梨花藥愈傷組織誘導和懸浮培養體系的建立及應用

莊夢弟 李濤 辛騫祎 周夢瑤 張海霞 馬輝 錢稷 張玉星 亓寶秀 許建鋒

摘要：【目的】建立梨懸浮細胞體系，并利用懸浮細胞體系獲得高質量懸浮細胞，進行遺傳轉化和原生質體的分離。【方法】以新梨7 號花藥為試材，誘導獲得梨花藥愈傷組織，研究了細胞懸浮系建立和影響懸浮細胞增殖的主要因子。【結果】花藥在1/2 MS + 1.0 mg·L-1 2，4-D + 0.4 mg·L-1 NAA + 30 g·L-1蔗糖+ 7 g·L-1瓊脂（pH值為5.8～6.0）培養基上誘導的愈傷組織，經4～5 次繼代得到了黃白色、顆粒狀，狀態相對較好的愈傷組織；將愈傷組織接種于液體培養基中，于28 ℃，200 r·min-1的黑暗條件下懸浮振蕩培養，經4～5次懸浮繼代培養建立了懸浮細胞系，適宜的啟動和增殖培養基為：MS + 1.5 mg·L-1 2，4-D + 1.0 mg·L-1 6-BA + 30 g·L-1蔗糖，細胞生長曲線呈“S”型，活細胞率達81.98%，近圓細胞率達83.66%，可作為遺傳轉化的受體，轉化率為20.00%。也可直接用于原生質體的分離，原生質體產量達3.67×106 個·mL-1，活力可達92.00%。【結論】建立了梨懸浮細胞培養體系，利用所建體系獲得了高質量的懸浮細胞，可直接用于遺傳轉化和原生質體的分離。

關鍵詞：梨；愈傷組織；細胞懸浮培養；生長曲線

中圖分類號：S661.2 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980（2023）03-0577-11

梨是薔薇科（Rosaceae）梨屬（Pyrus）植物，是中國三大果樹之一，在農村區域經濟發展、農民脫貧致富、鄉村振興等方面起了重要作用[1]。

梨自花結實率低，生長周期長、影響因素復雜多樣，基因組高度雜合[2]。這些特性給梨遺傳轉化和品種改良帶來嚴重障礙。花藥培養是由花粉小孢子產生單倍體植株的一種重要途徑，可以有效地縮短育種年限，加快新品種選育進程，其在遺傳育種中的意義重大。因此，非常有必要開展梨花藥培養的研究。花藥培養是利用植物組織培養技術，將發育到特定階段的花藥取出轉移到培養基中生長，從而改變花藥內部的生理狀態，使其在離體條件下分化成胚狀體或形成無分化的愈傷組織。目前，國內外關于梨樹花藥離體培養的研究比較少。1975 年，Jordan[3]在西洋梨花藥培養上獲得小原胚；1978 年，山東農學院梨花藥培養誘導出愈傷組織[4]；1996 年，薛光榮等[5]在錦豐梨的花藥培養上誘導出胚狀體，但誘導率不穩定。

花藥的細胞全能性較高，由其誘導出來的愈傷組織具有較強的分裂和分化能力；以花藥愈傷組織為材料進行植物懸浮培養的細胞，具有材料均一、重復性好、條件易于控制、培養周期短等優點[6]。植物懸浮細胞是遺傳轉化的理想受體之一，用懸浮細胞作為轉化受體可提高轉化率，因此，穩定的懸浮細胞系對遺傳轉化起到了巨大的促進作用。懸浮細胞培養是指在離體的條件下，將愈傷組織或者其他易于分散的組織置于液體培養基中，通過振蕩的方式得到分散的細胞或小細胞團，使其保持良好的生長狀態且可以不斷增殖的技術。1958 年，美國的Steward等[7]建立了胡蘿卜的懸浮體系，隨后懸浮細胞培養技術被廣泛應用于草本植物。對木本植物細胞懸浮培養的研究起步較晚，1975 年，Wilson 等[8]建立了橡膠懸浮體系。1991 年，王影等[9]建立了小葉楊的懸浮細胞體系。此后，經過20 多年的發展，中國在木本植物的研究中也取得了一系列的進展，如荔枝、葡萄、花椒樹等也建立了細胞懸浮培養體系，但關于梨細胞懸浮培養方面未見報道[10-13]。

筆者在本研究中以新梨7 號花藥為試材，對花藥愈傷組織的獲得、增殖及懸浮培養等條件進行了研究，以期獲得高質量的梨細胞懸浮系，懸浮培養獲得的小細胞團和單細胞可以直接用于原生質體的分離，也可以作為遺傳轉化的直接受體，為梨大規模細胞培養以及遺傳轉化奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

以河北農業大學標本園栽植的新梨7 號花藥為試材。

1.2 試驗方法

1.2.1 愈傷組織的誘導及繼代 選取處于“緊湊期”（花蕾橫徑為2.7～3.0 mm，縱徑為8.0～8.5 mm）的花蕾，將花蕾表面用清水沖洗3～5 次洗去灰塵，然后在無菌工作臺上按照先75%乙醇浸泡25 s，再用0.1%HgCl2消毒8 min，最后用無菌水沖洗3～4 次。剝開花蕾取出花藥，將獲得的無菌花藥接種于1/2 MS +1.0 mg·L-1 2，4-D + 0.4 mg·L-1 NAA + 30 g·L-1蔗糖+7 g·L-1瓊脂（pH 值5.8～6.0）培養基中，（24±1）℃暗培養30 d。

選取黃白色、較松散且活性較高的愈傷組織，接種于6-BA（0.5、1.0、1.5 mg · L- 1）與2，4-D（1.0、1.5、2.0 mg·L- 1）的激素配比組合（基礎培養基為MS +30 g·L-1蔗糖+ 7 g·L-1瓊脂）中進行繼代增殖培養，完全隨機組合，共9 個處理。每個處理3 次重復。培養條件與誘導培養條件相同。

1.2.2 懸浮細胞系的初代培養 細胞懸浮無菌培養基以MS + 30 g·L-1蔗糖為基本培養基，添加不同質量濃度的生長調節劑2，4-D、6-BA（表1），以不添加生長調節劑的為對照，pH值5.8～6.0。

將分散性好、疏松的愈傷組織，用鑷子夾碎將其轉移到裝有40 mL液體培養基的三角瓶中進行懸浮振蕩培養。28 ℃，暗培養，培養周期為8 d，接種量為1.5 g，搖床轉速為200 r ·min-1，進行啟動培養，每個處理3 次重復。

1.2.3 懸浮細胞增殖培養 取出裝有懸浮物質的三角瓶，靜置15～20 min，倒掉2/3 的液體培養基，然后加入與倒掉液體相同體積的新鮮培養基并用無菌玻璃棒將里面的大塊愈傷組織壓碎。以后每隔7 d 繼代1 次，21 d 后用150 μm的細胞篩過濾，獲得的細小均勻的懸浮物質繼續懸浮培養，得到顆粒分散、穩定性好的懸浮細胞系。全過程無菌操作，培養條件同1.2.2。

1.2.4 懸浮細胞生長量的測定 自穩定懸浮系被繼代的當天起，每隔1 d 取懸浮細胞進行細胞生長量測定。每隔1 d 取2 mL懸浮物質，離心稱質量，即為鮮質量。60 ℃下烘干12 h 后稱質量，即為干質量。

取懸浮液2 mL， 放入2 mL 刻度的離心管中，4500 r · min-1 下離心5 min，得到的細胞體積即為細胞密實體積（PCV）。每個處理3 次重復。

1.2.5 懸浮細胞死亡率的測定 選取生長穩定的懸浮細胞，每隔1 d 取1 mL 進行懸浮細胞死亡率測定。用0.4%的臺盼藍染色3 min， 蒸餾水洗滌3 次，于20倍顯微鏡下觀察其死亡個數，統計死亡率。

1.3 懸浮細胞的轉化

將經懸浮培養后獲得的活力較強的愈傷組織材料進行轉化，浸染流程參照王林蘋果愈傷浸染方法并對浸染液濃度、浸染時間等稍作修改[14]。具體流程為將活化好含有pROK2-GFP 質粒的GV3101 農桿菌液離心重懸，重懸后的浸染液（OD600為0.5）與愈傷組織置于28 ℃恒溫搖床（100 r·min-1）在黑暗條件培養浸染15 min；將浸染后的愈傷吸干水分后置于共生培養基（MS + 1.5 mg·L-1 2，4-D + 1.0 mg·L-16-BA），黑暗條件下共培養3 d，然后將其接種到篩選培養基（MS +1.5 mg·L- 1 2，4-D + 1.0 mg·L- 1 6-BA +20 mg·L- 1 Basta + 300 mg·L- 1 Cef + 200 mg·L- 1 Timentin），黑暗條件下培養20 d。用手持熒光蛋白觀測燈（LUYOR-3415 RG Hand-Held Lamp，路陽，美國）拍照，計算轉化率。

1.4 原生質體的分離及產量、活力測定

生長穩定懸浮細胞系，取其第4 天時懸浮細胞為材料，6000 r ·min-1離心5 min。酶解液成分為：纖維素酶（1.0%）、離析酶（0.5%）、1 mL MES pH 5.7（20 mmol · L- 1）、5 mL 甘露醇（0.5 mol · L- 1）、2.5 mLKCl（20 mmol·L-1）、無菌水定容到10 mL。55 ℃水浴10 min，冷卻至室溫25 ℃，加10 mmol·L- 1 CaCl2，0.1%牛血清蛋白（BSA）用0.45 μm的濾頭過濾。25 ℃黑暗條件下30 r·min-1恒溫振蕩12 h。將酶解后的材料進行純化，加入W5 solution[其成分為2 mmol?L-1MES（pH 5.7）+ 154 mmol?L- 1 NaCl+125 mmol?L- 1CaCl2 + 5 mmol?L-1 KCl]，120 r·min-1離心4 min，離心3次。

用血球計數板統計原生質體的產量。檢測活力采用FDA染色法：FDA溶于丙酮，用蔗糖稀釋，4 ℃保存。使用時取1 滴母液與1 滴原生質體懸浮液混合到一起，室溫下靜置5～10 min后熒光下觀察。

1.5 數據處理與分析

采用Excel 2013 和SPSS 24 進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 愈傷組織的獲得及增殖培養

接種10 d 后，開始從花藥中部慢慢長出愈傷組織，沒有長出愈傷組織的花藥慢慢褐化死亡。

花藥接種30 d 后形成的愈傷組織塊，一部分愈傷組織微褐化，呈柔軟水漬狀為濕軟型愈傷；一部分愈傷為黃白色，結構緊密，含水量少，此類愈傷經過4 個月的繼代培養后即可獲得表面有顆粒狀突起結構疏松的愈傷組織，可用來作為懸浮培養的材料。

新梨7 號花蕾（圖1-A）在“緊湊期”愈傷誘導率達45.80%，此時期的花藥（圖1-B）顏色為粉白色，花藥難以剝離。在6-BA質量濃度一定時，隨著2，4-D質量濃度的增加，結構由緊湊型（圖1-C）向疏松型（圖1-D）轉變，愈傷組織狀態相對較好，增殖較多；反之，在2，4-D質量濃度一定時，隨著6-BA質量濃度的增加愈傷組織狀態相對較差，質地堅硬增殖較少或基本不增殖（表2）。最終在MS + 1.5 mg·L-1 2，4-D +1.0 mg·L-1 6-BA的激素質量濃度配比下經過4～5 次的繼代即可得到生長旺盛且活性強的疏松愈傷，可用來進行懸浮培養。

2.2 激素對梨愈傷懸浮細胞生長的影響

不同質量濃度的2，4-D 與6-BA 的組合對梨懸浮細胞狀態存在較大影響（表3）。在2，4-D質量濃度為1.0～1.5 mg·L-1時，隨著6-BA質量濃度的提高活細胞率及近圓細胞率數值均有所升高，懸浮液狀態也達到好的狀態；而在2，4-D質量濃度為2.0 mg·L-1時，隨著6-BA質量濃度的提高其圓細胞及活細胞率數值均有所下降，但兩者均顯著高于對照（圖2-B～C）。在2，4-D 質量濃度為1.5 mg · L- 1，6-BA 為1.0 mg·L-1時，細胞活細胞（圖2-F）率達到81.98%，近圓細胞（圖2-E）率達到83.66%，此時懸浮液狀態也達到最好（圖2-D）。綜上所述，L6培養基為最適合梨懸浮細胞培養的培養基。

2.3 懸浮細胞系的建立及細胞學觀察

將上述經繼代培養得到的疏松愈傷組織，轉接到液體培養基中進行懸浮培養。愈傷組織在懸浮培養1 周后出現長形細胞（圖3-D），細胞多為空的且活力不高，在以后的繼代過程中逐步淘汰。2～3 周散出來的既有長形細胞又有圓形小細胞團（圖3-E），但長細胞占比相對較大。4 周后長形細胞消失，多為圓形小細胞團，單細胞少量存在。最終建立起來的細胞懸浮系（圖3-F）基本沒有長形細胞，都是由單細胞和小細胞團組成，也會時常出現多細胞聚集現象，大多數細胞呈圓球形且含有豐富的內含物質（圖3-C）。故在前三次繼代時，應待懸浮系沉淀后倒去上層2/3 的培養液，去除死細胞和空細胞。

2.4 懸浮細胞系生長曲線和死亡率的測定

由圖4 可知，梨懸浮細胞生長量呈“S”型生長曲線，0～2 d 懸浮物質生長量小為遲滯期，細胞死亡率維持在13.97%～22.50%；2～4 d 以后細胞體積、鮮質量、干質量明顯增加即為進入對數期，是細胞增殖、生長發育最明顯的時期，該時期的細胞死亡率最低，為13.97%～15.40%；4～6 d 細胞生長較平穩，生長速度逐漸降低，此時鮮質量為0.22 g，干質量為0.05 g，均達到最大值進入了靜止期，這一時期的細胞死亡率為15.40%～19.14%；6 d 以后開始進入衰亡期，細胞鮮質量、密實體積逐漸趨于下降趨勢，此時則認為是懸浮培養物質進入了衰亡期，細胞死亡率為19.14%～19.18%；同時觀察到厚厚一層的衰敗細胞堆集在瓶壁上，不利于懸浮細胞系的生長。在0～8 d的繼代周期內，以花藥為外植體獲得的愈傷組織細胞懸浮系存活率均超過77.50%，細胞的死亡率均維持在22.5%以下（圖4），說明懸浮細胞的活性較強，絕大數細胞的生長狀態良好。

綜上，細胞懸浮系生長曲線、懸浮細胞死亡率之間存在著一定的對應關系，建立了梨懸浮細胞系，并且確定了2～4 d 內的懸浮細胞生長狀態最好，活力最高，這一時期的細胞分裂速度很快。因此，可以選擇此時期的懸浮液來開展后續工作。

2.5 懸浮細胞系生長情況

將經懸浮培養后的愈傷組織接種于固體培養基中，得到了活性很強的愈傷組織，分裂速度快，狀態良好，一般15～20 d 即可達到試驗所需生長量；而未經懸浮培養的愈傷組織15～20 d 才進入快速生長期（圖5）。光培養或暗培養1 個月后，愈傷組織的狀態基本相同，光培養下顏色稍微偏深乳黃色一點并且經懸浮培養的愈傷組織繼代后分裂速度也比未經懸浮培養的愈傷組織分裂速度快，顏色差異也較明顯（圖6）。經懸浮培養得到的愈傷組織呈乳黃色（圖6-C），活力以及分裂能力均較強；而未經懸浮培養的愈傷組織呈黃白色（圖6-D），生長量和活性均不如經懸浮培養的愈傷組織（圖5）。

2.6 梨懸浮細胞系的轉化

利用農桿菌介導法將35S：：GFP 植物表達載體轉化至經懸浮培養的梨愈傷組織。熒光觀察結果表明，愈傷組織呈現綠色（圖7），表明35S：：GFP 已轉化至其中，轉化率為20.00%。

2.7 原生質體產量及活力鑒定

用1%的纖維素酶+0.5%離析酶組合提取的原生質體（圖8-A）產量達到3.67×106個·mL-1，用FDA染色（圖8-B）進行活力鑒定，原生質體活力為92.00%。

3 討論

懸浮細胞懸浮液狀態、活細胞率及近圓細胞率、懸浮細胞生長量以及后期生長情況是確定懸浮細胞生長是否正常和懸浮培養體系是否建立成功的重要指標[15]。筆者在本文中研究了不同質量濃度激素對梨愈傷組織繼代培養的影響，并通過對梨懸浮培養條件的研究，建立了懸浮細胞培養體系，結果表明除要選擇疏松狀態的愈傷組織為材料進行培養外，還要考慮到培養基的滲透壓、激素種類及質量濃度，以及合適的轉速、繼代周期及繼代比例等，才能最終得到一個好的懸浮細胞系。

前人研究表明，適宜的培養基激素種類及配比是愈傷組織以及細胞懸浮系快速增殖的關鍵因素[16-17]。本研究結果表明，2，4-D質量濃度對愈傷的誘導與增殖起著關鍵作用，增殖量隨2，4-D質量濃度升高而升高[18-20]，這與前人研究結果一致。李艷敏等[21]將2，4-D與NAA、KT 組合使用，作為芍藥花藥愈傷組織培養基。在適宜的增殖質量濃度下，經過4～5 次繼代后即可得到表面有顆粒狀突起結構的疏松愈傷，與前人研究結果一致。2，4-D和6-BA搭配為細胞懸浮培養的最佳組合，因此本試驗采用MS + 1.5 mg·L-1 2，4-D + 1.0 mg·L-1 6-BA建立了懸浮細胞體系。還有其他文獻研究表明在懸浮細胞的長期繼代培養過程中添加KT（細胞分裂素），KT以一個較低質量濃度，一般選擇為0.1 mol·L-1為宜，較高質量濃度會造成褐化現象[22]。

在整個懸浮培養的過程中植物懸浮細胞開始培養時的接種量以及繼代周期、新舊培養基比例等是重要的影響因子，對于不同發育時期生長周期的長短及細胞生長增殖周期有顯著影響。張正雪等[23]認為起始接種量為3 g時生長速率可達到最高，本研究起始接種量為1.5 g，究其原因可能是因為不同植物所需要的最低臨界生長密度不同。其新舊培養基比例為2∶1，梨懸浮細胞的生長曲線呈“S”型[24]，與前人研究一致。0～2 d為遲滯期，2～4 d為對數期，4～6 d為靜止期。在一個繼代周期內，細胞的死亡率維持在23%以下，表明懸浮細胞狀態良好，活性很強。王磊等[25]研究表明接種15 d 是懸浮細胞繼代培養的較佳時期。本文適宜繼代周期為7 d，與前人研究不同，這可能是因為梨愈傷組織在適宜的懸浮培養條件下分裂能力較強，導致液體培養基中的營養成分被過早的消耗殆盡，從而縮短了繼代周期。2～4 d 內的細胞分裂最快，可以以此階段的細胞來開展各項研究。

細胞壁的化學成分和結構因品種不同而不同，所以不同外植體的最佳酶液組合和濃度也不同。張寧等[26]研究表明如果酶液濃度過高，會導致原生質體中毒和破裂；反之，如果濃度過低，會導致原生質體成團。杜小云等[27]用1%纖維素酶+0.5%離析酶+0.01%半纖維素酶組合，得到草莓懸浮系原生質體；本文懸浮細胞酶液組合為1%纖維素酶+0.5%離析酶。

經懸浮培養后的愈傷組織增殖快，活力強是良好的遺傳轉化的受體，但受品種、染液濃度和時間的影響，愈傷組織轉化率較低。李亞梅等[28]表明在浸染液濃度OD600為0.6～0.8 和浸染時間30 min 時，酸棗愈傷組織轉化效率超過20%。本文中，以OD600為0.5，浸染時間15 min 為最好，浸染30 min 的愈傷組織會在后期培養過程中被菌吞沒，造成褐化死亡。

4 結論

本研究以無菌的新梨7 號花藥為外植體誘導愈傷組織，將其接種到1/2 MS+1.0 mg· L-1 2，4-D+0.4 mg·L-1 NAA+30 g ·L-1蔗糖+7 g ·L-1瓊脂的固體培養基上即可誘導出愈傷組織。將得到的疏松愈傷組織接種到MS+1.5 mg·L-1 2，4-D+1.0 mg·L-1 6-BA+30 g ·L- 1 蔗糖的液體培養基中，在（26±1）℃，200 r ·min-1的黑暗條件下懸浮振蕩培養，每隔7 d 繼代1 次，新舊培養基比例2∶1，經30 d 后獲得了良好的懸浮細胞系，懸浮液的顏色澄清透明，分散性及均一性好，生長分裂速度快，活細胞率可達81.98%，近圓細胞率達83.66%；用懸浮細胞系提取的原生質體產量達3.67×106個·mL-1，活力可達92.00%，愈傷組織轉化率達20.00%。本研究結果為建立一套穩定優良的梨細胞懸浮培養體系提供了理論依據及數據支撐。

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