菊苣酸調控TLR9/NF-κB通路改善膿毒癥小鼠腸損傷研究

盛雙雙，孫紹欣，馮 帥，李 峰，王 歡，李 健*

菊苣酸調控TLR9/NF-κB通路改善膿毒癥小鼠腸損傷研究

盛雙雙1，孫紹欣1，馮 帥1，李 峰1，王 歡2，李 健2*

1. 山東中醫(yī)藥大學藥學院，山東 濟南 250355 2. 山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院 藥學部，山東 濟南 250014

研究菊苣酸對膿毒癥小鼠腸損傷的影響及作用機制。60只雄性C57小鼠隨機分為對照組、模型組、地塞米松（5 mg/kg）組和菊苣酸高、中、低劑量（40、20、10 mg/kg）組，每組10只。各給藥組ip相應藥物3 d后，采用盲腸結扎穿孔手術（cecal ligation and puncture，CLP）誘導建立膿毒癥小鼠模型。造模成功后連續(xù)給藥48 h，采用蘇木素-伊紅（HE）染色觀察小鼠腸組織病理變化；采用ELISA法測定腸組織中腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和IL-1β水平；取對照組、模型組和菊苣酸中劑量組的腸組織樣本，基于Illumina測序平臺進行轉錄組學分析；采用Western blotting檢測腸組織Toll樣受體9（Toll-like receptor 9，TLR9）、髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）、核因子-κB p65（nuclear factor-κB p65，NF-κB p65）、p-NF-κB p65和干擾素調節(jié)因子7（interferon regulatory factor 7，IRF7）蛋白表達。與模型組比較，各給藥組腸黏膜損傷程度明顯改善，腸組織炎癥因子水平均顯著降低（＜0.05、0.01）。轉錄組學分析顯示，與對照組比較，模型組共分析出1140個差異表達基因；與模型組比較，給藥組共分析出497個差異表達基因，差異基因均富集于NF-κB信號通路。與模型組比較，菊苣酸給藥后腸組織TLR9、MyD88、p-NF-κB p65和IRF7蛋白表達水平均顯著降低（＜0.05、0.01）。菊苣酸可通過TLR9/NF-κB信號通路改善膿毒癥誘導的腸黏膜損傷。

菊苣酸；膿毒癥；腸損傷；炎癥因子；轉錄組學；Toll樣受體9/核因子-κB信號通路

膿毒癥是指人體對感染反應失調激發(fā)的全身炎癥反應綜合征，伴隨免疫功能失調和器官功能障礙，屬于重癥疾病[1-2]。研究表明，膿毒癥發(fā)生時，過度炎癥損害腸上皮細胞，導致腸上皮細胞凋亡增多，進而發(fā)生腸道黏膜屏障損傷，引發(fā)腸道中的微生物及其產(chǎn)物從腸道進入血液，促進細菌遷移和毒素傳播，進一步會激發(fā)宿主的炎癥反應，導致多器官衰竭和危及生命的臨床癥狀[3-4]。因此，迫切需要尋找能夠改善腸道損傷的安全、有效的天然藥物。

菊苣酸從菊科植物紫錐菊(Linn.) Moench中分離得到，是一種主要存在于菊科植物中的咖啡酸衍生物。研究證明，菊苣酸具有抗炎、抗氧化、抗菌、增強免疫等多種藥理活性[5-7]，可以抑制HIV病毒[8]；逆轉減輕高脂小鼠肝臟的炎癥細胞浸潤水平[9]；通過絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路來抑制腦缺血再灌注損傷大鼠的炎癥反應，起到保護作用[10]；通過磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）通路減輕帕金森模型小鼠的腸道炎癥[11]。然而，目前關于菊苣酸對膿毒癥致腸損傷調節(jié)作用及機制方面的研究較缺乏，本研究從菊苣酸對盲腸結扎穿孔手術（cecal ligation and puncture，CLP）誘導的膿毒癥小鼠腸損傷的保護作用方面進行重點研究，并采用轉錄組學分析探索菊苣酸發(fā)揮作用的分子生物學機制，為膿毒癥的腸損傷治療提供潛在藥物。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性C57小鼠，體質量18～22 g，7周齡，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，動物合格證號SCXK（魯）20190003。動物飼養(yǎng)于SPF級動物房，室溫（24±2）℃，模擬12 h晝夜交替的環(huán)境，自由飲用水以及商業(yè)級動物飼料。動物實驗通過山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院倫理委員會批準（批準號AWE-2023-084）。

1.2 藥品與試劑

菊苣酸（批號B20647，質量分數(shù)≥98%）購自上海源葉生物科技有限公司；地塞米松（批號D829854）購自上海麥克林生化科技有限公司；多聚甲醛固定液（批號G1101）、蘇木素-伊紅（HE）染液套裝（批號G1003）購自武漢賽維爾生物科技有限公司；核因子-κB p65（nuclear factor-κB p65，NF-κB p65）抗體（批號10745-1-AP）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（批號10494）購自美國Proteintech公司；髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）抗體（批號A0980）購自武漢愛博泰克生物科技有限公司；p-NF-κB p65抗體（批號AF2006）、Toll樣受體9（Toll-like receptor 9，TLR9）抗體（批號DF2970）購自江蘇親科生物研究中心有限公司；干擾素調節(jié)因子7（interferon regulatory factor 7，IRF7）抗體（批號ET1610-89）購自杭州華安生物技術有限公司；山羊抗兔IgG抗體（批號7074）購自美國CST公司；Marker（批號26616）購自美國Thermo Fisher Scientific公司；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6 ELISA試劑盒（批號分別為EK282、EK201B、EK206）購自杭州聯(lián)科生物技術股份有限公司。

1.3 儀器

TGL-16M型醫(yī)用離心機（湘儀離心機儀器有限公司）；Eclipse E100型正置光學顯微鏡、DS-U3型成像系統(tǒng)（日本Nikon公司）；Imark-22353型酶標儀、PowerPac Basic電泳儀（美國Bio-Rad公司）；4800型凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）；TS-2型搖床（其林貝爾儀器制造有限公司）。

2 方法

2.1 分組及給藥

60只小鼠適應性喂養(yǎng)1周后，隨機分為對照組、模型組、地塞米松（5 mg/kg）組和菊苣酸高、中、低劑量（40、20、10 mg/kg）組，每組10只。對照組和模型組ip生理鹽水，各給藥組ip相應藥物3 d后，采用CLP誘導建立膿毒癥小鼠模型。

2.2 造模與標本采集

小鼠CLP造模前12 h禁食[12]，ip 0.3%戊巴比妥鈉（10 mL/kg）麻醉后固定，常規(guī)備皮消毒，沿腹白線做1個長約1 cm的切口，用無齒鑷在右下側尋找盲腸，將其輕柔拉出（注意盡量只牽拉盲腸），用無菌的尼龍縫線結扎在盲腸1/2處，在盲腸的底端，盡量避開系膜血管，以22 G無菌注射器針頭做穿刺，擠出少許糞便后推回腹腔，用濕潤的4-0縫線依次縫合各層組織2～3針。對照組小鼠僅做開腹操作，不做結扎和穿孔。術后保證小鼠飲食和飲水供應。觀察小鼠術后狀況，當小鼠出現(xiàn)精神萎靡、豎毛、寒戰(zhàn)、眼瞼低垂且有白色分泌物、活動減少等癥狀時代表膿毒癥模型造模成功[13]。

造模成功后，各組小鼠繼續(xù)每天ip等體積的生理鹽水或藥物，48 h后取材。麻醉法安樂死小鼠，打開腹腔，取距離回盲瓣3 cm的回腸組織2 cm，用4 ℃生理鹽水沖洗干凈后，再置于多聚甲醛溶液中，用于HE染色檢測。取剩余回腸組織8 cm于干凈的EP試管中，?80 ℃凍存，用于后續(xù)實驗中蛋白和炎癥因子的檢測。

2.3 腸組織病理觀察

各組小鼠腸組織采用4%多聚甲醛溶液常溫固定，修剪成塊，樣品脫水，浸蠟包埋，切片貼片，染色封片，于光學顯微鏡下觀察腸組織病理變化。

2.4 ELISA法檢測腸組織中TNF-α、IL-6和IL-1β水平

取各組小鼠腸組織約20 mg，充分勻漿，離心，吸取上清液，按照ELISA試劑盒說明書測定腸組織中TNF-α、IL-6和IL-1β水平。

2.5 轉錄組測序

分別隨機選取對照組、模型組、菊苣酸中劑量組3只小鼠的腸組織作為樣本，液氮凍存，委托北京諾禾致源科技有限公司進行高通量轉錄組測序。

從樣本中提取RNA，篩選mRNA，按照NEB普通建庫方式或鏈特異性建庫方式建庫后，使用Qubit 2.0熒光計初步定量并稀釋文庫，隨后使用Agilent 2100型生物分析儀對文庫的插入片段長度進行檢測，插入片段長度符合預期后，以qRT-PCR對文庫有效濃度進行準確定量以保證文庫質量。庫檢合格后，利用Illumina測序平臺獲得測序數(shù)據(jù)，使用HISAT2（v2.0.5）軟件將測序數(shù)據(jù)過濾后的潔凈讀段與參照基因組比對。根據(jù)比對后的reads數(shù)目，通過Subread軟件中的FeatureCounts工具進行基因表達定量分析。采用具有生物學重復性的DEseq2方法，以篩選閾值＜0.05且|log2(FoldChange)|≥1的標準對基因表達差異進行顯著性分析。根據(jù)差異分析結果，采用ClusterProfiler軟件落實候選基因集的基因功能，進行基因本體（gene ontology，GO）功能富集注釋和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。

2.6 Western blotting檢測腸組織TLR9/NF-κB通路相關蛋白表達

取各組小鼠的回腸組織，剪碎，加入研磨珠和適量的裂解液，研磨10 min，1300 r/min離心15 min，取上清液，測定蛋白濃度。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF膜，封閉后，孵育相應抗體，洗滌，顯影后分析條帶灰度。

2.7 統(tǒng)計學分析

3 結果

3.1 小鼠一般情況觀察

對照組小鼠眼鼻干凈，被毛光滑，精神活潑；模型組小鼠眼角有大量白色分泌物，眼瞼下垂，蜷縮；菊苣酸各劑量組小鼠精神狀態(tài)、行走能力、眼角白色分泌物等都有所改善；地塞米松組小鼠有少數(shù)眼角白色分泌物，行動力良好。造模后48 h對照組小鼠死亡總數(shù)0只，模型組小鼠死亡總數(shù)6只，菊苣酸低劑量組小鼠死亡總數(shù)4只，菊苣酸中劑量組小鼠死亡總數(shù)3只，菊苣酸高劑量組小鼠死亡總數(shù)2只，地塞米松組小鼠死亡總數(shù)1只。

3.2 菊苣酸對腸損傷小鼠腸組織病理變化的影響

如圖1所示，與對照組比較，模型組小鼠回腸組織的腸絨毛的固有層出現(xiàn)壞死，肌層暴露，官腔中存在大量碎片細胞，說明黏膜組織損傷嚴重；與模型組比較，菊苣酸低劑量組腸絨毛的上皮層與固有層分離程度減輕，說明損傷有所減輕；菊苣酸中、高劑量組僅絨毛表層出現(xiàn)破損，表明給藥后小腸絨毛損傷均得到不同程度的改善，絨毛的完整度逐漸增加，管腔中碎片上皮細胞隨給藥劑量升高而減少。

3.3 菊苣酸對腸損傷小鼠回腸組織中炎癥因子水平的影響

如圖2所示，與對照組比較，模型組小鼠回腸組織中炎癥因子水平均顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組回腸組織中炎癥因子水平均顯著降低（＜0.05、0.01），表明菊苣酸能夠下調回腸組織中促炎因子水平。

圖1 菊苣酸對腸損傷小鼠回腸組織病理變化的影響

與對照組比較：##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，圖8同

3.4 轉錄組測序結果

本研究進行了9個樣本（對照組、模型組、菊苣酸中劑量組各3個）的測序分析，各樣本測序得到的clean reads與參考基因組的平均比對率為97.19%，樣品的20平均值為98.216%，30的平均值為94.711%，各樣本的GC堿基占比均在50%左右，說明測序數(shù)據(jù)質量良好，可用于后續(xù)分析。

3.4.1 對照組與模型組基因表達差異分析結果 如圖3所示，與對照組比較，模型組有1140個差異表達的mRNA，其中523個基因上調、617個基因下調。對篩查出的差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs）進行KEGG分析和GO分析。如圖4-A所示，富集的KEGG通路主要包括抗原處理和呈遞、造血細胞系、TNF信號通路等。GO分析顯示DEGs富集于1055個生物學過程條目、34個細胞組分條目、2151個分子功能條目，富集的主要結果見圖4-B，DEGs主要參與β干擾素應答、γ干擾素應答等生物學過程，分子功能主要條目與細胞因子的活性相關，細胞組分包含脂蛋白粒子、血漿脂蛋白顆粒等。

圖3 對照組和模型組DEGs的火山圖

圖4 對照組和模型組DEGs的KEGG通路(A) 和GO功能(B) 富集分析

3.4.2 菊苣酸組與模型組基因表達差異分析結果 如圖5所示，菊苣酸組與模型組共分析出497個差異表達的mRNA，涉及247個上調基因和250個下調基因。富集分析結果如圖6所示，KEGG分析顯示，DEGs主要與免疫途徑相關。GO分析顯示，DEGs富集了171個生物學過程條目、12個細胞組分條目、29個分子功能條目，其中重要的生物學過程包括B細胞活化、B細胞活化的調節(jié)、免疫反應的激活等，主要的細胞組分包含免疫球蛋白復合體、免疫突觸等方面，主要的分子功能與蛋白受體結合、抗原結合、轉運蛋白活性等免疫過程相關方面。

3.4.3 共表達通路富集分析結果 KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，對照組的DEGs與55條KEGG通路相關，菊苣酸組的DEGs與15條KEGG通路相關，二者有8條共同的通路被富集，經(jīng)典炎癥信號通路NF-κB信號通路是其中之一（圖7）。

圖5 菊苣酸組和模型組DEGs的火山圖

圖6 菊苣酸組和模型組DEGs的KEGG通路(A) 和GO功能(B) 富集分析

圖7 共表達KEGG通路富集分析

3.5 菊苣酸對腸損傷小鼠回腸組織中TLR9/NF-κB通路相關蛋白表達的影響

為了進一步驗證轉錄組測序數(shù)據(jù)的可操作性和菊苣酸的作用機制，通過Western blotting法檢測參與NF-κB炎癥信號通路傳導的代表性蛋白（TLR9、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65、IRF7）表達。如圖8所示，與對照組比較，模型組小鼠回腸組織中TLR9、MyD88、p-NF-κB p65/NF-κB p65、IRF7蛋白表達水平均顯著升高（＜0.01），說明CLP誘導的膿毒癥小鼠中炎癥相關蛋白表達上調；與模型組比較，菊苣酸中、高劑量組和地塞米松組MyD88、TLR9和IRF7蛋白表達水平均顯著降低（＜0.05、0.01），菊苣酸高劑量組和地塞米松組p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表達水平顯著降低（＜0.05），證實菊苣酸在膿毒癥腸損傷中具有顯著的抗炎活性。

圖8 菊苣酸對腸損傷小鼠回腸組織中TLR9/NF-κB通路相關蛋白表達的影響(, n = 3)

4 討論

膿毒癥是一種危及生命的炎癥綜合征，在全球范圍內有很高的死亡率。多年來，隨著對膿毒癥研究的不斷加深，膿毒癥的臨床定義標準也在不斷更新，免疫病理和發(fā)病機制正在逐漸明確[14]，目前的干預治療策略可以分為靶向損傷相關分子模式（danger-associated molecular patterns，DAMPs）（包括宿主細胞應激）、靶向病原相關分子模式（pathogen associated molecular patterns，PAMPs）、靶向炎癥介質（抗炎）、免疫防御調節(jié)、內皮屏障穩(wěn)定及恢復血管抗凝血屬性6類[15]。MacFie等提出了腸源性膿毒癥的概念，近年來被臨床研究者逐漸認可，并應用動物實驗模型對腸源性感染治療的有效性進行研究[16]。已根據(jù)膿毒癥的發(fā)展特征建立了多種膿毒癥動物模型，其中CLP誘導的膿毒癥模型是實驗研究過程中最常用的模型，也被認為是金標準模型[17-18]。因此，本研究采用CLP誘導的膿毒癥模型探討了菊苣酸對膿毒癥小鼠腸道損傷的保護作用及潛在機制。

膿毒癥發(fā)病的根源以及貫穿整個膿毒癥病程的主要原因是機體對抗炎癥的失衡，宿主為抵抗病原體產(chǎn)生一系列的促炎因子，從而激活先天免疫系統(tǒng)，生物學上解釋為模式識別受體識別到DAMPs或PAMPs[19]。TLR家族是一類重要的模式識別受體，在已發(fā)現(xiàn)的TLR家族蛋白中，TLR9在腸道疾病機制研究中發(fā)揮了重要作用。TLR9位于內質網(wǎng)中，具有I型跨膜蛋白結構，能夠識別細菌和病毒中非甲基化DNA基序并募集到MyD88信號分子與其結合，導致下游NF-κB和轉錄因子IRF7的激活，NF-κB負責轉錄調節(jié)產(chǎn)生炎癥因子風暴，IRF7負責介導I型IFN的產(chǎn)生[20]。

本研究結果顯示，菊苣酸顯著降低膿毒癥小鼠回腸組織中促炎因子TNF-α、IL-6和IL-1β的水平，改善CLP誘發(fā)的膿毒癥小鼠腸損傷癥狀，包括減輕中性粒細胞浸潤和腸絨毛損傷、恢復腸黏膜層，表明菊苣酸對腸黏膜屏障具有保護作用。通過轉錄組學分析，篩選到與炎癥相關的調控通路TLR9/NF-κB，此前研究也發(fā)現(xiàn)，姜黃素[21]、桃仁承氣湯[22]、炎調方[23]能夠通過TLR9/NF-κB通路發(fā)揮對膿毒癥腸損傷的保護作用。Western blotting結果顯示，模型組小鼠腸組織中TLR9/NF-κB通路關鍵蛋白表達均顯著上調，菊苣酸給藥后小鼠腸組織中關鍵蛋白表達下調，且呈劑量相關性。表明菊苣酸可能通過調節(jié)TLR9，進而調控NF-κB通路緩解膿毒癥模型小鼠的腸損傷。

綜上，本研究通過建立CLP誘導的膿毒癥小鼠模型，發(fā)現(xiàn)菊苣酸對膿毒癥腸損傷具有一定保護作用，其作用機制可能是通過抑制TLR9/NF-κB信號傳導途徑，減低腸組織的炎性反應從而改善小鼠的腸損傷。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Chicory acid improves intestinal injury in mice with sepsis by regulating TLR9/ NF-κB pathway

SHENG Shuang-shuang1, SUN Shao-xin1, FENG Shuai1, LI Feng1, WANG Huan2, LI Jian2

1. School of Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China 2. Department of Pharmacy, Affiliated Hospital of Shandong University of Chinese Medicine, Jinan 250014, China

To study the effect and mechanism of chicory acid on intestinal injury in mice with sepsis.Sixty male C57 mice were randomly divided into control group, model group, dexamethasone (5 mg/kg) group, cichoric acid high-, medium-, and low-dose (40, 20, 10 mg/kg) groups, with 10 mice in each group. The sepsis mouse model was induced by cecal ligation and perforation surgery (CLP) 3 d after ip administration to each group. After successful modeling, mice were continuously administered for 48 h, and HE staining was used to observe pathological changes in intestinal tissue; ELISA was used to detect levels of tumor crossing factor-α (TNF-α), Interleukin-6 (IL-6) and IL-1β in intestinal tissue; Intestinal tissue samples from control group, model group and cichoric acid medium-dose group were taken, and transcriptomic analysis based on Illumina sequencing platform was performed; Western blotting was used to detect expressions of Toll-like receptor 9 (TLR9), myeloid differentiation factor 88 (MyD88), nuclear factor-κB p65 (NF-κB p65), p-NF-κB p65 and interferon regulatory factor 7 (IRF7) proteins in intestinal tissue.Compared with model group, the degree of intestinal mucosal damage in each treatment group was significantly improved, and the levels of inflammatory factors in intestinal tissue were significantly reduced (< 0.05, 0.01). Transcriptomics analysis showed that compared with control group, a total of 1140 differentially expressed genes were analyzed in model group; Compared with model group, a total of 497 differentially expressed genes were analyzed in administration group, all of which were enriched in NF-κB signaling pathway. Compared with model group, expressions of TLR9, MyD88, p-NF-κB p65 and IRF7 proteins in intestinal tissue after administration of cichoric acid were significantly reduced (< 0.05, 0.01).Chicory acid may ameliorate sepsis-induced intestinal mucosal injury through TLR9/NF-κB signaling pathway.

chicory acid; sepsis; intestinal injury; inflammatory factors; transcriptomics; TLR9/NF-κB pathway

R285.5

A

0253 - 2670(2023)18 - 5952 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.18.013

2023-04-24

國家科技重大專項重大新藥創(chuàng)制項目（2017ZX09301058）；山東省自然科學基金青年項目（ZR2021QH111）；2022年全國名老中醫(yī)藥專家傳承工作室建設項目（國中醫(yī)藥人教函[2022]75號）

盛雙雙（2000—），女，碩士研究生，研究方向為中藥質量控制與活性成分研究。Tel: 17860505243 E-mail: 1348588751@qq.com

李 健，女，碩士生導師，研究方向為中藥質量控制與活性成分研究。Tel: 13708928056 E-mail: 770815488@qq.com

[責任編輯 李亞楠]