荔枝CDPK基因家族鑒定及其在霜疫病脅迫下的表達(dá)分析

劉海倫 嚴(yán)倩 姜永華 史發(fā)超 陳潔珍 蔡長(zhǎng)河 歐良喜

摘要：【目的】鑒定荔枝（Litchi chinensis Sonn.）鈣依賴蛋白激酶（CDPK）基因家族，并分析其在不同組織和荔枝霜疫病脅迫下的表達(dá)模式。【方法】基于荔枝基因組數(shù)據(jù)，利用生物信息學(xué)方法鑒定CDPK家族基因，并對(duì)其序列特征、基因結(jié)構(gòu)、啟動(dòng)子順式作用元件、染色體定位和進(jìn)化關(guān)系等進(jìn)行分析。依賴276 份荔枝種質(zhì)材料，篩選高抗霜疫病的優(yōu)良荔枝品種。另外，通過RNA-Seq 和qRT-PCR方法檢測(cè)高抗病荔枝品種中LcCDPK基因家族成員在荔枝霜疫病脅迫處理下的表達(dá)模式。【結(jié)果】從276 份荔枝自然群體材料中鑒定到荔枝高抗霜疫病品種裕榮1 號(hào)（YR1）。從荔枝基因組中共鑒定出19 個(gè)LcCDPK 基因家族成員，分布于11 條染色體上。根據(jù)保守結(jié)構(gòu)域和系統(tǒng)發(fā)育分析將其分為4 個(gè)亞家族。基因結(jié)構(gòu)分析表明，LcCDPKs外顯子數(shù)量為7～19。蛋白結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，所有LcCDPK蛋白均具有1～4 個(gè)EF-hand結(jié)構(gòu)域。順式作用元件分析表明，LcCDPKs成員擁有大量的生物和非生物脅迫響應(yīng)元件。組織表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，LcCDPK基因在荔枝不同組織存在組織特異性。另外，表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)在高抗霜疫病荔枝裕榮1 號(hào)（YR1）中，LcCDPK5、LcCDPK17 和LcCDPK19 在霜疫病脅迫后急劇上調(diào)表達(dá)，LcCDPK3 和LcCDPK8 急劇下調(diào)表達(dá)。【結(jié)論】裕榮1 號(hào)（YR1）是一種高抗霜疫病的荔枝品種。荔枝基因組中共鑒定出19 個(gè)CDPK基因家族成員，具有明顯的組織特異性，LcCDPK5、LcCDPK17、LcCDPK19、LcCDPK3 和LcCDPK8 可能在荔枝抗霜疫病過程中發(fā)揮重要作用。研究結(jié)果為進(jìn)一步探究荔枝CDPK基因家族提供了參考。

關(guān)鍵詞：荔枝；鈣依賴蛋白激酶（CDPK）；荔枝霜疫病；表達(dá)分析

中圖分類號(hào)：S667.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1009-9980（2023）03-0442-15

鈣離子（Ca2+）作為第二信使參與植物細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，在植物生長(zhǎng)發(fā)育以及抗逆境脅迫中均發(fā)揮著重要作用[1]。在植物中，鈣離子結(jié)合蛋白（Ca2 +-binding proteins）分為2 類，分別是Ca2+傳感蛋白和Ca2+受體蛋白[2]。其中，鈣依賴性蛋白激酶（Calciumdependent protein kinases，CDPKs）是植物細(xì)胞中最常見的一類Ca2+受體蛋白，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育、種子萌發(fā)、生物及非生物脅迫應(yīng)答、離子通道運(yùn)輸?shù)刃盘?hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起著重要作用[3-5]。

CDPK是一種廣泛存在于植物中具有特殊結(jié)構(gòu)特征的蛋白[6]，結(jié)構(gòu)主要由4 部分組成，包括N端可變結(jié)構(gòu)域（variable N-terminal domain）、Ser/Thr 激酶結(jié)構(gòu)域（Ser/Thr kinase domain）、自抑制連接結(jié)構(gòu)域（auto-inhibitory junction domain）和類鈣調(diào)素結(jié)構(gòu)域（Calmodulin-like domain）[7- 8]。其中，N 端可變區(qū)對(duì)其結(jié)合的底物有識(shí)別作用，結(jié)構(gòu)域長(zhǎng)度變化差異大，對(duì)CDPKs 的亞細(xì)胞定位有重要作用[9]。Ser/Thr 激酶區(qū)域具有高度保守的催化序列，在不同物種間具有較高的同源性[10]。自抑制域高度保守一般由20～30 個(gè)氨基酸組成，通過假底物機(jī)制調(diào)節(jié)CDPKs的激酶活性[11]。類鈣調(diào)素結(jié)構(gòu)域包含1～4 個(gè)EF-hands，用于與Ca2 +結(jié)合[12]。Ca2 +與EF-hands 結(jié)合可誘導(dǎo)CDPK構(gòu)象變化，從而導(dǎo)致激酶結(jié)構(gòu)域活性位點(diǎn)的折疊和暴露，激活CDPK使一系列底物磷酸化[13]。

CDPK 蛋白于1982 年首次在豌豆中被報(bào)道[14]，然而直到1991 年才在大豆中被克隆和鑒定[15]。CDPK在植物生長(zhǎng)發(fā)育以及生物和非生物脅迫方面均發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在擬南芥中AtCPK2、AtCPK11、AtCPK17、AtCPK20、AtCPK24、AtCPK34被報(bào)道廣泛參與花粉管的萌發(fā)[16- 17]；AtCPK1、AtCPK3、AtCPK4、AtCPK5、AtCPK6、AtCPK8、AtCPK10、AtCPK11、AtCPK12 和AtCPK21 參與環(huán)境對(duì)植物非生物脅迫[18- 21]；AtCPK28 調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育[22]。在水稻中，OsCPK7、OsCPK13、OsCPK17 和OsCPK24 被報(bào)道參與低溫脅迫[23- 25]；而OsCPK4、OsCPK9、Os-CPK12、OsCPK13 和OsCPK21 被研究發(fā)現(xiàn)參與干旱和鹽脅迫[26-28]。除生長(zhǎng)發(fā)育和非生物脅迫外，CDPK在生物脅迫中也發(fā)揮著廣泛作用。前人研究表明擬南芥CPK28 與質(zhì)膜相關(guān)的BIK1 相互作用并磷酸化，從而負(fù)調(diào)控植物PTI 免疫反應(yīng)[29]；擬南芥AtCPK5、AtCPK6 和AtCPK11 通過調(diào)控乙烯生物合成酶ACS 基因的表達(dá)控制乙烯的產(chǎn)生，來參與灰霉病感染免疫應(yīng)答[30]。馬鈴薯StCDPK4 及StCDPK5通過磷酸化NADPH氧化酶促進(jìn)ROS 產(chǎn)生，同時(shí)調(diào)控病原脅迫下相關(guān)基因的表達(dá)，從而激活防御機(jī)制[31]。在小麥中，TaCDPK2 迅速響應(yīng)小麥葉銹病的脅迫，在小麥抗葉銹病中發(fā)揮重要作用[32]。在番茄Cf-9 抗性蛋白轉(zhuǎn)基因煙草中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Cf-9 與枝孢霉Avr9 互作后激活了CDPK的表達(dá)，并作為抗原誘導(dǎo)反應(yīng)中重要的鈣傳感器發(fā)揮功能。將CDPK基因沉默后發(fā)現(xiàn)植物喪失Cf-Avr 誘導(dǎo)的特異性超敏反應(yīng)，表明CDPK 對(duì)于介導(dǎo)Cf-9/Avr9 誘導(dǎo)的植物防御體系不可或缺[33]。另外，玉米ZmCPK11 被報(bào)道參與機(jī)械損傷脅迫[34]。在煙草中，NaCDPK4 和NaCDPK5被報(bào)道參與機(jī)械損傷和食草動(dòng)物啃食脅迫[35]。

目前，CDPK 家族基因在多個(gè)物種中被克隆和鑒定。在擬南芥中被發(fā)現(xiàn)有34 個(gè)CDPK基因[36]；在水稻中被發(fā)現(xiàn)有31 個(gè)CDPK基因[37]；在玉米中被發(fā)現(xiàn)有40 個(gè)CDPK 基因[38]；在小麥中被發(fā)現(xiàn)有20 個(gè)CDPK 基因[32]；在大豆中被鑒定有39 個(gè)CDPK 基因[8]。CDPK基因的研究在荔枝中還未見報(bào)道。栽培荔枝品種妃子笑全基因組序列已被釋放[39]，這使得荔枝基因家族鑒定成為可能。中國是全球最大的荔枝生產(chǎn)國，同時(shí)荔枝在食品、醫(yī)藥和化妝品等方面起著重要作用[40]。然而，荔枝在生長(zhǎng)發(fā)育過程中，受到各種病害的影響。其中，荔枝霜疫病是危害荔枝的一種重要病害[41]。荔枝霜疫病是由荔枝霜疫霉菌（Peronophthora litchi）侵染荔枝所引起的，嚴(yán)重危害著荔枝的產(chǎn)量和品質(zhì)[42]。筆者針對(duì)荔枝霜疫病這一問題，結(jié)合CDPK在植物生長(zhǎng)以及抗病中的重要作用，對(duì)荔枝CDPK成員進(jìn)行了全基因組家族鑒定，并對(duì)其基因結(jié)構(gòu)、蛋白結(jié)構(gòu)、染色體定位，以及組織表達(dá)和在荔枝霜疫病脅迫條件的表達(dá)模式進(jìn)行分析，為進(jìn)一步研究荔枝CDPK功能提供參考。

1 材料和方法

1.1 植物材料及生長(zhǎng)條件

試驗(yàn)所用276 份荔枝種質(zhì)材料由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所提供。荔枝種質(zhì)資源種植于國家果樹種質(zhì)廣州荔枝資源圃。荔枝病原菌材料荔枝霜疫霉菌由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)提供。

1.2 LcCDPK基因家族的鑒定

所用的荔枝基因組序列均下載于荔枝基因組數(shù)據(jù)庫[39]。為鑒定荔枝CDPK基因家族成員，筆者在本研究中使用擬南芥數(shù)據(jù)庫TAIR（https：//www.arabidopsis.org/）下載AtCPK 氨基酸序列作為參考，比對(duì)荔枝基因組數(shù)據(jù)庫篩選得到候選基因。搜索到的候選基因利用InterProScan program（http：//www.ebi.ac.uk/interpro）進(jìn)行確認(rèn)蛋白激酶區(qū)域是否同時(shí)存在Protein kinase 結(jié)構(gòu)域和EF手性結(jié)構(gòu)。最后，所有確認(rèn)的蛋白序列利用Pfam（http：//pfam.sanger.ac.uk/search）和SMART（http：//smart.embl- heidelberg.de/）工具進(jìn)行重新評(píng)估。

1.3 LcCDPK序列及進(jìn)化分析

利用Clustal X2.1 對(duì)荔枝、擬南芥和水稻的CDPK氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對(duì)。使用MEME（http：//meme-suite.org/tools/meme）工具分析LcCDPK蛋白保守Motif；利用GSDS 2.0（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn）進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析；從荔枝基因組數(shù)據(jù)庫中分別提取CDPK基因上游2000 bp 的序列，利用PlantCARE （http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）分析啟動(dòng)子順式作用元件[43]。

最后，使用TBtools 對(duì)保守Motif、基因結(jié)構(gòu)、順式作用元件和染色體定位進(jìn)行可視化。利用PROSITE（https：//web.expasy.org/myristoylator/）網(wǎng)站預(yù)測(cè)LcCDPK 的N- myristoylation 位點(diǎn)；利用wolfpsort（https：//wolfpsort.hgc.jp）對(duì)荔枝CDPK 蛋白亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè)。在MEGA5.0 軟件中使用Neighborjoining構(gòu)建荔枝CDPK家族進(jìn)化樹，設(shè)置參數(shù)為：距離模型，Bootstrap法，重復(fù)1000 次[44]。

1.4 荔枝霜疫病處理方法

荔枝霜疫霉菌的培養(yǎng)和孢子懸浮液配置參考Xing 等[45]的方法。簡(jiǎn)要為荔枝霜疫霉菌培養(yǎng)于蘿卜瓊脂培養(yǎng)基（胡蘿卜200 g，瓊脂粉20 g，水1000 mL），培養(yǎng)溫度為27 ℃。荔枝霜疫霉菌孢子釋放于滅菌水中，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算并調(diào)整孢子懸浮液的濃度。

對(duì)于荔枝成熟果實(shí)的荔枝霜疫病的處理方法，筆者在參考Sun 等[41]的方法基礎(chǔ)上并稍作修改。簡(jiǎn)要方法為，在接種荔枝霜疫霉菌孢子前用無菌水清洗荔枝成熟果實(shí)3 次。后將每個(gè)荔枝果實(shí)用移液器接種5 μL荔枝霜疫霉菌孢子懸浮液（孢子個(gè)數(shù)為1×104個(gè)·mL-1）；接種后的果實(shí)轉(zhuǎn)移至保鮮盒中并放置恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為27 ℃，晝夜各12 h。3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10 粒荔枝果實(shí)。對(duì)于荔枝葉片的荔枝霜疫病的處理方法，筆者在參考Xing 等[45]的方法基礎(chǔ)上并稍作修改。具體為，采集荔枝新鮮葉片，平鋪于培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿中放入4 枚荔枝葉片，并加入10 mL無菌水，用移液器接種5 μL荔枝霜疫霉菌孢子懸浮液（孢子個(gè)數(shù)為1×104個(gè)·mL-1）；盛有葉片的培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移至恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為27 ℃，晝夜時(shí)間各12 h。3 次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10 枚荔枝葉片。

荔枝葉片和成熟果實(shí)病級(jí)參考Xing 等[45]的方法。病情指數(shù)（Disease index，DI）的計(jì)算參考Sun等[41]的方法。

RNA-Seq 以及RT-PCR所用的荔枝材料為裕榮1 號(hào)（YR1）。所用荔枝霜疫病的處理方法同前文一致。簡(jiǎn)要為分別用5 μL 荔枝霜疫霉菌孢子懸浮液（孢子個(gè)數(shù)為1×104個(gè)·mL-1）和5 μL滅菌水（對(duì)照組，Mock）接種荔枝新鮮葉片。接種后的材料轉(zhuǎn)移至恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同前文一致。在處理后的24 h 收集并液氮保存目標(biāo)材料，各材料3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)用于后續(xù)分析。

1.5 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

植物總RNA的提取使用Plant RNA Kit （R6827，Omega）試劑盒完成。使用Ultra RNA樣本制備試劑盒（Illumina）構(gòu)建RNA-seq 文庫。RNA測(cè)序由北京奧維森基因科技有限公司完成，雙端測(cè)序（Paired-End，Illumina HiSeq 4000）。計(jì)算RPKM作為基因的表達(dá)量，使用R語言heatmap函數(shù)進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化。

1.6 試驗(yàn)數(shù)據(jù)

本文中所用荔枝組織特異性表達(dá)原始數(shù)據(jù)來自SRA（NCBI Sequence Read Archive）數(shù)據(jù)庫，登錄號(hào)為PRJNA747875。共9 種組織：雌花子房（femaleflowers ovary）、根（root）、果皮（pericarp）、假種皮（aril）、胚（embryo）、外種皮（episperm）、雄花花藥（male flowers anther）、葉（leaf）和種子（seed）。

本文中荔枝霜疫霉菌處理荔枝葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)已經(jīng)上傳至GEO（NCBI Gene Expression Omnibusdatabase）數(shù)據(jù)庫，登錄號(hào)為GSE201243。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量分析

使用qRT-PCR 進(jìn)一步分析荔枝響應(yīng)荔枝霜疫霉菌脅迫下的候選基因。植物葉片提取試劑盒為Plant RNA Kit（R6827，Omega）。RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒為SYBR Green master mix（Vazyme，Cat# Q711-02）。使用LightCycler480 thermal cycler（Roche）進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。每個(gè)樣品3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。使用引物見表1。以荔枝Actin 基因?yàn)閮?nèi)參基因[41]。基因相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCt計(jì)算[46]。

2 結(jié)果與分析

2.1 LcCDPK基因家族成員鑒定及其系統(tǒng)發(fā)育分析

為了鑒定荔枝CDPK基因家族成員，筆者在本研究中使用擬南芥的CDPK氨基酸序列作為參考序列，然后在荔枝全基因組數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行搜索比對(duì)，共篩選到21 個(gè)候選基因。隨后，對(duì)候選基因進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)分析，以確定其具有Protein kinase 和EF-hand結(jié)構(gòu)域（圖1），最終得到19 個(gè)荔枝CDPK基因家族成員，將其命名為L(zhǎng)cCDPK1～LcCDPK19（表2）。19個(gè)LcCDPK 中，除LcCDPK13 外，其余基因的CDS為1491～2556 bp，編碼496～851 個(gè)氨基酸（表2），蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為55.65～95.41 ku，等電點(diǎn)為5.22～9.13（表2）。LcCDPK13 比較特殊，其CDS為4047 bp，編碼1348 個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為151.44 ku，等電點(diǎn)為8.70。利用Wolf psort 對(duì)LcCDPK 亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè)，如表2 所示，LcCDPK1 和LcCDPK4 定位在葉綠體中；LcCDPK3、LcCDPK6 和LcCDPK17定位在細(xì)胞核中；LcCDPK13 定位在質(zhì)膜中；其余定位在細(xì)胞質(zhì)中。CDPK 的N 末端含有N- myristoylation（豆蔻酰化位點(diǎn)），能促進(jìn)蛋白間的相互作用。此研究用https：//web.expasy.org/myristoylator/網(wǎng)站預(yù)測(cè)的19 個(gè)LcCDPK 基因中，有9 個(gè)在其N末端具有豆蔻酰化位點(diǎn)，而其余10 個(gè)不具有豆蔻酰化位點(diǎn)（表2）。

為更好地研究荔枝中CDPK家族進(jìn)化關(guān)系，筆者使用已知34 個(gè)擬南芥AtCPK 和31 個(gè)水稻OsCPK氨基酸序列，以及筆者在本研究中所鑒定到的19 個(gè)LcCDPK 氨基酸序列，共84 個(gè)CDPK序列進(jìn)行了進(jìn)化分析。如圖2 和圖4-A所示，19 個(gè)LcCDPK 可分為4 個(gè)亞家族，其中Ⅰ～ Ⅳ亞家族中分別含有6、5、4和4個(gè)LcCDPK基因。

2.2 LcCDPK染色體分布

基于LcCDPK基因的物理位置（表2），筆者對(duì)這19 個(gè)LcCDPK 基因在15 條染色體上進(jìn)行了定位（2n = 30，圖3）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，第11 號(hào)染色體包含最多的LcCDPK基因，第4、6、12 和14 號(hào)染色體沒有發(fā)現(xiàn)LcCDPK基因。多數(shù)LcCDPK位于染色體臂上。如圖3 所示，LcCDPK1 和LcCDPK2 被定位在Chr5 上；LcCDPK3、LcCDPK4 和LcCDPK5 被定位在Chr11上；LcCDPK6 被定位在Chr7 上；LcCDPK7 和LcCDPK8被定位在Chr8 上；LcCDPK9 被定位在Chr2 上；LcCDPK10 被定位在Chr1 上；LcCDPK11 和LcCDPK12被定位在Chr15 上；LcCDPK13 和LcCDPK14被定位在Chr10 上；LcCDPK15 和LcCDPK16 被定位在Chr13 上；LcCDPK17 和LcCDPK18 被定位在Chr3 上；LcCDPK19 被定位在Chr9 上。在擬南芥中34 個(gè)CDPK 基因分布于5 條染色體上[36]，在水稻中31 個(gè)CDPK基因分布于12 條染色體上[37]，表明CDPK基因在植物基因組中分布廣泛。

2.3 LcCDPK基因結(jié)構(gòu)和保守Motif分析

為了探索LcCDPK 基因結(jié)構(gòu)的保守性和多樣性，筆者對(duì)LcCDPK 基因進(jìn)行了結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)LcCDPK 分別含有7～19 個(gè)外顯子，以及6～18 個(gè)內(nèi)含子。如圖4-B 所示，LcCDPK 的第Ⅰ亞家族成員中均含有7 個(gè)外顯子和6 個(gè)內(nèi)含子，表明同一亞家族中的LcCDPK 基因具有高度保守的基因結(jié)構(gòu)。

與之相似的是第Ⅱ亞家族，除LcCDPK13 含有19個(gè)外顯子和18 個(gè)內(nèi)含子外，其余家族成員均含有8 個(gè)外顯子和7 個(gè)內(nèi)含子。相反，在第Ⅲ和第Ⅳ亞家族中呈現(xiàn)較大的基因結(jié)構(gòu)多樣性，這兩個(gè)家族中含有多個(gè)外顯子和內(nèi)含子，例如，在第Ⅲ亞家族中LcCDPK6 與LcCDPK10 含有8 個(gè)外顯子和7 個(gè)內(nèi)含子，LcCDPK14 僅含有7 個(gè)外顯子和6 個(gè)內(nèi)含子，LcCDPK16 含有13 個(gè)外顯子和12 個(gè)內(nèi)含子。

第Ⅳ亞族中，LcCDPK1 與LcCDPK4 含有11 個(gè)外顯子和10 個(gè)內(nèi)含子，LcCDPK3 含有12 個(gè)外顯子和11 個(gè)內(nèi)含子，LcCDPK17 含有7 個(gè)外顯子和6 個(gè)內(nèi)含子。

隨后使用LcCDPK 的氨基酸序列進(jìn)行了保守Motif 分析。一共鑒定出5 個(gè)保守的Motifs，Motif1～Motif5（圖4-C）。19 個(gè)LcCDPK 均包含這5 個(gè)Motif。值得注意的是，LcCDPK16 較為特殊，擁有兩組Motif1、Motif2 和Motif4。

2.4 LcCDPK順式作用元件分析

順式作用元件在植物生長(zhǎng)發(fā)育和抗逆境脅迫中均執(zhí)行著不同的功能。植物激素例如水楊酸（SA）、茉莉酸（JA）、乙烯（ET）和脫落酸（ABA）等通過誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子與其相應(yīng)的順式作用元件相互作用，在植物生長(zhǎng)和逆境脅迫中發(fā)揮著重要作用[47]。為了探索荔枝中LcCDPK 基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，筆者在本研究中利用Plant CARE 數(shù)據(jù)庫對(duì)LcCDPK基因家族成員起始密碼子上游2000 bp 啟動(dòng)子區(qū)域的潛在順式作用元件進(jìn)行了分析。如圖5 所示，8 個(gè)潛在的順式作用元件被鑒定，包含激素響應(yīng)相關(guān)順式作用元件（ABRE、CGTCA- motif 和TCA-element）、光響應(yīng)順式作用元件（AE-box 和Gbox）以及逆境脅迫順式作用元件（ARE、MBS 和TC-rich repeats）。LcCDPK18 啟動(dòng)子只包含兩個(gè)順式作用元件（TC- rich repeats 和AE- box），其余LcCDPK 家族成員均含有多個(gè)順式作用元件（圖5）。TC-rich repeats 是一種植物防衛(wèi)和脅迫的順式作用元件[48]，分析發(fā)現(xiàn)在LcCDPK2 和LcCDPK6 的啟動(dòng)子中均包含這一順式作用元件（圖5）。TCAelement是一種植物響應(yīng)水楊酸（SA）應(yīng)對(duì)植物病原脅迫的重要順式元件[49]，分析發(fā)現(xiàn)LcCDPK1、LcCDPK5、LcCDPK10、LcCDPK12、LcCDPK14、LcCDPK17 和LcCDPK19 這7 個(gè)基因的啟動(dòng)子中均包含這一順式作用元件。

2.5 LcCDPK組織特異性分析

CDPK 在植物不同發(fā)育階段均發(fā)揮著重要作用[9]。為了研究LcCDPK 基因在荔枝發(fā)育中的表達(dá)模式，筆者在本研究中利用RNA-Seq 數(shù)據(jù)對(duì)LcCDPK基因在9 個(gè)不同荔枝組織（根、葉、雄花花藥、雌花子房、胚、外種皮、假種皮、果皮和種子）中進(jìn)行了表達(dá)分析（圖6）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雖然19 個(gè)LcCDPK 基因在9 個(gè)組織中均有表達(dá)，但在不同組織中表達(dá)卻存在巨大差異。聚類分析發(fā)現(xiàn)，19 個(gè)LcCDPK分為3 組（圖6）。第Ⅰ 組包含8 個(gè)基因（LcCDPK16、LcCDPK7、LcCDPK4、LcCDPK19、LcCDPK5、LcCDPK9、LcCDPK6 和LcCDPK18），主要在根和葉組織中大量表達(dá)，而在假種皮中呈現(xiàn)低表達(dá)。第Ⅱ組包含9 個(gè)基因（LcCDPK14、LcCDPK17、LcCDPK1、LcCDPK8、LcCDPK11、LcCDPK12、LcCDPK10、LcCDPK15 和LcCDPK3），大部分基因在雄花花藥中大量表達(dá)。第Ⅲ組包含兩個(gè)基因（LcCDPK13 和LcCDPK2），在根、雌花子房和果皮中高表達(dá)，而雄花花藥中顯示低表達(dá)。歸納發(fā)現(xiàn)，LcCDPK16、LcCDPK7、LcCDPK4、LcCDPK9、LcCDPK6、LcCDPK18、LcCDPK14、LcCDPK17、LcCDPK11 和LcCD-PK13 在根中表現(xiàn)顯著的高表達(dá)，可能與植物根系生理有關(guān)；LcCDPK19、LcCDPK9、LcCDPK6 和LcCDPK3在葉中表現(xiàn)顯著高表達(dá)，可能與葉片中的營養(yǎng)、抗病等生理功能有關(guān)；LcCDPK1、LcCDPK11、LcCDPK12和LcCDPK10 在雄花花藥中表現(xiàn)顯著高表達(dá)，可能與生殖生理有關(guān)。

2.6 荔枝高抗霜疫病材料的鑒定

荔枝霜疫病，是由荔枝霜疫霉菌侵染荔枝所引起的、發(fā)生在荔枝上的一種最為嚴(yán)重的病害[41]。該病流行于荔枝的整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過程中，尤其在嫩葉、花期和果實(shí)成熟期，甚至在采后運(yùn)輸貯藏過程中也能發(fā)生嚴(yán)重的危害[50]。為探索LcCDPK家族成員在荔枝霜疫病脅迫下的表達(dá)模式，筆者在本研究中以276 份荔枝自然群體的葉片和成熟果實(shí)為材料篩選高抗霜疫病荔枝品種（表3）。其中2021 年使用荔枝葉片所鑒定的材料有256 份，病情指數(shù)最大值為100，最小值為2.22，平均值為68.28；2022 年使用葉片所鑒定的材料有242 份，病情指數(shù)最大值為100，最小值為2.59，平均值為68.47。使用荔枝成熟果實(shí)鑒定荔枝抗霜疫病材料只有2021 年的147 份材料，病情指數(shù)最大值為100，最小值為0，平均值為57.64（表3）。綜合分析荔枝葉片和成熟果實(shí)病情指數(shù)的條形圖和箱線圖（圖7），結(jié)果表明裕榮1 號(hào)（YR1）荔枝在荔枝葉片和成熟果實(shí)的病情指數(shù)均小于25，按照前人的荔枝抗病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[41]，裕榮1 號(hào)（YR1）是一種高抗荔枝霜疫病的荔枝品種。

2.7 荔枝霜疫病脅迫下的LcCDPK 家族成員表達(dá)分析

在篩選到的高抗荔枝霜疫病材料裕榮1 號(hào)（YR1）的基礎(chǔ)上，筆者利用RNA-Seq 分析了荔枝霜疫病脅迫下的LcCDPK 家族成員表達(dá)模式（圖8-A）。與對(duì)照相比較，LcCDPK17，LcCDPK19 和LcCDPK5 在荔枝霜疫病處理后顯著上調(diào)表達(dá)（圖8-A）；LcCDPK3 和LcCDPK8 在病處理下顯著下調(diào)表達(dá)（圖8-A）。為了進(jìn)一步檢驗(yàn)這一結(jié)果，挑選這5 個(gè)基因在荔枝霜疫病處理后分時(shí)間點(diǎn)取樣進(jìn)行qRTPCR驗(yàn)證（圖8-B～F）。與RNA-Seq 結(jié)果一致的是（圖8-B～F），在荔枝霜疫病脅迫后，LcCDPK19 在病原菌脅迫24 h 后達(dá)到最高點(diǎn)，表達(dá)量是Mock 處理的6 倍左右（圖8-F）；LcCDPK17 在病處理后16 h 達(dá)到最大值（圖8-E）；LcCDPK5 在病處理后24 h 達(dá)到最大值，表達(dá)量大約是Mock 處理的3.5 倍（圖8-E）。另外，LcCDPK3 和LcCDPK8 在病處理后迅速下調(diào)表達(dá)，均低于Mock處理（圖8-B，8-D）。這些結(jié)果表明這些基因可能在荔枝抗霜疫病過程中發(fā)揮重要作用。

3 討論

目前，CDPK基因家族成員已在眾多植物中被鑒定并被廣泛研究。在模式植物擬南芥中共有34個(gè)CDPK 基因被鑒定；在禾本科中，水稻中有31 個(gè)CDPKs[37]、小麥中有20 個(gè)CDPKs[32]、玉米中有40 個(gè)CDPKs[38]；在葫蘆科中，黃瓜中有19 個(gè)CDPKs[51]、甜瓜中有18 個(gè)CDPKs[52]；在水果中，柑橘基因組含有29 個(gè)CDPKs[53]、菠蘿有17 個(gè)CDPKs[54]。筆者利用生物信息學(xué)等方法，從荔枝中鑒定出19 個(gè)LcCDPK基因家族成員。荔枝妃子笑主要含15 條假染色體序列，基因組大小約470 Mb[39]。這說明CDPK基因家族成員數(shù)量與物種基因組大小沒有線性關(guān)系，推測(cè)可能是在荔枝進(jìn)化過程中，由于自然選擇的壓力，有些LcCDPK 基因功能喪失，逐漸演化消亡或演變成其他基因。

在植物中CDPK具有明顯的結(jié)構(gòu)特征。筆者在本研究中發(fā)現(xiàn)19 個(gè)LcCDPK 成員N端可變區(qū)的長(zhǎng)短不一；催化區(qū)蛋白激酶區(qū)域同源性較高，含有典型的Ser/Thr 蛋白激酶催化保守序列；調(diào)控區(qū)含有1～4個(gè)EF-hands 結(jié)構(gòu)。綜合前人研究進(jìn)展，推測(cè)CDPK基因可能來自于蛋白激酶和CaM基因的融合。然而，基因結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)LcCDPK 各成員的內(nèi)含子及外顯子數(shù)量差異比較大。這可能是LcCDPK基因家族成員在植物中承擔(dān)各種不同功能角色的重要原因。

CDPKs在植物的生長(zhǎng)發(fā)育及應(yīng)對(duì)生物、非生物脅迫中均發(fā)揮著重要的作用[55]。CDPKs 在不同組織中基因表達(dá)差異可能暗示著其功能的分化。在對(duì)荔枝9 個(gè)不同組織的表達(dá)模式分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，19 個(gè)LcCDPK 基因在9 個(gè)組織中均有表達(dá)，但在不同組織中表達(dá)情況卻存在巨大差異。第Ⅰ組成員主要在根和葉中大量表達(dá)，這暗示它們可能在根和葉中發(fā)揮重要作用。第Ⅱ組大部分基因在雄花花藥中大量表達(dá)，這些基因可能與雄花的發(fā)育有關(guān)。例如，牽牛花PnCDPK1 是花形態(tài)建成生殖生長(zhǎng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的重要組成部分，轉(zhuǎn)錄水平在葉芽轉(zhuǎn)變成花芽后迅速升高[56]。第Ⅲ組包含兩個(gè)成員（LcCDPK13 和LcCDPK2），在根、雌花子房和果皮中高表達(dá)。這兩個(gè)基因在不同組織中可能發(fā)揮不同的功能。

荔枝霜疫病是由荔枝霜疫霉菌侵染所引起的、發(fā)生在荔枝上的一種嚴(yán)重病害。為了探討LcCDPK對(duì)荔枝霜疫病的應(yīng)答，筆者在本研究中以276 份荔枝自然群體葉片和成熟果實(shí)為材料，篩選出荔枝高抗品種裕榮1 號(hào)（YR1）。基因表達(dá)數(shù)據(jù)表明，LcCDPK17、LcCDPK19 和LcCDPK5 在荔枝霜疫病處理后顯著上調(diào)表達(dá)。順式作用分析表明，LcCDPK17 和LcCDPK19 啟動(dòng)子區(qū)域分別包含兩個(gè)TCA-element；LcCDPK5 啟動(dòng)子區(qū)域包含一個(gè)TCA-element。前人研究表明TCA-element 是一種植物響應(yīng)水楊酸（SA）應(yīng)對(duì)植物病原脅迫的重要順式作用元件[49]。這3 個(gè)基因可能參與荔枝SA 通路響應(yīng)病原微生物的脅迫。TC-rich repeats 是一種參與植物防衛(wèi)和脅迫的順式作用元件[48]。基因表達(dá)分析表明，LcCDPK8 在荔枝霜疫病處理下顯著下調(diào)表達(dá)。順式作用元件分析表明，LcCDPK8 啟動(dòng)子區(qū)域包含3 個(gè)TC-rich repeats，這表明LcCDPK8 可能負(fù)調(diào)控植物病原微生物脅迫。

筆者在全基因組水平對(duì)荔枝CDPK家族基因進(jìn)行了鑒定和詳細(xì)的生物信息學(xué)分析。另外，在篩選到高抗霜疫病品種裕榮1 號(hào)（YR1）的基礎(chǔ)上，對(duì)荔枝CDPK 家族成員進(jìn)行了荔枝霜疫病脅迫相關(guān)研究，為進(jìn)一步研究荔枝CDPK基因家族功能提供了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

從荔枝基因組中共鑒定出19 個(gè)LcCDPK 基因家族成員，分為4 個(gè)亞家族，分布于11 條染色體上。在276 份荔枝自然群體中鑒定出一份高抗霜疫病荔枝材料裕榮1 號(hào)。荔枝霜疫病脅迫表達(dá)分析表明LcCDPK5、LcCDPK17、LcCDPK19、LcCDPK3 和LcCDPK8 可能在荔枝抗病過程中發(fā)揮著重要作用。

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