獼猴桃DCL、RDR和AGO基因家族的鑒定與分析

方遠(yuǎn)鵬,李云洲,趙志博,2,樊 榮,2,龍友華,2

(1.貴州大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,貴陽 550025;2.貴州大學(xué) 獼猴桃工程中心,貴陽 550025)

中國是獼猴桃(ActinidiaLindl.)的主產(chǎn)區(qū)及原產(chǎn)地,獼猴桃種質(zhì)資源豐富,但其產(chǎn)量嚴(yán)重受各種生物病害與非生物病害影響[1-2]。自2003年首例獼猴桃病毒病報(bào)道后,迄今共鑒定出3組(即特異性及非特異性獼猴桃病毒、致病性病毒)15種獼猴桃病毒及多種可能的獼猴桃病毒[3-5]。共計(jì)23種獼猴桃病毒,根據(jù)其癥狀分為4類:第1類為導(dǎo)致葉片黃萎病、花葉病、環(huán)斑病和斑點(diǎn)癥狀的病毒。第2類病毒導(dǎo)致葉片乃至整株變黃和環(huán)斑。第3類僅導(dǎo)致輕微癥狀或沒有癥狀的病毒。第4類病毒導(dǎo)致葉片壞死和環(huán)斑。另外,獼猴桃黃化病毒1(AcYV1) 和獼猴桃黃化病毒2(AcYV2) 侵染獼猴桃導(dǎo)致癥狀尚不明確[6]。其中,獼猴桃的多種病毒帶毒率逐漸上升;例如,中國陜西省獼猴桃中柑橘葉斑駁病毒(Citrusleafmottlevirus)、獼猴桃病毒A(ActinidiavirusA)和獼猴桃病毒B(ActinidiavirusB)均有廣泛地分布和較高的帶毒率,并且存在較大的分子變異[7-8]。

同時(shí),由于櫻桃卷葉病毒(Cherryleafrollvirus)、天竺葵帶狀斑點(diǎn)病毒(Pelargoniumzonatespotvirus)等具備侵染范圍大及交叉感染可能性高等原因。特別是近年來隨著病毒病,如柑橘葉斑駁病毒在獼猴桃上不斷的發(fā)現(xiàn),防治獼猴桃病毒病成為保障獼猴桃安全生產(chǎn)的重要任務(wù),但是因病毒危害癥狀與生理病害類似,且大多數(shù)病毒通過昆蟲傳毒[7],預(yù)防與控制難度大,因此,從獼猴桃自身免疫方面提高植株對(duì)病毒的抗性顯得尤為重要[9]。RNA干擾(RNA interference,RNAi)是植物抗病毒的重要機(jī)制[10]。參與RNAi機(jī)制的蛋白主要包含3類:DCL蛋白(Dicer-like,DCL)、RNA依賴型RNA聚合酶(RNA-dependent RNA Polymerase,RDR)和 AGO(Argonaute,AGO)。首先,DCL負(fù)責(zé)將病毒衍生的雙鏈RNA(double strand RNA,dsRNA)剪切加工成‘初級(jí)siRNA’;其后,RDR將‘初級(jí)siRNA’重新反轉(zhuǎn)錄重新合成dsRNA,新合成的dsRNA再次被DCL剪切加工形成更多的‘次級(jí)si RNA’;最后,AGO與siRNA形成RNA沉默復(fù)合體(RIGC),RISC通過堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式剪切降解與siRNA匹配的病毒序列[10-11]。

擬南芥(Arabidopsisthaliana)DCL2與DCL4都可以作為病毒siRNA形成的關(guān)鍵因子,參與植物抗病毒防御[12]。擬南芥DCL3、AGO1和AGO7、RDR6也具備調(diào)控RNAi清除病毒的重要作用[13]。AGO、RDR、DCL蛋白促進(jìn)甲基化的發(fā)生從而提升對(duì)多種RNA和DNA病毒(如黃瓜花葉病毒、蘿卜皺縮病毒(Turnipcrincklevirus,TCV))的抗病毒防御[12-16]。擬南芥AGO2異常會(huì)導(dǎo)致馬鈴薯X病毒(PotatovirusX,PVX)易感表型的出現(xiàn)[14]。 AGO2和 AGO3介導(dǎo)脫落酸(ABA)誘導(dǎo)產(chǎn)生竹花葉病毒(Bamboomosaicvirus,BaMV)的抗病毒防御能力增強(qiáng)[15]。水稻(Oryzasativa)RDR6可以對(duì)水稻條斑病毒(Ricestreakvirus,RSV)感染過程產(chǎn)生應(yīng)答反應(yīng),從而抑制RSV的危害[16]。馬鈴薯紡錘纖塊莖類病毒(Potatospindletuberviroid,TSTV)可受寄主DCL2和DCL3的協(xié)同作用,以減輕病情[17]。番茄(Solanumlycopersicum)RDR2、RDR3a、RDR3b、RDR6、DCL2(2a、2c、2d)、DCL3、AGO1a、AGO4b的表達(dá)均受番茄黃化曲葉病毒(Tomatoyellowleafcurlvirus,TYLCV)的誘導(dǎo)[18]。辣椒(Capsicumannuum)AGO2、AGO10b、DCL2和DCL4受黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaicvirus,CMV)、馬鈴薯病毒Y(PotatovirusY,PVY)和煙草花葉病毒(Tobaccomosaicvirus,TMV)誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)[19]。

準(zhǔn)確鑒定獼猴桃基因組中RNAi相關(guān)蛋白家族成員是研究和利用獼猴桃抗病毒相關(guān)基因的重要前提,正確判斷不同植物基因家族的變遷過程,將有助于深入理解和設(shè)計(jì)獼猴桃抗病毒育種。獼猴桃基因組國際合作組織最早在2013年完成獼猴桃(Actinidiachinensis)基因組的全基因組測(cè)序[20]。本研究通過對(duì)紅陽獼猴桃(A.chinensis)RNAi途徑主要蛋白家族進(jìn)行鑒定并分析其基本特性,旨在為獼猴桃抗病毒研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 RNAi相關(guān)蛋白家族基因的鑒定

擬南芥和番茄序列信息取至擬南芥數(shù)據(jù)庫(https://www.arabidopsis.org)和茄科數(shù)據(jù)庫(https://solgenomics.net/projects/varitome/)。采用擬南芥和番茄的所有DCL、RDR、AGO蛋白序列對(duì)獼猴桃基因組數(shù)據(jù)庫[20]進(jìn)行blastp檢索,并經(jīng)SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)[21]網(wǎng)站進(jìn)行結(jié)構(gòu)域的確認(rèn),手工合并去重。

1.2 保守性及染色體定位分析

基因結(jié)構(gòu)圖、保守基序和染色體定位圖使用GSDS2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)、MEME (RDR和AGO蛋白一起進(jìn)行基序的搜索,參數(shù)設(shè)置為基序數(shù)量30,顯著性限制為0.05;DCL蛋白單獨(dú)進(jìn)行基序的搜索,參數(shù)設(shè)置為基序數(shù)量5,顯著性限制為0.05)和TBtools[22]軟件 1.0版本進(jìn)行預(yù)測(cè)或繪制。

1.3 基因基礎(chǔ)信息的預(yù)測(cè)

使用EXPASy的Prot-Paramtool在線程序(http://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam)[23]預(yù)測(cè)蛋白等電點(diǎn)和分子質(zhì)量;蛋白亞細(xì)胞定位利用Softberry(http://www.softberry.com/)預(yù)測(cè)。采用SignalP-5.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)及TMHMM 2.0網(wǎng)站(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)進(jìn)行信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)的檢查。蛋白的二級(jí)使用NPS@(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/)。

1.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

采用MEGA 7.0分別對(duì)獼猴桃DCL、RDR、AGO蛋白家族和獼猴桃、擬南芥、番茄AGO、DCL、RDR蛋白序列分別進(jìn)行建樹分析。對(duì)齊算法采用Clustal W方法,建樹時(shí)采用bootstrap= 1 000,建樹方法采用Neighbor-Joining法。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因家族的鑒定

明確基因家族的成員的分布特點(diǎn)有助于對(duì)其演化、功能進(jìn)行初步推測(cè)。為此,筆者觀察到,這些獼猴桃RNAi相關(guān)蛋白編碼基因的分布情況呈現(xiàn)出以下特征。在第6、13和18號(hào)染色體上各分布有1個(gè)DCL基因;在第13、26和27號(hào)染色體上各分布有1個(gè)RDR基因;AGO基因在第3、9、12、13、16、17、29號(hào)染色體上各分布有1個(gè),在第23號(hào)染色體上分布有2個(gè),在第19號(hào)染色體上分布有4個(gè)。部分基因未定位在染色體上,包括AcAGO1e、AcAGO4a、AcAGO4d、AcRDR1c、AcAGO2c、AcAGO5a、AcDCL1a、AcRDR1a、AcRDR6a。其中AcAGO1d、AcAGO2a、AcAGO2b、AcAGO2d基因在較短區(qū)域內(nèi)成簇存在。

此外,大部分的基因定位區(qū)域均為基因密度較高的區(qū)域內(nèi),只有少部分處于低基因密度的區(qū)域,例如AcAGO7、AcAGO1d、AcAGO2a、AcAGO2b、AcAGO2d等基因。同時(shí)筆者檢查這些獼猴桃RNAi相關(guān)蛋白的氨基酸長度均大于550 aa,最短和最長的蛋白分子為AcAGO6和AcDCL4的575 aa和2 308 aa(表1、圖1-A)。

紅色、黃色、藍(lán)色分別為AGO、DCL、RDR基因;A.獼猴桃AGO、DCL、RDR基因的染色體定位;B.獼猴桃AGO、DCL、RDR蛋白的進(jìn)化樹;C. 獼猴桃AGO、DCL、RDR蛋白基序;D. 獼猴桃AGO、DCL、RDR蛋白基因結(jié)構(gòu)

表1 獼猴桃DCL、AGO 和RDR基因的鑒定

2.2 基因結(jié)構(gòu)及保守基序分析

如圖1-A所示,本研究鑒定的AcDCL、AcRDR和AcAGO基因家族分布于獼猴桃不同的染色體上,但是AcAGO1e、AcAGO2c、AcAGO4a、AcAGO4d、AcAGO5a,AcDCL1a和AcRDR1a、AcRDR1c、AcRDR6a在染色體上的分布還不清楚。在保守基序方面,AcDCL間的保守性相對(duì)較差,但仍具備DCL3、4、5個(gè)保守基序,獨(dú)特的是,除AcDCL2a以外均具備DCL-1基序;除AcDCL3以外均具備DCL-2基序。而在AcRDR蛋白中,均具備Motif 6、Motif17、Motif19、Motif26,這些保守基序存在于RdRP結(jié)構(gòu)域中。在AcAGO蛋白中,具備豐富的保守基序,Motif1、Motif3、Motif7、Motif9、Motif11、Motif12、Motif14、Motif17、Motif18、Motif19、Motif22、Motif24為均具備的基序,其次還具備豐富的其他基序(圖1-B、1-C)。在基因結(jié)構(gòu)方面,獼猴桃AcRDR基因內(nèi)含子數(shù)小于5,AcDCL基因均內(nèi)含子數(shù)大于5,AcAGO基因大部分為內(nèi)含子數(shù)大于5,而AcAGO2/7基因的內(nèi)含子數(shù)小于5(圖1-D)。

2.3 基于蛋白保守結(jié)構(gòu)域的鑒定與進(jìn)化樹的構(gòu)建

DCL蛋白家族可以分為明顯的4類,即DCL1、DCL2、DCL3、DCL4。其中獼猴桃AcDCL蛋白與番茄DCL(SlDCL)親緣關(guān)系最近,其次是擬南芥DCL(AtDCL);獼猴桃AcDCL與擬南芥AtDCL間均具備唯一的直系同源蛋白,但是通過圖2可以確認(rèn)DCL家族蛋白存在多個(gè)保守結(jié)構(gòu)域(圖2-A)。

橙色星形、紅色三角、藍(lán)色圓圈分別為番茄、擬南芥、獼猴桃基因;Sl.番茄,At.擬南芥,Ac.獼猴桃;擬南芥、番茄、獼猴桃DCL(A)、RDR(B)、AGO(C)蛋白的進(jìn)化樹與結(jié)構(gòu)域分布

RDR蛋白家族表現(xiàn)出明顯的4類,即RDR1、RDR2、RDR3/4/5、RDR6。獼猴桃AcRDR、番茄RDR(SlRDR)、擬南芥(AtRDR)間的親緣關(guān)系與其對(duì)應(yīng)的DCL親緣關(guān)系保持一致,首先是番茄SlRDR,其次是擬南芥AtRDR。獼猴桃AcRDR具備3個(gè)RDR1蛋白、1個(gè)RDR2、2個(gè)RDR6蛋白,但是并不具備RDR3/4/5。RDR家族表現(xiàn)出只有RdRP保守結(jié)構(gòu)域,且該結(jié)構(gòu)域長度可變,但 AcRDR1c除基礎(chǔ)的RdRP保守域外還具備一段短的RRM_1保守結(jié)構(gòu)(圖2-B)。

AGO蛋白家族可以分為4類,即AGO1/10、AGO2/3/7、AGO4/6/8/9/15、AGO5,但是區(qū)別并不明顯。親緣距離表現(xiàn)出番茄SlAGO和獼猴桃AcAGO親緣關(guān)系最近,其次是擬南芥AtAGO。獼猴桃AcAGO蛋白包括AcAGO1、AcAGO2、AcAGO4、AcAGO5、AcAGO6、AcAGO7的同源蛋白分別為5、5、4、2、1、1個(gè),而并未發(fā)現(xiàn)AcAGO3、AcAGO10、AcAGO15等的同源蛋白。所有AGO家族蛋白包含有豐富的保守結(jié)構(gòu)域,包括基本保守結(jié)構(gòu)域Piwi和PAZ,還包括ArgoL1、ArgoL2、ArgoMid、ArgoN和Gly-rich_Ago1等9個(gè)保守域(圖2-C)。

2.4 DCL、RDR和AGO家族蛋白的理化性質(zhì) 分析

2.4.1 DCL家族蛋白的理化性質(zhì)分析 DCL家族蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)均在核內(nèi),AcDCL4是具有信號(hào)肽的跨膜蛋白,其他AcDCL蛋白均不具備跨膜結(jié)構(gòu)。其蛋白理化性質(zhì)體現(xiàn)出酸堿性氨基酸的數(shù)量相似,等電點(diǎn)為5.88～7.58,脂溶系數(shù)較大在88～95,除AcDCL2a、AcDCL3外均較穩(wěn)定,均具親水性,值為-0.25～0(表2)。

表2 獼猴桃DCL蛋白基礎(chǔ)理化性質(zhì)和跨膜結(jié)構(gòu)

2.4.2 RDR家族蛋白的理化性質(zhì)分析 RDR家族蛋白亞細(xì)胞定位均為細(xì)胞外(分泌),均不具備跨膜結(jié)構(gòu)。其蛋白理化性質(zhì)表現(xiàn)為酸堿性氨基酸的數(shù)量相似,等電點(diǎn)為5.89～8.62,脂溶系數(shù)較DCL家族成員小,處于78～90,除AcRDR1a、AcRDR1b外均較穩(wěn)定,均具親水性較強(qiáng)處于 -0.35～-0.20(表3)。

表3 獼猴桃RDR蛋白基礎(chǔ)理化性質(zhì)和跨膜結(jié)構(gòu)

2.4.3 AGO家族蛋白的理化性質(zhì)分析 AGO家族蛋白亞細(xì)胞定位廣泛分布于核內(nèi)、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外(分泌),均不具備跨膜結(jié)構(gòu)。其蛋白理化性質(zhì)表現(xiàn)為堿性氨基酸數(shù)量一般大于酸性氨基酸數(shù)量,等電點(diǎn)為6.46～9.50,脂溶系數(shù)較DCL家族成員小,處于74.88～89.96,除AcRDR1a、AcRDR1b外均不穩(wěn)定,親水性均較強(qiáng)處于 -0.483～ -0.193(表4)。

表4 獼猴桃AGO蛋白基礎(chǔ)理化性質(zhì)和跨膜結(jié)構(gòu)

2.5 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

獼猴桃RNAi相關(guān)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析顯示,不同蛋白類型的二級(jí)結(jié)構(gòu)存在較大差異。在DCL中,4種DCL蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的分布差異巨大,但大體保持著38%α-螺旋、15%β-折疊、47%無規(guī)則卷曲的結(jié)構(gòu)組成,其中AcDCL4相對(duì)特殊,無規(guī)則卷曲區(qū)域更大,二級(jí)結(jié)構(gòu)由28%α-螺旋、20%β-折疊、52%無規(guī)則卷曲組成。在RDR中,6個(gè)RDR蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)也存在差異,α-螺旋區(qū)域占比為25%～34%、β-折疊區(qū)域占比為15%～21%。在AGO中,相同蛋白類的AGO蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分布較相似,另外AGO蛋白大體上具備α-螺旋、β-折疊、無規(guī)則卷曲區(qū)域占比分別為25%～30%、17%～23%、50%～58%(圖3)。

紅色、藍(lán)色分別為β-折疊、α-螺旋區(qū)域

3 討論與結(jié)論

在植物與病毒互作不斷發(fā)展的過程中,植物逐漸形成一系列抗病毒機(jī)制,其中RNAi是最重要的抗病毒機(jī)制。RNAi機(jī)制參與調(diào)控植物多種生物及非生物脅迫、生長繁殖、細(xì)胞周期、遺傳穩(wěn)定等過程[24]。RNAi相關(guān)蛋白家族不同成員的功能存在差異。擬南芥中研究發(fā)現(xiàn),DCL家族的DCL2和DCL4是RNAi抗病毒過程中的核心蛋白,而DCL1、DCL3與miRNA和siRNA的形成至關(guān)重要[12,25]。RDR2和RDR6是RNAi的信號(hào)放大最為相關(guān)[26-27]。不同植物的AGO成員的抗病毒活性不同,具備抗病毒活性的AGO蛋白主要分布于AGO1、 AGO2、AGO3、 AGO4、AGO5、AGO7、AGO10、AGO18[17,28-29]。而獼猴桃是我國重要的經(jīng)濟(jì)果樹,隨著獼猴桃病毒不斷報(bào)道,鑒定和研究獼猴桃抗病毒相關(guān)基因DCL、RDR和AGO基因家族顯得尤為重要,本研究鑒定了紅陽獼猴桃基因組上29個(gè)RNAi相關(guān)蛋白同源基因家族AcDCL、AcRDR和AcAGO,通過同源序列分析其中具潛在抗病毒活性的同源基因有23個(gè),分別是4個(gè)DCL基因(DCL1a、DCL2a、DCL3、DCL4)、3個(gè)RDR基因(RDR2、RDR6a、RDDR6b)、16個(gè)AGO基因(AGO1a-e、AGO2a-e、AGO4a-d、AGO7)。

在黃瓜(Cucumissativus)、水稻、番茄、擬南芥、棉花(Gossypiumhirsutum、G.raimondii、G.arboreum)、茄屬(Solanumtuberosum、S.commersonii、S.lycopersicum、S.pennellii)、歐洲油菜(Brassicanapus)等物種中,DCL基因均分為DCL1、DCL2、DCL3、DCL44類,同一類數(shù)量一般在1～3個(gè)[17-18,30-32]。獼猴桃DCL基因同樣具備以上特征,存在4類DCL基因,各類分別有1個(gè)與擬南芥保持一致。DCL蛋白酶通過氨基末端的解旋酶的PAZ結(jié)構(gòu)域與ds RNA結(jié)合,DCL酶其一般具備DEAD盒、RNA解旋酶結(jié)構(gòu)域、DUF283、ds RBD、RNaseⅢ和PAZ六種結(jié)構(gòu)域,其中具有內(nèi)切酶作用的催化域有兩個(gè)[12],但不同的物種蛋白存在結(jié)構(gòu)域丟失的可能。本研究中,獼猴桃結(jié)構(gòu)域大多不具備完整的6個(gè)結(jié)構(gòu)域,但均具備PAZ、Ribonuclease_3和Ribonucleas_3_3結(jié)構(gòu)域,表明這4個(gè)DCL蛋白均具備與ds RNA結(jié)合和具備內(nèi)切酶活性。

RDR酶主要存在一個(gè)RdRP結(jié)構(gòu)域,可放大抗病毒信號(hào)從而促進(jìn)抗病毒作用[15,20]。在擬南芥中發(fā)現(xiàn)6個(gè)RDR基因,隨后黃瓜、水稻、茄屬、歐洲油菜等物種中顯示RDR基因主要保留RDR1、RDR2、RDR3、RDR6四類,而RDR4/5大多缺失。而獼猴桃RDR基因包含RDR1、RDR2、RDR6三類共6個(gè),這同大部分物種相似,呈現(xiàn)與番茄相似的同源性[17-18,30,32],但其丟失AtRDR3/4/5的同源基因。

AGO與siRNA結(jié)合形成RNA沉默復(fù)合體(RISC)靶向降解病毒序列[20]。AGO基因家族是一個(gè)典型的多拷貝家族,直系同源和旁系同源關(guān)系復(fù)雜。AGO基因主要包括AGO1、AGO2、AGO2、AGO3、AGO4、AGO5、AGO6、AGO7、AGO8、AGO9、AGO10、AGO15,在不同的物種內(nèi)AGO基因的保留和擴(kuò)張也有所差異。獼猴桃具備AGO基因18個(gè),較大部分物種更多,但與玉米、水稻相似[33-34]。同時(shí)其在AGO1、AGO2、AGO4上大量形成同源蛋白,但缺乏AGO3、AGO10、AGO15等的同源蛋白,這種情況在多種物種中也有出現(xiàn),但丟失的同源蛋白不同[17-18,34]。 同時(shí)獼猴桃AGO基因在AGO1、AGO2、AGO4中大量拷貝,而 AGO1、AGO2蛋白是植物已知的核心抗病毒組分[35],在某些物種中AGO4、AGO7也被發(fā)現(xiàn)抗病毒活性,這些基因的大量擴(kuò)張可能是獼猴桃在受病毒大量危害后產(chǎn)生的獨(dú)特進(jìn)化[28,35]。

自從2013年紅陽獼猴桃基因組測(cè)序宣告完成[18],對(duì)獼猴桃病害防控研究走向分子生物學(xué)時(shí)代。為辨明獼猴桃基因組中豐富的抗病毒相關(guān)基因資源,本研究鑒定了紅陽獼猴桃RNAi途徑相關(guān)基因家族(DCL、RDR、AGO)并通過生物信息學(xué)進(jìn)行分析。這些基礎(chǔ)研究對(duì)于后續(xù)抗病品種選育以及轉(zhuǎn)基因獲得高抗品種、抗病種質(zhì)資源的篩選、病毒的預(yù)測(cè)與綜合防控有著重大意義,同時(shí)為基因編輯技術(shù)改良獼猴桃品種特性提供重要參考。關(guān)于獼猴桃RNAi相關(guān)蛋白的逆境表達(dá)特征、組分功能協(xié)調(diào)、進(jìn)化途經(jīng)等均有待進(jìn)一步研究。