木質素生物合成途徑相關基因調控琯溪蜜柚汁胞?；难芯?/h1>
2023-09-10 09:49:58劉鹿寧趙秋月葛聰田志嬌周曉俐阮翥龍莊木來李延王平
果樹學報 2023年3期
劉鹿寧 趙秋月 葛聰 田志嬌 周曉俐 阮翥龍 莊木來 李延 王平
摘要：【目的】探究琯溪蜜柚果實汁胞?；^程中木質素生物合成途徑相關基因在果實發育過程中的表達特征，以揭示汁胞?；^程中木質素合成的分子調控機制。【方法】選取2018 年花后135、165、195、215 d 4 個時期的琯溪蜜柚果實，測定汁胞粒化率及木質素含量以及分析轉錄組數據篩選到的木質素生物合成途徑關鍵基因的差異表達和相關酶活性變化，并進行汁胞細胞壁木質素沉積的顯微觀察。【結果】在琯溪蜜柚花后195 至215 d 果實發育成熟期，木質素生物合成途徑中CrPAL1、CrPAL3、CrC4H1、CrC4H2、Cr4CL、CrCCR3、CrCAD3、CrPOD2 和CrPOD7 等9 個基因的表達量都顯著增強，qRT-PCR驗證結果與轉錄組數據一致。這期間果實汁胞?；黠@加速，木質素合成相關酶苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸-4-羥基化酶（C4H）、4-香豆酸輔酶A連接酶（4CL）、肉桂醇脫氫酶（CAD）、過氧化物酶（POD）的活性明顯上升，木質素含量顯著積累，番紅染色顯示木質素在蜜柚汁胞細胞壁中明顯沉積?！窘Y論】琯溪蜜柚木質素生物合成途徑相關基因參與調控汁胞?；^程中細胞壁木質素的合成。研究結果為今后琯溪蜜柚的品種改良和分子育種提供了理論基礎。
關鍵詞：琯溪蜜柚；汁胞?；?；基因調控；酶活性；木質素合成
中圖分類號：S666.3 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980（2023）03-0432-10
琯溪蜜柚[Citrus grandis（L.）Osbeck. Guanxipomelo]為亞熱帶蕓香科常綠果樹，是福建省平和縣乃至全國具有代表性的亞熱帶水果之一，已有500多年的栽培歷史，是當地農民脫貧致富的主要經濟來源[1]。然而，琯溪蜜柚的汁胞粒化嚴重影響到了果實的生產和銷售，對琯溪蜜柚的口碑和相關產業造成了沖擊，給當地農民帶來一定的經濟損失。
琯溪蜜柚成熟過程中的汁胞粒化是一種生理病害，將粒化汁胞與正常汁胞比較，發現粒化汁胞變干、變硬，呈現渾濁的絮狀物。汁胞?；瘜麑嵵耐庥^、質地和風味都有不利影響[2]。Shomer 等[3]通過觀察琯溪蜜柚汁胞細胞壁的超微結構，認為汁胞粒化是汁胞細胞次生壁木質化形成厚壁組織的結果。潘騰飛等[4]的研究發現琯溪蜜柚汁胞?；笖蹬c木質素含量呈顯著正相關，表明琯溪蜜柚汁胞?；湍举|素合成關系密切。木質素是沉積在植物細胞壁中的酚類聚合物，主要有3 種類型[5]，分別是由香豆醇合成的對羥基苯基木質素（H型）、由松伯醇合成的愈創木基木質素（G型）、由芥子醇合成的紫丁香基木質素（S 型）[6]。琯溪蜜柚?；邪l現的木質素主要為G型木質素[7]。研究發現肉桂酰輔A還原酶（CCR）、肉桂醇脫氫酶（CAD）和過氧化物酶（POD）等和木質素合成直接相關[8]。此外，苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸-4-羥基化酶（C4H）、4-香豆酸輔酶A連接酶（4CL）、CAD、POD等酶活性的變化也與木質素含量相關[9]。目前，對琯溪蜜柚汁胞?；c木質素代謝關系的報道多為對木質素代謝途徑中個別基因家族的分析或木質素相關合成酶活性對木質素含量的影響，關于琯溪蜜柚汁胞粒化過程中木質素代謝途徑的系列關鍵基因表達變化與汁胞?；P系的相關研究尚未見報道，因此在基因、酶及其代謝物水平上對此展開系統研究是十分必要的。
琯溪蜜柚果實汁胞粒化現象通常發生在果實成熟和采后的貯藏過程中，有關采后貯藏汁胞?；难芯枯^多，但對成熟果實的汁胞?；芯枯^少。筆者在本研究中以不同生長發育時期的琯溪蜜柚汁胞為材料，通過轉錄組篩選差異表達的木質素合成關鍵基因分析相關酶活性和木質素含量、?；实淖兓云诮沂粳g溪蜜柚汁胞粒化過程的生理與分子調控機制。
1 材料和方法
1.1 試驗材料
琯溪蜜柚果實樣品由福建省漳州市平和縣小溪鎮舊樓村石角壇“平和琯溪蜜柚綜合試驗站科研基地”果園提供，果園海拔420 m，選取25 年以上樹齡、樹勢一致的健壯樹體，正常管理。于2018 年花后135、165、195 和215 d 4 個時期分別隨機采集大小一致、健康、無明顯機械外傷的果實各9 個立即運回實驗室，并進行果實粒化率的測定和果實汁胞石蠟切片。每個時期每個果實各取汁胞10 g，混合后放入液氮中速凍，存于-80 ℃冰箱，用于后續木質素合成相關酶活性的測定和qRT-PCR驗證試驗。此外，每個果實各取約100 g 置于玻璃瓶內于烘箱60 ℃烘干，研缽研磨后裝入15 mL離心管中，用于木質素含量測定。以上所有試驗均設3 次生物學重復。
1.2 蜜柚果實粒化率、汁胞木質素含量測定
琯溪蜜柚果實粒化率測定參考代亞蘭等[10]的方法，分別測定花后4個時期的粒化汁胞質量和汁胞總質量。果實粒化率/%=?；|量/汁胞總質量×100?，g溪蜜柚果實汁胞木質素含量采用AB 法，即乙酰溴法測定[11]。
1.3 蜜柚汁胞木質素顯微鏡觀察
參照秦永亭等[12]的方法，將琯溪蜜柚汁胞用石蠟包埋后，用石蠟切片機切成7 μm厚的切片，干燥后用番紅染液染色2 h、中性樹膠封片后，用LEICADMI 48倒置顯微鏡觀察。木質化的細胞壁被番紅染成紅色。
1.4 蜜柚汁胞轉錄組木質素合成差異基因表達分析
轉錄組測序由深圳華大基因研究院完成，統計和評估轉錄組測序數據數量和質量以及組裝效果。
通過轉錄組測序，得到基因的表達水平。將log2＞2，并且Q-value ≤ 0.001 的基因定義為差異基因。根據4 個時期汁胞轉錄組測序中的差異基因KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）途徑富集分析，木質素合成代謝途徑屬于苯丙烷次生代謝途徑中的一部分，將所有木質素代謝途徑關鍵基因進行表達量分析，利用TBtools 軟件繪制熱圖，并從中挑選出差異表達基因。
1.5 蜜柚汁胞木質素生物合成差異基因引物設計
從轉錄組中篩選出13 個差異表達基因（CrPAL1、CrPAL3、CrC4H1、CrC4H2、Cr4CL、CrHCT1、CrCCR3、CrCAD3、CrCOMT4、CrPOD2、CrPOD6、CrPOD7、CrPOD8），利用NCBI 上的引物設計程序（https：//www.ncbi.nlm.nih. gov/tools/ primer- blast/index.cgi）、按照熒光定量引物設計原則設計基因的qRT-PCR引物，以Actin 為內參基因（表1）。引物合成由擎科生物公司完成。
1.6 qRT-PCR驗證分析
使用通用RNA提取試劑盒（東盛生物）提取汁胞RNA，參照HiScrip? Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR試劑盒說明書，以琯溪蜜柚果實汁胞RNA為模板合成雙鏈cDNA。使用ChamQ Universal SYBR qPCRMaster Mix 試劑盒在羅氏熒光定量PCR 儀上測定基因的表達量。
1.7 蜜柚汁胞木質素合成相關酶活性測定
分別參考PAL、C4H、4CL、CAD和POD檢測試劑盒（上海優選）說明對琯溪蜜柚果實汁胞進行PAL、C4H、4CL、CAD和POD提取并測定其活性。
1.8 數據處理
采用2-△△Ct方法計算基因的相對表達量[13]。利用WPS 表格進行數據統計（2019），SPSS 19.0 進行差異顯著性分析。
2 結果與分析
2.1 琯溪蜜柚果實?；始爸举|素含量的變化
在琯溪蜜柚果實不同生長發育期間，花后195 d之前的果實發育期未見汁胞粒化，但在花后195 d 之后的果實成熟期汁胞?；拭黠@增加（圖1）；隨著蜜柚果實的成熟，汁胞木質素含量也呈現增加的趨勢，在花后195 和215 d 汁胞中發現木質素含量顯著增加（圖1），這些結果說明在蜜柚果實生長發育期間，隨著木質素的積累，果實汁胞?；室搽S之增加，果實汁胞?；赡苁悄举|素含量過度累積引起的。
2.2 蜜柚汁胞木質素顯微觀察
對FAA固定處理后的花后135、165、195和215 d的琯溪蜜柚果實汁胞進行石蠟包埋、切片及番紅染色，圖片由下至上是汁胞內部細胞到汁胞外表皮層。用20倍顯微鏡觀察發現，花后135 和165 d 蜜柚果實汁胞顏色相似，無明顯紅色、無明顯顏色變化（圖2-A、B），說明這兩個時期汁胞木質素含量較低；花后195 d 汁胞內部細胞壁呈現紅色（圖2-C），汁胞外表皮層細胞壁顏色與花后135、165 d 汁胞相比無明顯變化，但此時汁胞已出現木質化，木質素含量較花后135、165 d 相比略微增加?；ê?15 d 汁胞內部細胞和外表皮層的細胞壁均被染成紅色（圖2-D），且顏色較花后195 d 更深，說明在花后195 d 之后的果實成熟期汁胞細胞壁木質化程度增加，木質素含量顯著上升。
2.3 蜜柚汁胞轉錄組木質素合成差異基因表達分析
對4 個生長發育時期琯溪蜜柚果實汁胞轉錄組17 個木質素生物合成途徑中差異表達基因進行熱圖分析（圖3），結果表明，其中1 個基因CrCCR1 和另外3 個基因CrPAL、Cr4CL2、Cr4CL7 分別在花后165 和195 d 的表達量與這2 個時期的木質素含量的增加趨勢不相一致。但值得注意的是，CrPAL1、CrPAL3、CrC4H1、CrC4H2、Cr4CL、CrHCT1、CrCCR3、CrCAD3、CrCOMT4、CrPOD2、CrPOD6、CrPOD7、CrPOD8 等13 個基因的表達量隨著果實的發育成熟進程，在花后165、195 和215 d 差異表達（log2＞2，Q-value ≤ 0.001）這些基因的表達水平在蜜柚花后215 d 與195 d 相比上調了2 至9 倍，并且和木質素含量的變化趨勢相一致。研究認為這13 個基因可能是蜜柚汁胞木質素合成的關鍵基因，因此篩選這13個基因用于后續的qRT-PCR驗證分析。
2.4 蜜柚汁胞木質素合成差異基因qRT-PCR驗證分析
對13 個木質素生物合成途徑差異基因進行qRT- PCR 驗證（ 圖4）。隨著果實的生長發育CrPAL1、CrPAL3、CrC4H1、CrC4H2、Cr4CL、CrCCR3、CrCAD3、CrPOD2 和CrPOD7 等9 個基因qRTPCR相對表達量都上調表達，尤其在花后195 至215 d 的果實成熟期顯著表達，且與轉錄組測序的結果一致，證明了這9 個基因轉錄組數據的可靠性。說明花后195 至215 d 是蜜柚果實汁胞?；瘯r期。另外4 個基因CrHCT1、CrCOMT4、CrPOD6 和CrPOD8 的qRT-PCR相對表達量變化與轉錄組數據不一致。
2.5 蜜柚汁胞木質素生物合成途徑相關酶活性變化分析
分別對花后135 至215 d 琯溪蜜柚果實汁胞中木質素生物合成途徑相關酶PAL、C4H、4CL、CAD和POD的活性進行測定，結果顯示，酶活性隨著果實的發育成熟呈現上升趨勢，在花后215 d 達到峰值（圖5），與木質素含量及?；实淖兓幝苫疽恢拢砻鬟@些酶可能在蜜柚果實發育成熟階段的汁胞木質素生物合成途徑中起關鍵作用。
3 討論
木質素是植物細胞中的苯丙烷代謝途徑的代謝產物。木質素在果實汁胞中過量積累可能會導致汁胞?；瑫绊懝麑嵉目诟泻惋L味，目前在收獲的柑橘果實中普遍存在汁胞?；@一現象[14]。前人有研究表明木質素生物合成與汁胞粒化之間有著密切關聯，?；闹ǔ０l生木質素過度積累的現象[15]，但總體研究還不夠完整和系統。因此，筆者在基因轉錄、翻譯和產物生成3 個水平展開木質素代謝與琯溪蜜柚汁胞?；瘷C制的系統研究。
果實中木質素含量的變化與木質素生物合成途徑相關基因的表達有關，其中PAL、C4H、4CL、CCR、CAD和POD等基因在木質素的合成過程中起著極為重要的調控作用，且木質素合成量與這些基因的表達量呈正相關[16-17]。筆者在本研究中通過琯溪蜜柚汁胞轉錄組測序篩選到17 個木質素生物合成途徑的差異表達基因，其中13 個基因的表達量與汁胞?；始澳举|素含量變化趨勢一致，且在花后195至215 d 顯著表達。qRT- PCR 驗證結果顯示，CrPAL1、CrPAL3、CrC4H1、CrC4H2、CrCCR3、CrCAD3、Cr4CL、CrPOD2、CrPOD7 等9 個基因在蜜柚果實發育和成熟期的表達量與轉錄組測序結果變化趨勢一致，均隨著果實的成熟呈顯著上調表達趨勢，同時相關酶活性也隨之增強，并與木質素生物合成的增加及蜜柚汁胞粒化趨勢相一致。這一研究結果表明以上9 個基因是蜜柚汁胞木質素的合成調控的關鍵基因，它們可能參與了琯溪蜜柚汁胞粒化的過程。
PAL是苯丙烷代謝途徑中木質素生物合成的第一個關鍵酶，它在木質素生物合成中非常重要[18]，PAL催化苯丙氨酸脫氨為反式肉桂酸[19]。前人通過對5 種白梨PAL 基因家族比較分析，結果顯示Pb-PAL1 和PbPAL2 的表達水平對梨果中石細胞和木質素的含量有影響，PbPAL1 和PbPAL2 的轉錄水平在木質化組織（根和莖）中高于在木質化程度較低的組織（葉、芽和花）[20]。筆者在本研究中發現CrPAL1、CrPAL3 在汁胞木質素含量及?；瘦^高的成熟期果實中表達量也大幅度增加，PAL酶活性與汁胞木質素含量測定結果及PAL 基因表達量一致，與汁胞粒化率也大致相符。C4H被證明參與了木質素生物合成途徑中G 木質素單體的產生[21]，小麥中發現C4H1 基因的表達與木質素含量呈顯著相關[22]，竹筍貯藏期間C4H活性增加促進木質素的合成，導致竹筍組織木質化[23]，在本研究中，蜜柚汁胞CrC4H1、CrC4H2 的表達量在成熟期顯著上調表達。同時，C4H酶活性也隨著果實的發育成熟逐漸增強，并與汁胞中木質素含量及?；首兓嘁恢?。4CL 是CCR 上游的一個酶，4CL 的產物是CCR 的底物，而CCR被認為是木質素合成的關鍵酶[24]。青稞研究中發現4CL是影響木質素合成的一個關鍵酶，4CL活性的提高可以增強莖稈的抗倒伏能力[25]。在本研究中轉錄組測序與qRT-PCR 結果顯示隨著木質素含量的增加及汁胞?；实纳仙?，Cr4CL 在蜜柚成熟過程中也逐漸上調表達，4CL 的酶活性也與Cr4CL的表達相一致，這也與芹菜發育階段的觀察結果相似[26]。前人在梨果實中木質素合成的有關研究中發現，PbCCR1、PbCCR2 和PbCCR3 的表達趨勢與果核細胞的積累和木質素含量相關[27]，筆者在本研究中發現CrCCR3 在汁胞中的表達趨勢也與木質素含量、?；首兓厔菹嘁恢?。此外，催化肉桂醛轉化為肉桂醇[28]，參與單體木質素生物合成最后一步的另一個關鍵酶是CAD[29]。SbCAD2 和OsCAD2 基因已被證明參與了莖稈木質素的生物合成[30- 31]，PpCAD2 過量表達促進了轉基因番茄植株中木質素的沉積，木質素含量增加，CAD 酶活性更活躍[32]。
筆者在本研究中發現，蜜柚汁胞中CAD活性在蜜柚成熟后期相應上升，且與木質素含量、木質素合成酶基因CrCAD3 的表達以及?；氏嘁恢隆OD則通過聚合單體木質素催化松柏醇發生脫氫聚合反應形成G 型木質素[33]。有報道對白樺POD 全基因組鑒定，發現BpPOD6、BpPOD21 和BpPOD37 在木質部中高度表達[34]，AgPOD 在芹菜葉柄、葉片中表達水平與木質素積累模式一致，說明POD在木質素生物合成中起著重要作用[35]。貯藏水果蔬菜時，通常會通過抑制木質素合成相關酶POD 活性來減緩木質素積累[36]，對貯藏菜薹進行乙烯處理，發現木質素含量下降的同時BcPOD 的表達也下降[37]。在本研究中CrPOD2 以及CrPOD7 基因表達與POD酶活性以及木質素含量和粒化率變化相符，表明CrPOD2 和CrPOD7 參與了蜜柚汁胞?；^程木質素的調控作用。本研究表明，以上琯溪蜜柚汁胞9 個木質素合成基因的表達及相關酶活性的動態變化與汁胞木質素含量和?；首兓嘁恢?，因此認為琯溪蜜柚汁胞粒化是由木質素代謝途徑中的系列關鍵基因共同調控的結果。
4 結論
在琯溪蜜柚果實發育成熟過程中，汁胞?；孰S著木質素含量的積累而提高，尤其在成熟后期提高迅速。蜜柚汁胞中CrPAL1、CrPAL3、CrC4H1、CrC4H2、Cr4CL、CrCCR3、CrCAD3、CrPOD2 和CrPOD7 是木質素合成的關鍵調控基因。這9 個基因的上調表達，調控木質素合成途徑中重要酶PAL、C4H、4CL、CAD和POD活性的增強，從而促進汁胞木質素含量積累，引起汁胞?；l生。筆者在分子和生理水平上系統地研究了琯溪蜜柚果實發育過程中汁胞木質素生物合成途徑關鍵基因表達與汁胞粒化的關系，為今后琯溪蜜柚的品種改良和分子育種提供了理論基礎。
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劉鹿寧 趙秋月 葛聰 田志嬌 周曉俐 阮翥龍 莊木來 李延 王平
摘要：【目的】探究琯溪蜜柚果實汁胞?；^程中木質素生物合成途徑相關基因在果實發育過程中的表達特征，以揭示汁胞?；^程中木質素合成的分子調控機制。【方法】選取2018 年花后135、165、195、215 d 4 個時期的琯溪蜜柚果實，測定汁胞粒化率及木質素含量以及分析轉錄組數據篩選到的木質素生物合成途徑關鍵基因的差異表達和相關酶活性變化，并進行汁胞細胞壁木質素沉積的顯微觀察。【結果】在琯溪蜜柚花后195 至215 d 果實發育成熟期，木質素生物合成途徑中CrPAL1、CrPAL3、CrC4H1、CrC4H2、Cr4CL、CrCCR3、CrCAD3、CrPOD2 和CrPOD7 等9 個基因的表達量都顯著增強，qRT-PCR驗證結果與轉錄組數據一致。這期間果實汁胞?；黠@加速，木質素合成相關酶苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸-4-羥基化酶（C4H）、4-香豆酸輔酶A連接酶（4CL）、肉桂醇脫氫酶（CAD）、過氧化物酶（POD）的活性明顯上升，木質素含量顯著積累，番紅染色顯示木質素在蜜柚汁胞細胞壁中明顯沉積?！窘Y論】琯溪蜜柚木質素生物合成途徑相關基因參與調控汁胞?；^程中細胞壁木質素的合成。研究結果為今后琯溪蜜柚的品種改良和分子育種提供了理論基礎。
關鍵詞：琯溪蜜柚；汁胞?；?；基因調控；酶活性；木質素合成
中圖分類號：S666.3 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980（2023）03-0432-10
琯溪蜜柚[Citrus grandis（L.）Osbeck. Guanxipomelo]為亞熱帶蕓香科常綠果樹，是福建省平和縣乃至全國具有代表性的亞熱帶水果之一，已有500多年的栽培歷史，是當地農民脫貧致富的主要經濟來源[1]。然而，琯溪蜜柚的汁胞粒化嚴重影響到了果實的生產和銷售，對琯溪蜜柚的口碑和相關產業造成了沖擊，給當地農民帶來一定的經濟損失。
琯溪蜜柚成熟過程中的汁胞粒化是一種生理病害，將粒化汁胞與正常汁胞比較，發現粒化汁胞變干、變硬，呈現渾濁的絮狀物。汁胞?；瘜麑嵵耐庥^、質地和風味都有不利影響[2]。Shomer 等[3]通過觀察琯溪蜜柚汁胞細胞壁的超微結構，認為汁胞粒化是汁胞細胞次生壁木質化形成厚壁組織的結果。潘騰飛等[4]的研究發現琯溪蜜柚汁胞?；笖蹬c木質素含量呈顯著正相關，表明琯溪蜜柚汁胞?；湍举|素合成關系密切。木質素是沉積在植物細胞壁中的酚類聚合物，主要有3 種類型[5]，分別是由香豆醇合成的對羥基苯基木質素（H型）、由松伯醇合成的愈創木基木質素（G型）、由芥子醇合成的紫丁香基木質素（S 型）[6]。琯溪蜜柚?；邪l現的木質素主要為G型木質素[7]。研究發現肉桂酰輔A還原酶（CCR）、肉桂醇脫氫酶（CAD）和過氧化物酶（POD）等和木質素合成直接相關[8]。此外，苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸-4-羥基化酶（C4H）、4-香豆酸輔酶A連接酶（4CL）、CAD、POD等酶活性的變化也與木質素含量相關[9]。目前，對琯溪蜜柚汁胞?；c木質素代謝關系的報道多為對木質素代謝途徑中個別基因家族的分析或木質素相關合成酶活性對木質素含量的影響，關于琯溪蜜柚汁胞粒化過程中木質素代謝途徑的系列關鍵基因表達變化與汁胞?；P系的相關研究尚未見報道，因此在基因、酶及其代謝物水平上對此展開系統研究是十分必要的。
琯溪蜜柚果實汁胞粒化現象通常發生在果實成熟和采后的貯藏過程中，有關采后貯藏汁胞?；难芯枯^多，但對成熟果實的汁胞?；芯枯^少。筆者在本研究中以不同生長發育時期的琯溪蜜柚汁胞為材料，通過轉錄組篩選差異表達的木質素合成關鍵基因分析相關酶活性和木質素含量、?；实淖兓云诮沂粳g溪蜜柚汁胞粒化過程的生理與分子調控機制。
1 材料和方法
1.1 試驗材料
琯溪蜜柚果實樣品由福建省漳州市平和縣小溪鎮舊樓村石角壇“平和琯溪蜜柚綜合試驗站科研基地”果園提供，果園海拔420 m，選取25 年以上樹齡、樹勢一致的健壯樹體，正常管理。于2018 年花后135、165、195 和215 d 4 個時期分別隨機采集大小一致、健康、無明顯機械外傷的果實各9 個立即運回實驗室，并進行果實粒化率的測定和果實汁胞石蠟切片。每個時期每個果實各取汁胞10 g，混合后放入液氮中速凍，存于-80 ℃冰箱，用于后續木質素合成相關酶活性的測定和qRT-PCR驗證試驗。此外，每個果實各取約100 g 置于玻璃瓶內于烘箱60 ℃烘干，研缽研磨后裝入15 mL離心管中，用于木質素含量測定。以上所有試驗均設3 次生物學重復。
1.2 蜜柚果實粒化率、汁胞木質素含量測定
琯溪蜜柚果實粒化率測定參考代亞蘭等[10]的方法，分別測定花后4個時期的粒化汁胞質量和汁胞總質量。果實粒化率/%=?；|量/汁胞總質量×100?，g溪蜜柚果實汁胞木質素含量采用AB 法，即乙酰溴法測定[11]。
1.3 蜜柚汁胞木質素顯微鏡觀察
參照秦永亭等[12]的方法，將琯溪蜜柚汁胞用石蠟包埋后，用石蠟切片機切成7 μm厚的切片，干燥后用番紅染液染色2 h、中性樹膠封片后，用LEICADMI 48倒置顯微鏡觀察。木質化的細胞壁被番紅染成紅色。
1.4 蜜柚汁胞轉錄組木質素合成差異基因表達分析
轉錄組測序由深圳華大基因研究院完成，統計和評估轉錄組測序數據數量和質量以及組裝效果。
通過轉錄組測序，得到基因的表達水平。將log2＞2，并且Q-value ≤ 0.001 的基因定義為差異基因。根據4 個時期汁胞轉錄組測序中的差異基因KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）途徑富集分析，木質素合成代謝途徑屬于苯丙烷次生代謝途徑中的一部分，將所有木質素代謝途徑關鍵基因進行表達量分析，利用TBtools 軟件繪制熱圖，并從中挑選出差異表達基因。
1.5 蜜柚汁胞木質素生物合成差異基因引物設計
從轉錄組中篩選出13 個差異表達基因（CrPAL1、CrPAL3、CrC4H1、CrC4H2、Cr4CL、CrHCT1、CrCCR3、CrCAD3、CrCOMT4、CrPOD2、CrPOD6、CrPOD7、CrPOD8），利用NCBI 上的引物設計程序（https：//www.ncbi.nlm.nih. gov/tools/ primer- blast/index.cgi）、按照熒光定量引物設計原則設計基因的qRT-PCR引物，以Actin 為內參基因（表1）。引物合成由擎科生物公司完成。
1.6 qRT-PCR驗證分析
使用通用RNA提取試劑盒（東盛生物）提取汁胞RNA，參照HiScrip? Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR試劑盒說明書，以琯溪蜜柚果實汁胞RNA為模板合成雙鏈cDNA。使用ChamQ Universal SYBR qPCRMaster Mix 試劑盒在羅氏熒光定量PCR 儀上測定基因的表達量。
1.7 蜜柚汁胞木質素合成相關酶活性測定
分別參考PAL、C4H、4CL、CAD和POD檢測試劑盒（上海優選）說明對琯溪蜜柚果實汁胞進行PAL、C4H、4CL、CAD和POD提取并測定其活性。
1.8 數據處理
采用2-△△Ct方法計算基因的相對表達量[13]。利用WPS 表格進行數據統計（2019），SPSS 19.0 進行差異顯著性分析。
2 結果與分析
2.1 琯溪蜜柚果實?；始爸举|素含量的變化
在琯溪蜜柚果實不同生長發育期間，花后195 d之前的果實發育期未見汁胞粒化，但在花后195 d 之后的果實成熟期汁胞?；拭黠@增加（圖1）；隨著蜜柚果實的成熟，汁胞木質素含量也呈現增加的趨勢，在花后195 和215 d 汁胞中發現木質素含量顯著增加（圖1），這些結果說明在蜜柚果實生長發育期間，隨著木質素的積累，果實汁胞?；室搽S之增加，果實汁胞?；赡苁悄举|素含量過度累積引起的。
2.2 蜜柚汁胞木質素顯微觀察
對FAA固定處理后的花后135、165、195和215 d的琯溪蜜柚果實汁胞進行石蠟包埋、切片及番紅染色，圖片由下至上是汁胞內部細胞到汁胞外表皮層。用20倍顯微鏡觀察發現，花后135 和165 d 蜜柚果實汁胞顏色相似，無明顯紅色、無明顯顏色變化（圖2-A、B），說明這兩個時期汁胞木質素含量較低；花后195 d 汁胞內部細胞壁呈現紅色（圖2-C），汁胞外表皮層細胞壁顏色與花后135、165 d 汁胞相比無明顯變化，但此時汁胞已出現木質化，木質素含量較花后135、165 d 相比略微增加?；ê?15 d 汁胞內部細胞和外表皮層的細胞壁均被染成紅色（圖2-D），且顏色較花后195 d 更深，說明在花后195 d 之后的果實成熟期汁胞細胞壁木質化程度增加，木質素含量顯著上升。
2.3 蜜柚汁胞轉錄組木質素合成差異基因表達分析
對4 個生長發育時期琯溪蜜柚果實汁胞轉錄組17 個木質素生物合成途徑中差異表達基因進行熱圖分析（圖3），結果表明，其中1 個基因CrCCR1 和另外3 個基因CrPAL、Cr4CL2、Cr4CL7 分別在花后165 和195 d 的表達量與這2 個時期的木質素含量的增加趨勢不相一致。但值得注意的是，CrPAL1、CrPAL3、CrC4H1、CrC4H2、Cr4CL、CrHCT1、CrCCR3、CrCAD3、CrCOMT4、CrPOD2、CrPOD6、CrPOD7、CrPOD8 等13 個基因的表達量隨著果實的發育成熟進程，在花后165、195 和215 d 差異表達（log2＞2，Q-value ≤ 0.001）這些基因的表達水平在蜜柚花后215 d 與195 d 相比上調了2 至9 倍，并且和木質素含量的變化趨勢相一致。研究認為這13 個基因可能是蜜柚汁胞木質素合成的關鍵基因，因此篩選這13個基因用于后續的qRT-PCR驗證分析。
2.4 蜜柚汁胞木質素合成差異基因qRT-PCR驗證分析
對13 個木質素生物合成途徑差異基因進行qRT- PCR 驗證（ 圖4）。隨著果實的生長發育CrPAL1、CrPAL3、CrC4H1、CrC4H2、Cr4CL、CrCCR3、CrCAD3、CrPOD2 和CrPOD7 等9 個基因qRTPCR相對表達量都上調表達，尤其在花后195 至215 d 的果實成熟期顯著表達，且與轉錄組測序的結果一致，證明了這9 個基因轉錄組數據的可靠性。說明花后195 至215 d 是蜜柚果實汁胞?；瘯r期。另外4 個基因CrHCT1、CrCOMT4、CrPOD6 和CrPOD8 的qRT-PCR相對表達量變化與轉錄組數據不一致。
2.5 蜜柚汁胞木質素生物合成途徑相關酶活性變化分析
分別對花后135 至215 d 琯溪蜜柚果實汁胞中木質素生物合成途徑相關酶PAL、C4H、4CL、CAD和POD的活性進行測定，結果顯示，酶活性隨著果實的發育成熟呈現上升趨勢，在花后215 d 達到峰值（圖5），與木質素含量及?；实淖兓幝苫疽恢拢砻鬟@些酶可能在蜜柚果實發育成熟階段的汁胞木質素生物合成途徑中起關鍵作用。
3 討論
木質素是植物細胞中的苯丙烷代謝途徑的代謝產物。木質素在果實汁胞中過量積累可能會導致汁胞?；瑫绊懝麑嵉目诟泻惋L味，目前在收獲的柑橘果實中普遍存在汁胞?；@一現象[14]。前人有研究表明木質素生物合成與汁胞粒化之間有著密切關聯，?；闹ǔ０l生木質素過度積累的現象[15]，但總體研究還不夠完整和系統。因此，筆者在基因轉錄、翻譯和產物生成3 個水平展開木質素代謝與琯溪蜜柚汁胞?；瘷C制的系統研究。
果實中木質素含量的變化與木質素生物合成途徑相關基因的表達有關，其中PAL、C4H、4CL、CCR、CAD和POD等基因在木質素的合成過程中起著極為重要的調控作用，且木質素合成量與這些基因的表達量呈正相關[16-17]。筆者在本研究中通過琯溪蜜柚汁胞轉錄組測序篩選到17 個木質素生物合成途徑的差異表達基因，其中13 個基因的表達量與汁胞?；始澳举|素含量變化趨勢一致，且在花后195至215 d 顯著表達。qRT- PCR 驗證結果顯示，CrPAL1、CrPAL3、CrC4H1、CrC4H2、CrCCR3、CrCAD3、Cr4CL、CrPOD2、CrPOD7 等9 個基因在蜜柚果實發育和成熟期的表達量與轉錄組測序結果變化趨勢一致，均隨著果實的成熟呈顯著上調表達趨勢，同時相關酶活性也隨之增強，并與木質素生物合成的增加及蜜柚汁胞粒化趨勢相一致。這一研究結果表明以上9 個基因是蜜柚汁胞木質素的合成調控的關鍵基因，它們可能參與了琯溪蜜柚汁胞粒化的過程。
PAL是苯丙烷代謝途徑中木質素生物合成的第一個關鍵酶，它在木質素生物合成中非常重要[18]，PAL催化苯丙氨酸脫氨為反式肉桂酸[19]。前人通過對5 種白梨PAL 基因家族比較分析，結果顯示Pb-PAL1 和PbPAL2 的表達水平對梨果中石細胞和木質素的含量有影響，PbPAL1 和PbPAL2 的轉錄水平在木質化組織（根和莖）中高于在木質化程度較低的組織（葉、芽和花）[20]。筆者在本研究中發現CrPAL1、CrPAL3 在汁胞木質素含量及?；瘦^高的成熟期果實中表達量也大幅度增加，PAL酶活性與汁胞木質素含量測定結果及PAL 基因表達量一致，與汁胞粒化率也大致相符。C4H被證明參與了木質素生物合成途徑中G 木質素單體的產生[21]，小麥中發現C4H1 基因的表達與木質素含量呈顯著相關[22]，竹筍貯藏期間C4H活性增加促進木質素的合成，導致竹筍組織木質化[23]，在本研究中，蜜柚汁胞CrC4H1、CrC4H2 的表達量在成熟期顯著上調表達。同時，C4H酶活性也隨著果實的發育成熟逐漸增強，并與汁胞中木質素含量及?；首兓嘁恢?。4CL 是CCR 上游的一個酶，4CL 的產物是CCR 的底物，而CCR被認為是木質素合成的關鍵酶[24]。青稞研究中發現4CL是影響木質素合成的一個關鍵酶，4CL活性的提高可以增強莖稈的抗倒伏能力[25]。在本研究中轉錄組測序與qRT-PCR 結果顯示隨著木質素含量的增加及汁胞?；实纳仙?，Cr4CL 在蜜柚成熟過程中也逐漸上調表達，4CL 的酶活性也與Cr4CL的表達相一致，這也與芹菜發育階段的觀察結果相似[26]。前人在梨果實中木質素合成的有關研究中發現，PbCCR1、PbCCR2 和PbCCR3 的表達趨勢與果核細胞的積累和木質素含量相關[27]，筆者在本研究中發現CrCCR3 在汁胞中的表達趨勢也與木質素含量、?；首兓厔菹嘁恢?。此外，催化肉桂醛轉化為肉桂醇[28]，參與單體木質素生物合成最后一步的另一個關鍵酶是CAD[29]。SbCAD2 和OsCAD2 基因已被證明參與了莖稈木質素的生物合成[30- 31]，PpCAD2 過量表達促進了轉基因番茄植株中木質素的沉積，木質素含量增加，CAD 酶活性更活躍[32]。
筆者在本研究中發現，蜜柚汁胞中CAD活性在蜜柚成熟后期相應上升，且與木質素含量、木質素合成酶基因CrCAD3 的表達以及?；氏嘁恢隆OD則通過聚合單體木質素催化松柏醇發生脫氫聚合反應形成G 型木質素[33]。有報道對白樺POD 全基因組鑒定，發現BpPOD6、BpPOD21 和BpPOD37 在木質部中高度表達[34]，AgPOD 在芹菜葉柄、葉片中表達水平與木質素積累模式一致，說明POD在木質素生物合成中起著重要作用[35]。貯藏水果蔬菜時，通常會通過抑制木質素合成相關酶POD 活性來減緩木質素積累[36]，對貯藏菜薹進行乙烯處理，發現木質素含量下降的同時BcPOD 的表達也下降[37]。在本研究中CrPOD2 以及CrPOD7 基因表達與POD酶活性以及木質素含量和粒化率變化相符，表明CrPOD2 和CrPOD7 參與了蜜柚汁胞?；^程木質素的調控作用。本研究表明，以上琯溪蜜柚汁胞9 個木質素合成基因的表達及相關酶活性的動態變化與汁胞木質素含量和?；首兓嘁恢?，因此認為琯溪蜜柚汁胞粒化是由木質素代謝途徑中的系列關鍵基因共同調控的結果。
4 結論
在琯溪蜜柚果實發育成熟過程中，汁胞?；孰S著木質素含量的積累而提高，尤其在成熟后期提高迅速。蜜柚汁胞中CrPAL1、CrPAL3、CrC4H1、CrC4H2、Cr4CL、CrCCR3、CrCAD3、CrPOD2 和CrPOD7 是木質素合成的關鍵調控基因。這9 個基因的上調表達，調控木質素合成途徑中重要酶PAL、C4H、4CL、CAD和POD活性的增強，從而促進汁胞木質素含量積累，引起汁胞?；l生。筆者在分子和生理水平上系統地研究了琯溪蜜柚果實發育過程中汁胞木質素生物合成途徑關鍵基因表達與汁胞粒化的關系，為今后琯溪蜜柚的品種改良和分子育種提供了理論基礎。
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