丁香和瑞香狼毒提取物對苦瓜枯萎病菌抑菌機理初探

趙艷芳，胡春艷，曹揮

（山西農業大學 植物保護學院，山西 太谷 030801）

尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）為無性態菌門絲孢綱鐮刀菌屬，由該菌引起的植物枯萎病是一種世界性土傳病害[1-2]。此類病原菌以兼性寄生為主，寄主范圍廣泛[3]，可引起瓜類、茄科、豆科等100多種植物枯萎病的發生，致作物在2～3 a內大面積感染枯萎病[4]。被其所侵染的植物通常出現多器官及組織的腐爛，如根腐、花腐及穗腐等，嚴重危害作物的產量和品質[5]。目前，植物枯萎病主要通過多菌靈等化學農藥進行防治[6]，但是長期大量使用化學農藥對環境造成了嚴重的污染[7]。因此，尋找及研發替代化學農藥的高效綠色產品成為近年來學者的研究熱點[8]，植物源農藥因其具有對生態友好、可生物降解性、作用方式多樣等特點備受人們關注[9-10]。

丁子香（Syzygium aromaticum）又稱丁香，為桃金娘科蒲桃屬植物，在我國云南、海南等地多有種植，資源豐富[11]。研究表明，丁香提取物中主要的活性成分是丁子香酚[12]，丁香酚具有廣譜抗菌性，對金葡萄球菌等食源性病原菌[13]、禾谷鐮刀菌等植物病原真菌均有抑制作用[14]。瑞香狼毒（Stellera chamaejasme）又稱西北狼毒、斷腸草等，為瑞香科狼毒屬植物，其主要分布在我國的西北、西南、東北等地區。研究表明，瑞香狼毒在抑菌、消炎、祛痰、抗病毒、殺螨蟲、抗癌等方面有良好的生物活性，其主要化學成分包括香豆素類、黃酮類、萜類等六大類化合物[15]，在殺蟲、抗病毒等方面有特殊功效[16]。研究發現，瑞香狼毒根中香豆素的含量較高，具有良好的消炎、抑菌等作用[17]。

苦瓜以其清熱解涼、滋陰壯陽、降低血糖等獨特的藥理作用[18]，深受人們喜愛。苦瓜枯萎病的發生嚴重影響了其產量與質量，目前市場上銷售的對西瓜、香蕉和甜瓜等枯萎病具有良好防治效果的農藥及微生物制劑對苦瓜枯萎病的防治效果不是很理想[19]，因此，研究一種安全有效的防治苦瓜枯萎病措施十分必要。

本試驗采用菌絲生長速率法，測定了丁香、八角、芫花、瑞香狼毒、羌活、結香等6種植物乙醇提取物對苦瓜枯萎病菌的抑菌效果，從中挑選出對苦瓜枯萎病抑制效果最好的丁香和瑞香狼毒2種植物提取物，并對其抑菌機制進行了初探，旨在為進一步開發植物源農藥提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試植物材料 丁香、瑞香狼毒、羌活、芫花、八角和結香等植物材料的信息如表1所示。

表1 供試植物材料名稱及組織Tab.1 Name and tissue of the plant materials for testing

1.1.2 供試菌種 苦瓜（尖孢鐮刀菌苦瓜專化型）枯萎病菌（Fusarium oxysporumf. sp.momordicae），由河南農業大學文才藝教授提供。

1.1.3 主要儀器 氣引式粉碎機（佑崎有限公司），旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠），光照培養箱（浙江托普儀器有限公司），紫外分光光度計（島津有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 植物提取物的制備 將丁香、瑞香狼毒等各種植物材料磨成粉狀，將其與95%乙醇體積比為1∶2混合放置72 h進行初步浸提，后在30 ℃條件下進行30 min的超聲波振蕩提取，將浸提物放入真空抽濾裝置中進行抽濾，收集到的液體即為植物的初提物，將抽濾出的固體物質再次與乙醇混合，重復以上步驟4次，提取液使用旋轉蒸發儀進行濃縮，并測定濃縮后提取液的提取率及質量濃度，每種提取物進行6次重復（表2）。

表2 供試植物提取物的提取率及質量濃度Tab.2 Extraction rate and concentration of the plant extracts for testing

1.2.2 6種植物提取物對苦瓜枯萎病菌的室內毒力測定 采用菌絲生長速率法，測定丁香、瑞香狼毒、八角等6種植物提取物對苦瓜枯萎病菌的抑菌活性，將藥劑（無菌水稀釋）與培養基混合配制成4.0、2.0、1.0、0.5、0.25、0.125 mg/mL質量濃度的藥板，以加入等體積無菌水的培養基為空白對照。每個處理重復5次。用0.7 cm的打孔器在培養6 d的目的菌株培養基上取菌餅，放在藥板中央，在28 ℃霉菌培養箱中培養，每隔24 h采用十字交叉法測定菌絲生長直徑，利用Excel軟件計算抑菌率、用SPSS 27.0軟件進行毒力分析。

1.2.3 3種植物提取物對苦瓜枯萎病菌孢子萌發的影響測定 將苦瓜枯萎病菌于PDB培養基中28 ℃恒溫、150 r/min的搖床中振蕩培養3 d，菌液用2層滅菌紗布濾去菌絲，濾液于室溫下以4 500 r/min離心20 min，去上清液，制成1.0×106個/mL的孢子懸浮液備用。將孢子懸浮液與藥劑混合至藥物終質量濃度分別為4.0、2.0、1.0、0.5、0.25、0.125 mg/mL，滴于載玻片中在28 ℃培養箱中進行保濕培養，當空白對照萌發率高于85%時記錄孢子萌發數量，并進行計算。

1.2.4 丁香、瑞香狼毒提取物對苦瓜枯萎病菌酶活性測定 在無菌操作臺中，將丁香、瑞香狼毒提取物加入PDB培養基中，其中，丁香提取物的終質量濃度為1 mg/mL，瑞香狼毒提取物的終質量濃度為2 mg/mL，每25 mL接入一個苦瓜枯萎病菌菌餅，搖床設置為180 r/min，28 ℃，分別在培養24、48、72、96 h時取樣，常溫條件下8 000 r/min離心10 min，分別收集菌絲體和菌液，放入-20 ℃冰箱中保存待測。丙二醛（MDA）、丙酮酸（PA）和幾丁質酶（CHT）使用北京Solarbio試劑盒（貨號分別為BC0020、BC2200、BC0825）進行測定，可溶性蛋白（Pr）的測定參考張志良等[20]的方法進行，測定菌體和菌液中的MDA、PA、Pr含量，測定菌體中的CHT活性。

1.3 數據分析

利用Microsoft Excel和SPSS 27.0軟件進行數據統計和差異顯著性分析，采用LSD法進行差異性顯著檢驗（P＜0.5）。

2 結果與分析

2.1 6種植物提取物對苦瓜枯萎病菌的抑制效果

6種植物提取物在4.0 mg/mL時對苦瓜枯萎病菌的抑制效果如表3所示，所有的植物提取物對苦瓜枯萎病菌都有一定的抑制效果，丁香、瑞香狼毒、八角和結香提取物在質量濃度為4.0 mg/mL時對苦瓜枯萎病菌的抑制率均達到了100%，羌活和芫花的抑制效果較差，但其抑菌率也大于50%。

表3 6種植物提取物4.0 mg/mL時對苦瓜枯萎病菌菌絲生長的抑制效果（120 h）Tab.3 Inhibition effect of 6 plant extracts at 4.0 mg/mL on the mycelial growth of Fusarium oxysporum f.sp. momordicae（120 h）

圖1為不同植物提取物在不同質量濃度下對苦瓜枯萎病菌菌落的抑制效果圖。由圖1可知，隨著植物提取物質量濃度的降低，其抑制效果也逐漸下降。丁香提取物的抑制效果最好，其質量濃度為4.0、2.0 mg/mL時，對苦瓜枯萎病菌的抑制效果均達到了100%；瑞香狼毒提取物次之，質量濃度為2.0 mg/mL時，抑菌率達到了87.02%；在質量濃度為0.125 mg/mL時，二者的抑菌率也在25%以上。八角和結香提取物在高質量濃度時抑制效果較好，但在低質量濃度時抑制效果較差，在質量濃度為0.125 mg/mL時，抑菌率均在10%以下。

2.2 6種植物提取物對苦瓜枯萎病菌的毒力

由表4可知，丁香提取物對苦瓜枯萎病菌的抑制效果最好，EC50值為0.256 5 mg/mL；瑞香狼毒提取物效果次之，其EC50值為0.354 8 mg/mL；羌活和芫花提取物的抑制效果較差，其EC50值分別為1.885 5、2.378 0 mg/mL。

2.3 3種植物提取物對苦瓜枯萎病菌分生孢子萌發的影響

由表5可知，丁香、瑞香狼毒和結香3種植物提取物處理后對苦瓜枯萎病菌分生孢子的萌發都有一定的抑制作用；在質量濃度為4.0 mg/mL時，3種植物提取物的孢子萌發抑制率均達到了80%以上，其中，瑞香狼毒提取物的抑制效果最好，丁香提取物次之。

2.4 丁香、瑞香狼毒提取物處理后苦瓜枯萎病菌中MDA含量變化

從圖2可以看出，經過2種植物提取物處理后，苦瓜枯萎病菌菌絲中的MDA含量在各個時期都顯著高于CK（P＜0.05），在24 h時，丁香和瑞香狼毒提取物處理組菌絲中的MDA含量均是CK處理組的2倍以上；MDA的含量隨著時間的增加呈現降低的趨勢；菌液中的MDA含量處理組也均高于CK組，但整體差異沒有菌絲中的明顯，在24 h時，瑞香狼毒處理組菌液中的MDA含量較CK提高了2.5倍，丁香和瑞香狼毒提取物處理后，MDA含量均顯著升高（P＜0.05），說明二者通過破壞病菌的膜脂來影響其正常生長。

圖2 不同時期不同處理苦瓜枯萎病菌中的MDA含量Fig.2 MDA contents of F. oxysporum f. sp. momordicae with different treatments at different time

2.5 丁香、瑞香狼毒提取物處理后苦瓜枯萎病菌中PA含量變化

從圖3可以看出，丁香和瑞香狼毒提取物處理后的PA含量在各個時期與CK組相比，均有顯著差異（P＜0.05）。在48 h時，對照組和處理組中菌絲和菌液的PA含量差異最為顯著，對照組的PA含量均是處理組的1.5倍以上，處理組中PA含量整體上呈現先升高后降低的趨勢，而CK組的PA含量較為穩定。丁香和瑞香狼毒提取物處理后，PA大量累積，意味著菌體內反應大部分停留在糖酵解途徑，病原菌代謝發生了紊亂。

圖3 不同時期不同處理苦瓜枯萎病菌中的丙酮酸含量Fig.3 Pyruvic acid contents of F. oxysporum f. sp. momordicae with different treatments at different time

2.6 丁香、瑞香狼毒提取物處理后苦瓜枯萎病菌中Pr含量變化

由圖4可知，經丁香和瑞香狼毒提取物處理后，菌絲中的Pr含量均顯著低于CK組，在24 h時，瑞香狼毒提取物處理后Pr含量差異最為顯著（P＜0.05），較CK組降低了72%；丁香提取物處理組在48 h時與CK組相比差異最顯著（P＜0.05），降低了59%。而處理組菌液中Pr含量均顯著高于CK組（P＜0.05），瑞香狼毒提取物處理組在處理初期與CK組差異最顯著（P＜0.05），是CK組的3倍以上；丁香提取物處理組在48 h時差異最顯著（P＜0.05），隨著時間的增長，處理組中Pr含量呈現降低的趨勢。綜上可以得出，經過植物提取物處理后，病原菌中的Pr外滲，說明二者均對病原菌的細胞膜有影響，通過破壞細胞膜的結構從而影響病原菌的生長。

圖4 不同時期不同處理苦瓜枯萎病菌中的可溶性蛋白含量Fig.4 Soluble protein contents of F. oxysporum f. sp. momordicae with different treatments at different time

2.7 丁香、瑞香狼毒提取物處理后苦瓜枯萎病菌中CHT活性變化

由圖5可知，丁香和瑞香狼毒提取物處理后的CHT活性均顯著低于CK組（P＜0.05），隨著時間的推移，丁香提取物處理后的CHT含量呈現先降低后升高的趨勢，瑞香狼毒提取物處理后的CHT含量呈現降低的趨勢。在72 h時，丁香和瑞香狼毒提取物處理后的CHT活性與CK相比差異最顯著（P＜0.05），分別較CK降低了56%、34%。丁香和瑞香狼毒提取物均可通過影響病原菌CHT的活性來破壞病原菌的細胞壁，以干擾病原菌的正常生長。

圖5 不同時期不同處理苦瓜枯萎病菌中的幾丁質酶活性Fig.5 Chitirase activity of F. oxysporum f. sp. momordicae with different treatments at different time

3 結論與討論

在過去半個多世紀，化學農藥的濫用使得自然平衡被破壞，藥劑的殘留問題也慢慢地浮出水面[21]。目前，在全球倡導“綠色農業”的形勢下，天然來源的植物源殺菌劑在實踐中發揮了重要作用。植物源農藥是由植物的天然化學成分或生長過程中產生的代謝產物加工而成，主要通過抑制呼吸代謝、破壞細胞結構、影響核酸及蛋白合成等方面達到抑菌的效果，從而達到環保、高效、低毒害、低殘留等良好的防治效果[22]。

丁香為常綠喬木，高達10 m，原產于印尼馬魯古群島，公元前3世紀作為“香藥”傳入我國。丁香的主要活性成分為丁香酚[23]，具有較強的抗真菌、防霉活性，可作為冬季水果儲藏的天然抗真菌劑[24]，許多研究表明，其對高粱葉斑病[25]、小麥根腐病[26]、三七根腐病菌[27]、番茄疫霉根腐病菌[28]、番茄灰霉病菌[29]等病原菌均有較強的抑制效果。在本試驗中，丁香對苦瓜枯萎病菌的抑制效果良好，在質量濃度為4.0、2.0 mg/mL時，抑菌率均達到了100%；在質量濃度為4.0 mg/mL時，孢子萌發抑制率達到了87.15%。葛達娥等[30]研究表明，不同濃度的丁香酚對鏈格孢霉的菌絲生長和孢子萌發都有抑制作用，并呈現一定的劑量效應。王江來[31]研究表明，丁香精油可以抑制茄腐鐮刀菌孢子萌發及菌落生長。陳吼等[32]研究發現，丁香揮發油對枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉、青霉菌均有抑制作用。魏倩倩等[33]研究發現，丁香乙醇提取物對番茄枯萎病菌有良好的抑制作用。這與本試驗的研究結果一致。

瑞香狼毒分布于東北及河北、內蒙古、甘肅、青海、寧夏、西藏等省（自治區）。其主要成分是黃酮類物質[34]，對茄子枯萎病菌[35]、番茄枯萎病菌[33]、西瓜枯萎病菌[36]、草莓灰霉病菌[37]等病原菌有較好的抑制效果。在本試驗中，瑞香狼毒對苦瓜枯萎病菌的抑制效果僅次于丁香，質量濃度為4.0 mg/mL時，抑菌率為100%，質量濃度為2.0 mg/mL，抑菌率也達到了87.02%。梁海英等[38]研究表明，瑞香狼毒對稻瘟病菌的菌絲生長和孢子萌發有較強的抑制作用。鄭瑞瑞[36]研究發現，瑞香狼毒對西瓜枯萎病菌有良好的抑制效果。陳云坤等[35]研究發現，瑞香狼毒對茄子枯萎病、黃瓜枯萎病、番茄枯萎病、辣椒枯萎病、草莓紅中柱病、黃瓜靶斑病、黃瓜炭疽病均有較強的抑制作用。這與本試驗的研究結果一致。

本試驗測定了丁香和瑞香狼毒對苦瓜枯萎病菌酶活性的影響，結果表明，二者對MDA、PA、Pr含量和CHT活性均有影響，丁香和瑞香狼毒提取物處理后，MDA、PA含量均顯著升高，菌絲中Pr含量降低，菌液中Pr含量顯著提高，CHT活性則顯著降低。黃曉芳等[39]研究表明，丁香提取物的主要成分丁香酚可以提高植物體內水楊酸含量，而適宜濃度的水楊酸可以降低花生葉片膜損傷程度[40]，酚類物質可以和細胞中的蛋白質發生化學反應，低濃度時會造成細胞變性，高濃度時蛋白質發生凝固。趙慧琳等[41]研究表明，瑞香狼毒可以顯著降低番茄植株的MDA含量，與本試驗的結果相一致。丁香、瑞香狼毒提取物處理苦瓜枯萎病菌后均可破壞病原菌的膜脂結構以及細胞壁結構，造成菌體內Pr外滲，從而影響病原菌的正常生長，同時也會對病原菌的代謝途徑造成破壞，使其停留在糖酵解途徑。但其具體抑菌機制仍需進一步探索。

本研究表明，丁香、瑞香狼毒提取物對苦瓜枯萎病菌抑制效果良好，均有潛力作為防治苦瓜枯萎病的植物源農藥，研究結果為進一步開發植物源農藥和枯萎病的防治提供了理論依據。