的構建 將“1.8.2”項下獲得的主要靶點輸入STRING在線數據庫 (https://string-db.org/) ,設置“人種(Homo sapiens)”,互作評分大于0.9,獲得PPI關系,將節點及結合作用評分數據導入Cytoscape 3.7.2軟件進行網絡構建與分析,運用Cytoscape軟件中的工具網絡分析(Network Analyzer)來分析中介中心度 (betweenness centrality) 和節點度 (degree) 、接近中心性 (Closeness centrality) ,這3個重要的網絡拓撲參數以大于中位數值篩選出核心靶點。

1.8.4 基因本體論 (gene ontology,GO) 功能與京都基因及基因組百科全書 (kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG) 通路富集分析 運用在線工具Metascape (https://metascape.org/) 對交集基因進行KEGG通路和GO分析,其中包括生物過程 (biological processes,BP) 、細胞組成 (cellular component,CC)和分子功能 (molecular function,MF)的富集分析,多重檢驗校正 (Bonferroni法)校正后P<0.01的項目被認為是顯著富集。

2 結果

2.1 當歸四逆湯化學成分分析

使用上述色譜、質譜條件,采用 UPLC-Q-Orbitrap-MS 對供試品溶液進行分析,得正、負離子模式下的總離子流圖。見圖1。通過分析準分子離子峰、碎片離子信息,結合對照品和文獻報道,鑒別的化合物見表1。

表1 當歸四逆湯UPLC-Q-Orbitrap 分析

續表

注:A 正離子模式,B 負離子模式圖1 當歸四逆湯供試品總離子流圖

2.1.1 黃酮類 在當歸四逆湯中共鑒別出42個黃酮類化合物,其中二氫黃酮類11個、異黃酮類14個、查爾酮類3個、黃酮醇類3個、黃烷類4個、雙黃酮類1個、其它黃酮類4個。大多數游離黃酮以分子離子峰[M]+為基峰,重要特征峰包括[M-H]-、[M-CO]-的碎片離子峰。黃酮類化合物的裂解方式主要有兩種,如圖2所示。

裂解方式Ⅰ:

裂解方式Ⅱ:

圖2 黃酮類化合物裂解途徑

二氫黃酮類:化合物50、52、74-77、80、89、90、94、134均屬于二氫黃酮類,以化合物75為例,75號峰在正離子模式下可以觀察到m/z441.1158[M+Na]+,m/z419.1339[M+H]+,m/z257.0810[M+H-Apiose-Glucose]+,負離子模式下觀察到準分子離子峰為m/z417.1196[M-H]-。根據元素組成及以上碎片離子信息,推測該化合物為甘草苷,其可能的質譜裂解途徑見圖3。正離子模式下可觀察到準分子離子峰m/z551.1760[M+H]+,m/z419.1338為失去一分子芹菜糖,m/z257.0809為[M+H-Apiose-Glucose]+,說明為雙糖連結構,根據文獻報道確定90號峰為芹糖甘草苷[19],如圖3所示。

圖3 甘草苷可能的裂解途徑

異黃酮類:化合物91、95、108、109、125、129、130、132、133、135、139、141、147、150均屬于異黃酮類,以化合物125、129、139為例,結合正負離子模式及元素分析后確定129號峰分子式為C21H20O5,質譜碎片中中有丟失的m/z56的碎片峰m/z297,說明存在異戊烯基結構,結合文獻報道確定129號為甘草寧M,139號峰是129號峰的同分異構體,結合文獻中相對保留時間,確定129號峰為甘草寧G,125號峰的裂解碎片與129號峰類似,但其極性大于129號峰且結構中要多一個羥基,結合文獻確定其為甘草寧N[10]。

查爾酮類:化合物63、96、97均屬于查爾酮類,96號化合物的分子式推算為C15H12O4,其相對分子質量與碎片信息均與75號峰甘草苷一致,但其極性低于75號,判斷96號峰為異甘草苷,97號峰與96號峰相比碎片信息類似,但其極性低于96號,借鑒二氫黃酮的裂解過程,推測其可能為新異甘草苷。

黃酮醇類:化合物51、98、138均屬于黃酮醇類,51號峰在負離子模式下,可以觀察到m/z609.1456[M-H]-的準離子峰,根據對照品的保留時間可以確定化合物51為蘆丁,98號峰根據m/z393.1892[M+Na]+及m/z371.2257 [M+H]+推測其分子式可能為C20H18O7,結合文獻[10]判定其為黃酮醇類似物,結構鑒定為烏拉爾醇。138號峰的分子式預測為C20H18O6,質譜碎片中可觀察到m/z68及發生RDA裂解的m/z221。結合文獻[20]確定為甘草黃酮醇。

其它黃酮類:經分子式預測、文獻參照、數據庫比對推測黃烷醇類:40號峰(兒茶素)、54號峰(表兒茶素);雙黃酮類:61號峰(新西蘭牡荊苷Ⅱ);黃烷類:146號峰(kanzonol H)、152號峰(kanzonol R)、154號峰(kanzonol H異構體)、135號峰(kanzonol J);其它類黃酮:69號峰(夏佛塔苷/異夏佛塔苷)、71號峰(柚皮素-7-O-葡萄糖苷)、87號峰(木犀草素-7-葡萄糖苷)、93號峰(7-甲氧基甘草苷)。

2.1.2 萜類及其皂苷類 單萜及其皂苷類化合物:主要來源于白芍,大多數以芍藥苷為基本母核結構,質譜碎片以m/z165為芍藥苷衍生物的特征碎片,組方中以芍藥苷為母核的單萜類化合物及其結構如圖4所示,以56號化合物為例,負離子模式下看觀察到準分子離子峰為m/z479.1562[M-H]-,失去一分子的甲醛得到m/z449.1091,失去一分子苯甲酸得到m/z327.1086,m/z165.0556為派烷骨架結構的碎片離子。結合參考文獻及對照品比對[2],確定其為芍藥苷,可能的裂解途徑如圖5所示。

圖4 以芍藥苷為母核的單萜類化合物

圖5 芍藥苷裂解途徑

2.1.3 三萜及其皂苷類化合物 主要來源于甘草,大多數為甘草酸的衍生物,以127號化合物為例,正離子模式下可見m/z823.4109[M+H]+,分子式確定為C42H62O16、m/z647.3791[M+H-Glucuronide acid]+、m/z471.3469[M+H-Glucuronide acid×2]+,化合物結構中推測連接兩個葡萄糖醛酸,該結構苷元的相對分子質量為470,結合標準品的保留時間及碎片信息[21],確定127號化合物為甘草酸。其可能的裂解過程如圖6所示。

圖6 甘草酸裂解途徑

2.1.4 苯丙素類化合物 化合物85正離子模式下,準分子離子峰為m/z479.1548[M+H]+,分子式預測為C23H26O11,此外,結合碎片離子峰m/z325.0919及m/z163.0389與對照品碎片比對確定化合物85為木通苯乙醇苷B,其可能的裂解途徑如圖7。

圖7 木通苯乙醇苷B裂解途徑

2.1.5 苯酞類 當歸四逆湯流膏中鑒別出兩個苯酞類化合物,主要來源于藥材當歸。苯酞類成分是指以苯酞結構為母核的一類化合物,這類化合物在質譜裂解過程中易丟失中性分子如1分子或多分子H2O、CO;同時其側鏈烯烴結構也常斷裂丟失,如-C2H4、-C3H6、-C4H8等。以化合物 155 為例,m/z193. 1222為[M+H]+峰,m/z175.1229 為[M+H-H2O]+峰,m/z165.0909為[M+H-C2H4]+峰,m/z147.0917 為[M+H-CO- H2O]+峰,與對照品及相關文獻報道相符[22],推測為洋川芎內酯 A。可能的裂解途徑如圖8所示。149號峰在正離子模式下形成m/z191.1065[M+H]+的準分子離子峰,在二級質譜中它分別失去 1 分子水和 2 分子水形成m/z173.0959[M+H-H2O]+和m/z155[M+H-2H2O]+的碎片離子;準分子離子m/z191.1065分別失去 1 分子 CO 和烷基鏈生成碎片離子m/z163.1116[M+H-CO]+和 m/z 149.0586,通過與對照品保留時間比較149號化合物確定為 Z-藁本內酯[13]。

圖8 洋川芎內酯A裂解途徑

2.1.6 糖苷類 當歸四逆湯流膏中鑒別出11個糖苷類化合物,主要來源于白芍及大棗。大多具有沒食子酸、葡萄糖等結構。化合物86,負離子模式下發現m/z939.1096[M-H]-準分子離子峰,此外碎片離子m/z787.0995[M-H-C7H5O4]-,碎片離子m/z635.1036[M-H-2C7H5O4]-及m/z169.977 1根據元素組成及碎片離子信息,推測該化合物為五沒食子酰葡萄糖。其可能的裂解途徑如圖9所示。

圖9 沒食子葡萄糖裂解途徑

2.1.7 酚及酚酸類 結合參考文獻及碎片信息在當歸四逆湯中共鑒別出18個酚及酚酸類化合物,分別為化合物14、15、22、26、34、35、38、47、62、70、72、103、68、145、153、159-160分別確認為沒食子酸、鄰苯三酚、原兒茶酸、沒食子酸甲酯、香草酸、鄰甲氧基苯甲酸、卡枯醇、丁香酸、羥基肉桂酸、愈創木酚、阿魏酸、苯甲酸、鄰苯二甲酸酐、丹皮酚、肉桂酸、α-甲基肉桂酸、4-甲氧基肉桂酸。化合物14,失去一分子-CO2,得到碎片離子m/z125.0242[M-H-CO2]+,化合物26,脫去甲酯得到m/z124.0264[M-H-C2H3O2]-。

2.1.8 有機酸類 結合參考文獻及碎片信息在當歸四逆湯中共鑒別出10個有機酸類化合物,分別為化合物4、6、11、12、28、30、55、117、123、143分別確認為蘋果酸、檸檬酸、煙酸、丁二酸、咖啡酸、monatin、香草酸、苯乙酸、紫羅醇、吐昔酸、十八碳-9-烯酸等。

2.1.9 其它類 除上述7類化合物外,當歸四逆湯中還鑒別出生物堿類、氨基酸、核苷、不飽和脂肪酸等多類成分。

2.2 “成分—疾病—靶點”網絡的構建與分析

如圖10所示,“成分—疾病—靶點”網絡共151個節點、680條邊、平均度值為9.01、其中節點的顏色越深、面積越大代表其度值越高。箭頭形節點為成分,度值平均值為10.64排名前五的為表1化合物5、87、27、74、98,度值大于10的成分占比為36.37%。菱形節點為成分與疾病的共同靶點共95個,平均度值為7.16,度值均大于2,其中排名前五的靶點為碳酸酐酶II(carbonic anhydrase II,CA2)、碳酸酐酶Ⅲ(carbonic anhydrase Ⅲ,CA3)、雌激素受體2(estrogen receptor 2,ESR2)、周期蛋白依賴激酶2(cyclin-dependent kinase 2 ,CDK2)、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR),度值大于5的占比為50.53%。

圖10 當歸四逆湯治療類風濕性關節炎及原發性痛經“成分—疾病—靶點”網絡

2.3 PPI網絡的構建與分析

如圖11所示,PPI網絡共有78個節點、342條邊,平均度值為8.77。對未參與PPI的靶點進行刪除,共保留78個靶點,度值大于3的靶點占總靶點的74.36%,度值大于20的依次為酪氨酸激酶(sarcoma gene,SRC)、信號轉導子和轉錄激活子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)、絲裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase 1,MAPK1)、磷酸肌醇3激酶的p110α催化亞基(phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase,PIK3CA)、白介素-6(interleukin 6,IL-6)等。將PPI網絡數據導入Cytoscape 3.7.2,利用靶點中介中心度、節點度、接近中心性三者的中位數為篩選條件,篩選同時大于三者中位數的靶點即為核心靶點如圖12所示,提示這些靶點在當歸四逆湯治療類風濕性關節炎及原發性痛經中具有重要作用。

圖11 當歸四逆湯治療類風濕性關節炎及原發性痛經靶點的PPI網絡

圖12 當歸四逆湯治療類風濕性關節炎及原發性痛經核心靶點的PPI網絡

2.4 GO功能與KEGG通路富集分析

借助Metascope數據庫對PPI篩選得到的交集靶點進行GO功能與KEGG通路富集分析。根據P<0.05進行篩選,其中990個涉及生物過程、73個涉及細胞組分、100個涉及分子功能。以基因數進行降序排列,各選取前10個條目。生物過程結果顯示發揮治療類風濕性關節炎及原發性痛經的靶點主要作用于炎癥反應、對外部刺激的正調控、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶信號通路等有關,細胞結果顯示靶點作用的部位可能為膜筏、受體復合物、膜側、囊泡腔,分子功能結果顯示主要與各種酶結合如蛋白絡氨酸激酶、咖啡因氧化酶、磷酸轉移酶等從而發揮其治療作用。如圖13所示。

通過KEGG富集分析,共得到153條通路,選取P值較小的前20條通路進行數據可視化,如圖14所示,當歸四逆湯發揮治療治療類風濕性關節炎及原發性痛經的機制主要與PI3K-Akt信號通路、EGFR酪氨酸激酶、內分泌抵抗(Endocrine resistance)、AGE-RAGE信號通路、花生四烯酸等信號通路相關。

圖14 KEGG富集分析

3 討論

古代經典名方當歸四逆湯是中醫藥文化的瑰寶,臨床使用廣泛,單一的中藥成分就較為多樣、不同藥味配伍其成分更為復雜,因此,借助現代分析技術對經典名方中的化學基礎物質進行分析,是成分復雜的中藥復方制劑藥效物質研究、質量標準建立及新藥二次開發的基礎。為了確保結果準確可靠,本研究在課題組前期建立的色譜條件下,通過UPLC-Q-Orbitrap-MS技術首次對經典名方當歸四逆湯化學成分進行定性分析,通過與對照品、數據庫比對及軟件預測分析,正、負離子模式下共鑒定出160個化合物。在此基礎上應用網絡藥理學的研究思路進一步明確化學成分-疾病之間的相互關系。 “異病同治”是中醫理論體系的重要診療特點,類風濕性關節炎屬于中醫的“痹病”范疇認為“濕、瘀、虛”為其主要病機,原發性痛經中醫稱“經行腹痛”認為是由于“氣滯血瘀”導致屬于“痛經”范疇。可見兩者均是由于“虛”“瘀”所致,病因、病機、病證相似。

基于“UPLC-MS-網絡藥理學”的研究思路,綜合“成分—靶點—疾病”與PPI網絡分析結果表明當歸四逆湯治療類風濕性關節炎及原發性痛經的關鍵核心靶點共25個,核心成分共10個。靶點網絡按節點度值排名前十個靶點分別為SRC、STAT3、EGFR、MAPK1、PIK3CA、IL6、非受體酪氨酸激酶(janus kinase 2,JAK2)、人核因子κB p105亞基(nuclear factor NF-kappa-B p105 subunit ,NF-κB1)、基質金屬蛋白酶-9 (matrix metalloproteinase-9,MMP9)、雌激素受體(estrogen receptor ,ESR1)。SRC蛋白酪氨酸激酶,誘導磷脂酰肌醇3-激酶在對破骨細胞功能至關重要的信號通路中激活和募集到細胞膜,通過激活線粒體細胞色素C氧化酶促進破骨細胞中的能量產生,激活Yes相關蛋白-Notch通路(yes-associated protein 1-Notch Signaling pathway,YAP1-NOTCH)途徑誘導炎癥誘導的上皮再生來介導IL-6信號傳導,減輕炎癥[23]。STAT3、JAK2通路通過激活IL-6炎癥因子的表達參與炎癥的發生發展[24]。EGFR在成纖維細胞和血管內皮細胞(包括滑膜下)中表達,EGFR抑制劑可減輕小鼠抗原誘導的關節炎[25];MAPK1被誘導磷酸化以激活轉錄因子,如核因子κB(NF-κB)和活化蛋白-1(AP-1)的表達,在炎癥反應中發揮重要作用[26]。PIK3CA、JAK等通路通過刺激炎癥因子的分泌從而參與炎癥反應的調節。IL-6、NF-κB1為典型的致炎因子,誘導多種慢性炎癥疾病。MMP9能夠降低炎癥因子白細胞介素-1β、壞死因子-α、成骨細胞、Toll樣受體2&4(Toll-like receptors 2&4, TLR2&4)的產生,從而調控炎癥過程[27]。ESR1靶點蛋白是一種雌激素受體,可激活血清肥大細胞,釋放致痛物質[28]。核心成分為布雷非德菌素A(Brefeldin A)、木犀草素-7-葡萄糖苷(Luteolin-7-glucoside)、咖啡酸(Caffeic acid)、甘草素(Liquiritigenin)、烏拉爾醇(Uralenol)、原兒茶醛(Protocatechualdehyde)、異甘草黃酮醇(Isolicoflavonol)、阿魏酸(Ferulic acid)、考邁斯托醇(Coumestrol)、白當歸腦(Byakangelicol)。布雷非德菌素A通過抑制Akt、mTOR和NF-κB途徑的激活來減弱角質形成細胞中TNF-α刺激的炎癥介質的產生,減輕炎癥反應[29]。木犀草素-7-葡萄糖苷能夠破壞STAT3的核易位,而且還阻斷能量代謝途徑,通過抑制己糖激酶2活性抑制糖酵解和克雷布斯途徑。可以作為治療炎癥疾病的潛在候選者[30]。甘草素可以抑制IL-1β誘導的氧化氮和前列腺素E的表達。同時,甘草素可以抑制IL-1β誘導的軟骨基質分解代謝酶的上調,此外,IL-1β誘導的膠原II和亞格瑞聚糖的降解可以通過甘草素緩解。在機械上,甘草素通過抑制MAPK和NF-κB1途徑激活來發揮抗炎鎮痛作用[31]。此外,本研究針對PPI網絡篩選出的潛在作用靶點進行GO與KEGG富集分析,初步探索當歸四逆湯治療類風濕性關節炎及原發性痛經的潛在分子機制。由富集的結果可知,當歸四逆湯作用于類風濕性關節炎及原發性痛經“異病同治”的作用機制主要為減輕炎癥,其中調控PI3K-Akt信號通路、下調EGFR、抑制下游的NF-κB途徑的激活可能是其主要作用機制。

綜上所述,本研究采用UPLC-Q-Orbitrap-MS快速解析當歸四逆湯的化學組成,構建“化學-成分-疾病”作用網絡,從多角度剖析當歸四逆湯發揮鎮痛抗炎的潛在作用機制,為深入研究其藥效物質基礎奠定了可靠基礎,為后續當歸四逆湯藥效物質基礎及作用機制研究、質量標準建立等提供科學參考。